本發明涉及一種淀粉酶高產菌株的構建方法，屬于發酵工程。

背景技術：

1、地衣芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性菌，具有耐熱、酶系豐富、產酶量高、生長速率適中、蛋白折疊、全基因組信息公開等優點，與大腸桿菌工程菌相比具有耐熱性高、ph的耐受性較低生物量高等優勢，不僅廣泛的被用于外源基因的表達宿主，而且在發酵工業上具有巨大的潛力。地衣芽孢桿菌在工業中被長期應用于耐高溫α-淀粉酶的生產，菌種對發酵原料中復雜碳源的充分利用是影響生產效率的重要因素。地衣芽孢桿菌可以利用木糖，但是木糖的利用會受到葡萄糖抑制。木糖作為一種優質碳源，可以通過木質纖維素水解而得到，隨著目前環境與能源的壓力，木質纖維素等可再生的碳越來越受到人們的青睞。由于木質纖維素在水解過程中產生大量木糖的同時會同樣產生大量的葡萄糖，而碳分解代謝阻遏效應的存在葡萄糖會抑制木糖的利用，為了消除葡萄糖存在而產生的碳分解代謝阻遏，許多解除或者降低碳分解代謝阻遏的嘗試已經在其他的微生物中進行。其主要嘗試主要分為兩類：一是通過人為構建代謝途徑的方式增加木糖的利用。二是通過對細菌本身的代謝途徑進行干預，來構建碳分解代謝阻遏降低的工程菌。但是通過敲除碳分解代謝調控蛋白(catabolite?control?proteina)ccpa蛋白的方式來抑制碳分解代謝阻遏，降低葡萄糖對木糖利用的抑制，增加木糖的利用效率時，菌體生長會受到明顯的抑制，其他的代謝途徑也受到明顯的影響。因此通過基因敲除ccpa蛋白構建的工程菌未能投入商業化生產。亟需一種能夠同時利用木糖和葡萄糖，并且菌體生長不受抑制、適用于工業化生產的基因工程菌及構建方法。

技術實現思路

1、鑒于上述情況，本發明從地衣芽孢桿菌出發，克隆得到碳分解代謝調控蛋白ccpa蛋白的基因組序列，將其編碼負責dna結合結構域的氨基酸進行定點突變，并在大腸桿菌中進行異源表達與純化。在體外進行測定ccpa蛋白與調控位點cre位點的結合能力，初步篩選出與cre位點結合能力有明顯差距的ccpa突變體蛋白。將該突變體蛋白在地衣芽孢桿菌ccpa缺陷株中進行表達，驗證該突變體在葡萄糖存在下對木糖利用的影響。

