本發明屬于高通量測序，具體涉及一種富集全長trna的雙鏈接頭及其在trna測序中的應用。

背景技術：

1、trna在連接mrna轉錄與蛋白質翻譯的起到重要的“橋梁”作用。trna具有復雜的二級和三級結構，其主要功能是攜帶氨基酸，通過自身的反密碼子與mrna上的密碼子配對，參與蛋白質翻譯。trna上有多種修飾位點，占已發現的143種rna修飾的78％，平均每個trna分子中大約有11.9％的核苷酸具有修飾(doi:10.1016/j.tcb.2023.04.002)，如圖1所示，這些修飾有助于維持trna的結構、調節細胞內trna豐度。此外，trna修飾可以改變其堿基對的擺動，影響密碼子的識別，還可以影響核糖體的占用、暫停、翻譯過程的移碼突變及延伸步驟來調節翻譯速度和效率(doi:10.1016/j.jgg.2022.10.002)。trna上的修飾對蛋白翻譯的調控作用如圖2所示。

2、trna由多拷貝基因編碼，這些基因編碼的trna分子序列高度相似。因此，準確的全長trna定量方法對研究其表達動態至關重要。早期通過熒光標記對trna進行定量的方法難以區分高度相似的trna分子或檢測修飾信息。隨著高通量測序技術的發展，二代測序平臺(如illumina)能夠生成大量trna數據，但在文庫構建時，反轉錄過程易受trna豐富修飾影響，導致錯配或提前終止。雖然通過去除甲基化修飾和優化反轉錄酶能提升全長trna捕獲效率，但仍無法保留修飾信息，且pcr擴增帶來的偏好性影響了對trna表達動態的精確研究(doi:10.1016/j.tig.2023.11.001)。

3、牛津納米孔公司開發的納米孔直接rna測序是目前唯一可以直接對rna進行測序的方法，可同時獲得rna分子的序列及修飾信息且不需要進行pcr擴增。其原理是通過恒定電壓驅動rna單鏈通過納米級別的蛋白質孔，產生電流變化。不同堿基或修飾基團產生不同電流信號，借此識別堿基序列及修飾位點。目前納米孔直接rna測序多用于mrna表達及修飾的研究，2021年首次發表將納米孔直接rna測序同時應用于trna定量和修飾的研究，但只用于檢測某幾種特定的trna分子，數據產量低(doi:10.1021/acsnano.1c06488)；2024年應用于酵母trna表達動態研究的nano-trnaseq及數據分析方法被開發出來，但其數據產量仍較低，數據分析流程不完善(doi：10.1038/s41587-023-01743-6)。目前缺乏穩定可靠的納米孔直接trna測序方法及完善數據分析方法。上述兩種直接trna測序文庫構建方法如圖3所示。

4、納米孔直接rna測序可以直接對rna進行測序且無需pcr擴增，消除了pcr偏好性的影響，同時可保留rna上的修飾信息。2021年的文獻(doi:10.1021/acsnano.1c06488)和“nano-trnaseq”的文庫構建方法都是同時在trna兩端加上3’和5’接頭，通過逆轉錄打開trna的二級結構，連接納米孔測序專用接頭后對trna分子直接測序，兩種技術都存在一定的缺陷和不足：

5、(1)2021年的文獻(doi:10.1021/acsnano.1c06488)只對大腸桿菌中幾種特定的trna分子測序，其所用的3’接頭及5’接頭長度較短，在測序初期易導致trna分子的測序電流信號不穩定。并且最終數據產量低，成本高，無法進行深入分析。

6、(2)“nano-trnaseq”對酵母中的trna進行了納米孔直接測序，其所用的直接rna測序芯片為低版本的rna002，數據產量低，測序準確性還需提升。

7、兩種方法的文庫構建效果均不夠成熟穩定，所用測序芯片版本較低，數據產量低，且測序準確度不夠高。目前牛津納米孔公司的直接rna測序芯片已升級為rna004，該芯片的數據產量更高且測序準確度也有較大提升；兩種方法的文庫構建過程都不能進行多個樣本混合測序，測序成本非常高。

