本發明屬于生物工程，尤其是涉及樹干畢赤酵母(scheffersomycesstipitis)羰基還原酶sscr改造后的突變體，編碼所述羰基還原酶突變體的基因，含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，以及利用這些羰基還原酶突變體或重組表達轉化體作為催化劑在立體選擇性合成芳香族多取代手性γ-丁內酯中的應用，還提供了一種立體選擇性合成芳香族多取代γ-丁內酯的方法。

背景技術：

1、香精香料是一類具有令人愉悅氣味的物質，在食品、日化、化學和制藥等領域被廣泛使用。最初，人們從植物中分離提取天然香料，由于濃度低、季節變化和植物疾病等因素，天然香料成本高，市場價格十分昂貴(food&bioprocess?technology,2018,11:2217-2228)。19世紀50年代，科學家開始采用化學方法來合成此類化合物，于是人工香精香料的市場價格迅速下降。美國和歐盟法規(cfr?1990和eec?1334/2008)對天然香料做出定義：天然香料分子只能通過物理過程(從自然資源中提取)獲得，或使用酶、微生物來制備，涉及到的前體應從自然界獲得。

2、手性γ-內酯是一類重要的結構單元和合成砌塊，廣泛存在于超過15000種天然產物中，并在工業上具有重要的應用價值。例如，手性γ-內酯是一類重要的香料分子，廣泛用于食用香料、增香劑以及日用化學產品中。數據顯示，全球香料香精市場的銷售額從2006年的180億美元增長到2017年的263億美元。2017-2022年全球香料香精市場規模持續增長，2022年達到約390億歐元，是近六年來的最高值，比2021年增長了4％(j.agric.foodchem.2024,72(33),18305-18320)。近年來，中國的香精香料行業也得到了迅猛發展，2018年行業銷售額突破400億元，2023年市場規模已達到439億元，預計到2026年有望超過500億元。

3、手性內酯是廣為人知的天然風味和香味化合物，存在于多種天然產品中，如芒果(food?chemistry.2013,136(2):585-594.2)、桃子(food?chemistry.2009,116(1):356-364.)和乳制品(journal?of?dairy?science.2012,95(3):1128-1139.)。手性內酯的功能與其化學結構密切相關。研究表明，γ-癸內酯具有桃子和草莓的香氣，而δ-癸內酯則有椰奶的香味(trends?in?biotechnology.2005,23(4):193-198.)。內酯的側鏈種類、官能團的位置以及碳鏈長度都會影響其風味特性。例如，γ-辛內酯具有奶香味，而γ-十一內酯則有強烈的桃子和杏仁香氣(j.agric.food?chem.1989,37:413-418.)。內酯化合物的立體構型也會影響香氣的純度和強度。天然內酯主要是(r)-對映體，其氣味比(s)-對映體更強，是果香味的主要來源(j.agric.food?chem.1989,37(2):413-418.)。化學法生產的內酯通常對映選擇性較差，光學純度較低，因此香氣品質和強度較弱，消費者接受度也較低。例如，化學合成的γ-癸內酯在香氣強度上明顯不如天然提取的γ-癸內酯。因此，作為食品添加劑，單一構型的內酯化合物需求量更大，具有較高的附加值，深受市場歡迎。

4、手性內酯化合物具有非常重要的生物學功能和藥物活性。這些化合物廣泛存在于自然界，并在眾多生物過程中發揮關鍵作用。大約10％的天然產物含有內酯環結構[]，包括生物堿、信息素、抗生素和抗腫瘤試劑等，手性內酯化合物是多種生物活性分子的核心組成部分(tetrahedron.2021,84,132001–13039.)。在藥物化學領域，手性內酯被視為一種特殊結構，因為它具備多種藥理特性，如抗真菌、抗生素、抗腫瘤、抗炎和細胞毒活性(angewandte?chemie.2014,53(16):4164-4167.)。這些特性使得手性內酯在開發新藥和治療各種疾病方面具有廣泛的應用潛力。許多天然手性內酯類化合物，如紅霉素，展現出抗菌和抗真菌活性，能夠抑制病原微生物的生長。此外，某些手性內酯，如紫杉醇，具有抗癌特性，通過干擾細胞分裂來阻止癌細胞增殖。同時，這些化合物還具備抗炎作用，例如銀杏內酯，能夠減輕炎癥和氧化損傷。此外，手性內酯在植物和微生物中可作為信息素，參與細胞間信號傳導，影響植物生長發育或細菌的群體感應。因此，手性內酯化合物的結構和手性特點使其在多種生物系統中發揮著重要作用。