2、本發明目的之一在于提供一種地衣芽孢桿菌中的ccpa突變體。

3、在一種實施方式中，所述突變體是在如seq?id?no.1所示氨基酸序列的基礎上，進行以下任一種突變：

4、(1)將第96位亮氨酸突變為丙氨酸；

5、(2)將第23位纈氨酸突變為丙氨酸；

6、(2)將第23位纈氨酸突變為丙氨酸，以及將第96位亮氨酸突變為丙氨酸；

7、本發明目的之二在于提供編碼所述ccpa突變體的基因。

8、本發明目的之三在于構建一種表達突變體ccpa蛋白的重組表達載體以及能夠成功表達突變體蛋白的重組菌株。

9、本發明目的之四在于構建一種重組地衣芽孢桿菌，敲除ccpa基因，并表達所述突變體。

10、在一種實施方式中，游離表達權利要求1所述突變體，表達載體包括但不限于pet28a。

11、本發明所述的蛋白可以由人為操作產生。這些操作方法通常為本專業領域所常用的手段。例如通過一個或多個氨基酸的定點替換等。

12、所述的重組表達ccpa突變體的表達載體包括啟動子、突變的ccpa蛋白基因、四環素抗性基因。突變的ccpa蛋白基因位于啟動子下游。

13、所述的重組表達載體首先在大腸桿菌中通過化學轉化法轉化，之后提取質粒，將重組質粒通過電穿孔法轉化至地衣芽孢桿菌中。

14、本發明所構建的表達ccpa突變體蛋白的地衣芽孢桿菌重組菌可以在木糖與葡萄糖混合碳源的培養基中生長。且重組菌在葡萄糖存在的情況下對木糖的偏好性增強。

15、本發明目的之五在于提供一種使地衣芽孢桿菌同時利用木糖和葡萄糖的方法，敲除ccpa基因，并表達所述突變體。

16、在一種實施方式中，敲除的ccpa基因核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

17、本發明目的之六在于提供一種提高地衣芽孢桿菌中耐高溫α-淀粉酶產量的方法，敲除ccpa基因，并表達所述突變體。

18、本發明目的之七在于提供一種提高復雜碳源原料的利用效率的方法，將所述重組地衣芽孢桿菌添加至含有復雜碳源原料的體系中進行發酵，所述復雜碳源原料中含有葡萄糖和木糖。

19、本發明目的之八在于提供所述突變體或所述重組菌或所述重組地衣芽孢桿菌在抑制葡萄糖對木糖的分解代謝阻遏中的應用。

20、本發明目的之九在于提供所述重組菌或所述重組地衣芽孢桿菌在發酵生產耐高溫α-淀粉酶中的應用。

21、有益效果：

22、本發明提供一種ccpa蛋白突變體，與野生型相比，突變體val23alaleu96ala與cre位點的結合能力顯著降低，顯示出緩解碳分解代謝阻遏的潛力。

23、本發明構建的表達ccpa蛋白突變體的重組地衣芽孢桿菌，可以同步利用葡萄糖和木糖，有效提高了對粗原料中復雜碳源的利用效率，提升了菌種的生長與產酶水平，發酵72h后，細胞量較對照提高了1.2-1.4倍，發酵液上清中耐高溫α-淀粉酶的活力較對照提高了1.3-1.6倍。

技術特征：

1.一種全局性調控因子ccpa突變體，其特征在于，所述突變體是在如seq?id?no.1所示氨基酸序列的基礎上，進行以下任一種突變：

2.編碼權利要求1所述突變體的基因。

3.表達權利要求1所述突變體或攜帶權利要求2所述基因的重組菌。

4.一種重組地衣芽孢桿菌，其特征在于，敲除ccpa基因，并表達權利要求1所述突變體。

5.如權利要求4所述重組地衣芽孢桿菌，其特征在于，游離表達權利要求1所述突變體，表達載體包括但不限于phy300。

6.一種使地衣芽孢桿菌同時利用木糖和葡萄糖的方法，其特征在于，敲除ccpa基因，并表達權利要求1所述突變體。

7.一種提高地衣芽孢桿菌中耐高溫α-淀粉酶產量的方法，其特征在于，敲除ccpa基因，并表達權利要求1所述突變體。

8.一種提高復雜碳源原料的利用效率的方法，其特征在于，將權利要求4或5所述重組地衣芽孢桿菌添加至含有復雜碳源原料的體系中進行發酵；所述復雜碳源原料中含有葡萄糖和木糖。

9.權利要求1所述突變體或權利要求3所述重組菌或權利要求4或5所述重組地衣芽孢桿菌在抑制葡萄糖對木糖的分解代謝阻遏中的應用。

10.權利要求3所述重組菌或權利要求4或5所述重組地衣芽孢桿菌在生產耐高溫α-淀粉酶中的應用。

技術總結
本發明公開了一種淀粉酶高產菌株的構建方法，屬于發酵工程技術領域。本發明構建的兩種表達不同CcpA蛋白突變體的重組地衣芽孢桿菌，可以同步利用葡萄糖和木糖，有效提高了對粗原料中復雜碳源的利用效率，提升了菌種的生長與產酶水平，發酵72h后，細胞量較對照提高了1.45倍，發酵液上清中耐高溫α?淀粉酶的活力較對照提高了1.72倍。

技術研發人員：李由然,石貴陽,郭鴻飛
受保護的技術使用者：江蘇博揚生物制品有限公司
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28