技術實現思路

1、為了解決上述技術問題，本發明提供以下技術方案：

2、本發明公開了一種富集全長trna的雙鏈接頭，所述雙鏈接頭包含3’接頭和5’接頭，其中3’接頭和5’接頭堿基互補配對；

3、所述3’接頭的核苷酸序列如seq?id?no.1-4中至少一種以上：

4、gauggaaucguggcuucuucuugcucuuaggaaaaaaaaaaaaa(seq?id?no.1)；

5、gauaucagcuaggcuucuucuugcucuuaggaaaaaaaaaaaaa(seq?id?no.2)；

6、gaucuggcauaggcuucuucuugcucuuaggaaaaaaaaaaaaa(seq?id?no.3)；

7、gauagaucuagggcuucuucuugcucuuaggaaaaaaaaaaaaa(seq?id?no.4)；

8、所述5’接頭的核苷酸序列如seq?id?no.5-8所示：

9、ccuaagagcaagaagaagccacgauuccaucuggn(seq?id?no.5)；

10、ccuaagagcaagaagaagccuagcugauaucuggn(seq?id?no.6)；

11、ccuaagagcaagaagaagccuaugccagaucuggn(seq?id?no.7)；

12、ccuaagagcaagaagaagcccuagaucuaucuggn(seq?id?no.8)；n為隨機堿基a、t、g、c和u中的一種。

13、一種本發明公開了雙鏈接頭在trna測序中的應用。

14、本發明還公開了一種通過雙鏈接頭富集全長trna進行trna測序的方法，所述方法包含以下步驟：

15、(1)總rna提取、氧化、純化與β消除；

16、(2)在步驟(1)的基礎上分離trna；

17、(3)對步驟(2)中得到的trna去3’磷酸；

18、(4)在步驟(3)中去3’磷酸的trna連接權利要求1或2所述的雙鏈接頭后分離trna；

19、(5)反轉錄：將步驟(4)中得到的分離trna進行反轉錄后進行產物純化；

20、(6)測序接頭連接后進行產物純化，最后進行測序。

21、優選地，在步驟(4)中雙鏈接頭的連接方法為：

22、(1)將溶解后的trna與雙鏈接頭混勻后，按順序加入以下試劑：

23、1.5ul?10x?annealing?buffer

24、1ul?superasein

25、總體積為15ul，90℃變性2min，以0.1℃/sec的速度降至25℃；

26、(2)反應結束后的產物立即放冰上，按順序加入以下試劑：

27、2ul?200mm?mgcl2

28、2.5ul?rnaligase?2

29、5ul?rnaligase?2reaction?buffer

30、15ul?50％peg8000

31、0.5ul?ultra?pure?water?0.5ul

32、總體積為50ul，設置pcr儀程序：25℃2h→16℃16h→4℃保溫。

33、優選地，在步驟(4)中trna、3’接頭和5’接頭按1.2:1:1的摩爾比混合。

34、優選地，在步驟(5)中反轉錄的方法為：

35、(1)8.5ul超純水的rna、3ul?nebnext?quick?ligation?reaction?buffer

36、1ul?rnase?out、1ul?1.4um?rt?adapter(rta)和1.5ul?t4?dna?ligase混勻后25℃孵育10min；

37、(2)在步驟(1)的體系中加入13ul?ultra?pure?water、3ul?dntps(10mm?each)、8ul?5x?induro?rt?reaction?buffer和2ul?induro?reverse?transcriptase；總體積40ul，混勻后60℃30min，70℃10min，4℃保溫。

38、本發明的有益效果：

39、1.利用雙鏈接頭中5’接頭尾部的“nggu-”序列，可富集全長trna進行測序；同時在接頭的5’端添加1個隨機堿基，降低接頭連接過程對某種trna分子偏好性。

40、2.利用一步法連接雙鏈接頭，減少實驗操作中的樣品損耗；18h連接雙鏈接頭，可提升連接效率。

41、3.利用雙鏈接頭所帶barcode對不同樣本進行區分，可以實現混樣測序，減少起始投入量，大大降低測序成本，提高數據產量，能夠更好地對trna的表達動態進行深入分析。