5、手性多取代γ-丁內酯是制藥和食品工業中許多天然產品和高附加值化學品的核心結構單元。目前，手性多取代γ-丁內酯的合成仍以化學法為主。在多個基團取代的五元雜環上精確構建多個手性中心面臨著巨大挑戰，尤其是大體積芳香族取代的手性γ-丁內酯，面臨著立體選擇性低、金屬催化劑昂貴、反應條件苛刻和原子經濟性低等問題。

技術實現思路

1、針對現有技術中化學合成手性多取代γ-丁內酯面臨的立體選擇性低、金屬催化劑昂貴、反應條件苛刻和原子經濟性低等問題，本發明提供一種羰基還原酶突變體及其在立體選擇性合成芳香族多取代手性γ-丁內酯中的應用，即通過羰基還原酶突變體對手性γ-酮酯的潛手性碳進行不對稱還原，最后通過分子內環化得到多取代手性γ-丁內酯。

2、更具體地，本發明對多取代手性內酯合成中所需的羰基還原酶sscr進行分子改造，進而提供了羰基還原酶突變體，編碼所述羰基還原酶突變體的基因，含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，及羰基還原酶突變體在合成手性芳香族多取代γ-丁內酯中的應用。

3、本發明提供的羰基還原酶突變體具有高立體選擇性和高活力，能拓展底物譜范圍。

4、本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

5、本發明的技術方案之一：

6、本發明提供一種羰基還原酶sscr突變體，所述羰基還原酶突變體是如seq?idno.2所示氨基酸序列經過取代、缺失或添加幾個氨基酸且能夠催化芳香族α-/β-不飽和酮酯不對稱還原的由羰基還原酶sscr衍生，同時催化活性高于羰基還原酶sscr的蛋白質，其中，羰基還原酶sscr的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

7、在本發明的一個實施方式中，所述羰基還原酶sscr突變體是氨基酸序列如下的蛋白質中的一種：

8、(1)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第126位纈氨酸替換為丙氨酸；

9、(2)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第126位纈氨酸替換為丙氨酸，第215位甲硫氨酸替換為甘氨酸；

10、(3)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第126位纈氨酸替換為丙氨酸，第210位天冬酰胺替換為組氨酸；

11、(4)將如seq?id?no.2所示氨基酸序列的第126位纈氨酸替換為丙氨酸，第215位甲硫氨酸替換為甘氨酸，第210位天冬酰胺替換為組氨酸。

12、其中，羰基還原酶sscr(pdb：5gmo)氨基酸序列如seq?id?no.2所示。羰基還原酶sscr是已知的，來自樹干畢赤酵母(scheffersomyces?stipitis)。本技術以其為母本進行了分子改造，篩選到催化性能、穩定性提高以及底物抑制效應解除的突變體。

13、本發明還提供所述羰基還原酶突變體的獲得方法：即通過基因挖掘以及實驗室保藏微生物菌株的大規模篩選，發現來自樹干畢赤酵母(scheffersomyces?stipitis)的羰基還原酶sscr(pdb：5gmo)的基因，通過人工合成的方式，直接連接在pet-28a表達載體上，并且直接轉化到大腸桿菌ecoli.bl?21(de3)中，通過誘導表達和純化，從而獲得能催化α-/β-飽和酮酯不對稱還原的一種羰基還原酶，其是nadph依賴型的。所述羰基還原酶sscr的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

14、本發明中通過人工合成基因的方式，直接連接在pet-28a表達載體上，并且直接轉化到大腸桿菌ecoli.bl?21(de3)中，進行誘導表達和純化。

15、本發明提供的羰基還原酶突變體具有以下性能：能夠催化α-/β-飽和酮酯不對稱還原，立體選擇性合成多取代手性γ-丁內酯。

16、本發明還提供一種半理性設計構建羰基還原酶突變體庫的方法。可在proteindata?bank輸入蛋白質id(5gmo)下載sscr的晶體結構，然后用該蛋白質模型與(r)-3-甲基-4-氧代辛酸乙酯(r)-2t進行分子對接，根據短鏈脫氫酶的催化機理與結合能情況，選擇合適的對接模型。通過對底物口袋附近的氨基酸進行定點飽和突變，進一步提高酶的活性。如seq?id?no.2所示氨基酸序列的sscr立體空間結構中，在底物(r)-2t結合位點周圍的氨基酸殘基包括：y13,l14,p83,v84,f86,t123,s124,v126,v127,f164,n191,d192,v193,y194,i195,f196,n210,l210,s212,m215，i236以及v241等。采用半理性設計，將這些位點的氨基酸分別進行定點飽和突變。使用的引物如表1所示：

17、表1sscr突變氨基酸位點的引物

18、

19、

20、本發明的技術方案之二：

21、本發明提供一種分離的核酸，所述的核酸是編碼如技術方案一所述羰基還原酶突變體的核酸分子。

22、其中，編碼羰基還原酶sscr的核酸的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，全長1005個核苷酸堿基。其編碼序列(cds)從第1個堿基起至第1005個堿基止，起始密碼子為atg，無終止密碼子，上下游組氨酸標簽融合表達。該基因編碼的蛋白質即為羰基還原酶sscr，氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

23、本發明還提供所述核酸的來源：通過人工全序列合成的方法得到所述核酸。

24、本發明的技術方案之三：

25、本發明提供包含所述編碼羰基還原酶突變體的核酸的重組表達載體。

26、本發明所述重組表達載體可通過本領域常規方法將所述羰基還原酶突變體的核酸連接于各種表達載體上構建而成，所述表達載體包括本領域常規的各種質粒載體，優選質粒pet-28a。可在人工基因合成過程中將所述羰基還原酶突變體的基因連在pet-28a載體上，從而獲得對應的重組表達載體。

27、本發明的技術方案之四：

28、本發明提供一種包含所述編碼羰基還原酶突變體的核酸或所述羰基還原酶重組表達載體的重組表達轉化體。

29、本發明所述重組表達轉化體可通過將技術方案三所述的重組表達載體轉化至宿主細胞中制得。所述宿主細胞為本領域常規的宿主細胞，只要能滿足重組表達載體可穩定地自行復制，并且其所攜帶的酶的基因可被有效表達即可。所述宿主細胞優選為大腸桿菌，更優選為大腸桿菌e.coli?bl21(de3)或大腸桿菌e.coli?dh5α。本方案優選將所述重組表達載體轉化至大腸桿菌e.coli?bl21(de3)中，獲得本發明優選的基因工程菌株(e.colibl21(de3)/pet28a-sscr)。

30、本發明得技術方案之五：

31、本發明提供一種羰基還原酶突變體催化劑，所述的酶催化劑是如下任一形式：

32、(1)培養如技術方案四所述的重組表達轉化體，分離含有所述羰基還原酶突變體的轉化體細胞；

33、(2)培養如技術方案四所述的重組表達轉化體，分離含有所述羰基還原酶突變體的轉化體細胞，對含有所述羰基還原酶突變體的轉化體細胞進行破碎，獲得的細胞破碎液；

34、(3)將所述羰基還原酶突變體的細胞破碎液經冷凍干燥而得到的凍干酶粉；

35、(4)所述羰基還原酶突變體的純酶。

36、本發明還提供所述酶催化劑的制備方法，較佳地為：培養如技術方案四所述的重組表達轉化體，分離獲得重組表達的一種羰基還原酶突變體。其中所述重組表達轉化體培養所用的培養基為本領域任何可使轉化體生長并產生本發明的重組羰基還原酶的培養基。所述培養基優選為lb培養基，其配方為：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl?10g/l，ph?7.0。培養方法和培養條件沒有特殊的限制，可以根據宿主細胞類型和培養方法等因素的不同，按本領域常規知識進行適當的選擇，只要使轉化體能夠生長并生產所述的一種羰基還原酶突變體即可。重組表達轉化體培養的具體操作可按本領域常規操作進行。優選地，將本發明所述的幾種重組大腸桿菌分別接種至含卡那霉素的lb培養基中，37℃培養，當培養液的光密度od600達到0.5～1.0(優選od600為0.6)時，加入終濃度為0.1～1.0mmol/l(優選0.5mmol/l)的異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)進行產酶誘導，在16℃繼續培養24h，即可高效表達本發明所述的一種羰基還原酶突變體。培養結束后，離心收集沉淀的菌體細胞，即為重組表達轉化體的靜息細胞；將收獲的細胞懸浮于pbs緩沖液(100mm，ph?7.0)中，超聲破碎，破碎液離心，收集上清液，即可獲得所述重組羰基還原酶sscr及其突變體的粗酶液；將離心收獲的細胞沉淀冷凍干燥，可以獲得凍干細胞，有利于長期存放，方便以后使用。

37、酶的活性測定：將含2mmol/lα-/β-不飽和酮酯和0.1mmol/l?nadph的1ml反應體系(100mmol/l磷酸鈉緩沖液，ph?6.5)預熱至30℃，然后加入適量的對應的純酶，混合均勻，30℃保溫反應，在分光光度計上檢測340nm處nadph的吸光度變化，記錄一定時間內吸光度的變化值。

38、根據下式計算得到酶活力：

39、酶活力(u)＝ew×v×103/(6220×l)

40、式中，ew為1min內340nm處吸光度的變化；v為反應液的體積，單位為ml；6220為nadph的摩爾消光系數，單位為l/(mol·cm)；l為光程距離，單位為cm。1個酶活力單位(u)對應于上述條件下每分鐘氧化1μmol?nadph所需的酶量。

41、本發明的技術方案之六：

42、本發明提供一種羰基還原酶突變體和羰基還原酶突變體催化劑在不對稱還原α-/β-飽和γ-酮酯合成手性γ-丁內酯中的應用。

43、所述α-/β-飽和γ-酮酯2的化學結構如下所示：

44、

45、所述不對稱還原α-/β-飽和γ-酮酯合成手性γ-丁內酯，可按下述優選方法進行：在ph?6.5的磷酸鹽緩沖液中，在葡萄糖脫氫酶(2g/l)、葡萄糖(1.5equiv)和nadp+(0～1.0mmol/l)的存在下，在所述羰基還原酶突變體和羰基還原酶突變體催化劑(10g/l凍干酶粉)的作用下，催化所述α-/β-飽和γ-酮酯中間體的不對稱還原反應。

46、與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

47、(1)本發明創新性地構建了一條立體選擇性合成手性芳香族多取代γ-丁內酯的工藝路線。

48、(2)本發明提供的羰基還原酶sscr-v126a/n210h/m215g是在現有酶的基礎上的突變體，能高效用于本發明所述的催化體系，從而高效合成多種多取代手性γ-丁內酯。

49、(3)本發明所述的內酯化合物，可作為香料產品或天然產物的中間體，在香料市場和天然產物合成中具有廣泛的應用價值。

50、(4)本發明反應條件溫和，轉化率高，催化活力高，產品光學純度好，原子經濟性高，ee值和dr值可高于99％，具有很好的工業應用前景。