本發明屬于類器官制備，涉及腺樣體類器官及其培養基與培養方法。

背景技術：

1、腺樣體(adenoids，又稱咽腺樣體(pharyngeal?tonsils)、增殖體)為一群淋巴組織，位于咽穹后部，附著于鼻咽的頂壁和后壁交界處，兩側咽隱窩之間，相當于蝶骨體和枕骨底部。其構造類似腭腺樣體，但淺層呈皺襞樣，也有陷窩，然而分支較少。它表面被覆一層上皮，此上皮隨年齡變化而有不同。腺樣體是位于上呼吸道入口的咽淋巴內環的組成部分，含有大量淋巴濾泡和彌散的免疫細胞，構成了消化道和呼吸道免疫屏障的第一道防線。反復的細菌或病毒感染等刺激因素會導致扁桃體腺樣體病理性淋巴組織增生，稱為扁桃體腺樣體肥大，是兒童阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive?sleep?apnea，osa)最常見的病因。若不及時診療，會引起一系列嚴重的并發癥，如分泌性中耳炎、鼻-鼻竇炎、頜面發育異常(腺樣體面容)、生長發育落后、神經認知損傷等。

2、腺樣體的免疫學發生機制仍不明確，既往研究提示扁桃體腺樣體區域病原微生物和宿主黏膜免疫系統之間相互作用，引起局部免疫的失調。近年來許多研究發現扁桃體腺樣體組織淋巴細胞組成和功能的變化在其中發揮重要作用。然而，目前尚沒有適合復制人類扁桃體腺樣體的體外模型用于該病理研究，且由于不能使用實驗動物模型，所以扁桃體腺樣體的病理生理機制研究困難重重。

技術實現思路

1、基于以上，本發明的目的在于提供腺樣體類器官及其培養基與培養方法，經培養得到的腺樣體類器官，經鑒定包含b淋巴細胞、t淋巴細胞和巨噬細胞，不包含上皮細胞，能夠真實反映腺樣體的免疫細胞組成。

2、本發明為實現技術目的采用的技術方案為：

3、本發明提供了腺樣體類器官的培養基，包括rpmi1640培養基，所述rpmi1640培養基中添加有10％?fbs、1×非必需氨基酸、1×青霉素-鏈霉素、1×丙酮酸鈉、50ng/ml兩性霉素b、20ug/ml慶大霉素、1×胰島素-硒-轉鐵蛋白復合物以及0.5～1μg/ml重組人b細胞活化因子baff。

4、本發明還提供了腺樣體類器官的培養方法，包括：采用細胞培養小室的氣液交互法或直接在96孔板中培養，小室中培養基為在rpmi1640培養基中添加10％?fbs、1×非必需氨基酸、1×青霉素-鏈霉素、1×丙酮酸鈉、50ng/ml兩性霉素b，20ug/ml慶大霉素以及1×胰島素-硒-轉鐵蛋白復合物，小室下由完全培養基添加0.5～1ug/ml重組人b細胞活化因子baff。

5、優選地，直接在96孔板中培養時，按最終體積200ul，1.5×106活細胞/孔，在96孔超低附著板中鋪板。

6、優選地，采用細胞培養小室的氣液交互法培養時，按每孔100ul細胞懸液種板到可滲透膜中。

7、更優選地，可滲透膜采用0.4μm孔徑。

8、更優選地，將24孔尺寸的聚四氟乙烯或聚碳酸酯膜置于標準12孔板；或帶有單孔接收盤的96孔聚碳酸酯膜板。

9、優選地，按照以下方法獲得用于培養的腺樣體細胞：將新鮮離體的腺樣體組織浸泡在含有normocin、青霉素和鏈霉素的ham’s?f12培養基中，在4℃下浸泡1小時后沖洗，在生物安全柜中將組織置于小培養皿中，加入hank’s液，剪碎，然后在100μm細胞篩上將組織碾碎成單細胞。

10、本發明又提供了通過上述培養方法培養得到的腺樣體類器官，所述腺樣體類器官同時包含b淋巴細胞、t淋巴細胞和巨噬細胞，不包含上皮細胞。

11、本發明的有益效果在于：

12、通過本發明的培養基和培養方法可以成功培養出來源于免疫細胞的腺樣體類器官，所培養的類器官同時包含b淋巴細胞、t淋巴細胞和巨噬細胞，而不包含上皮細胞，并且各種免疫細胞可以成功維持2周，可以真實地模擬腺樣體的免疫環境，是進行腺樣體及相關疾病體外研究的絕佳模型。

技術特征：

1.腺樣體類器官的培養基，包括rpmi1640培養基，所述rpmi1640培養基中添加有10％fbs、1×非必需氨基酸、1×青霉素-鏈霉素、1×丙酮酸鈉、50ng/ml兩性霉素b、20ug/ml慶大霉素、1×胰島素-硒-轉鐵蛋白復合物以及0.5～1μg/ml重組人b細胞活化因子baff。

2.腺樣體類器官的培養方法，包括：采用細胞培養小室的氣液交互法或直接在96孔板中培養，小室中培養基為在rpmi1640培養基中添加10％fbs、1×非必需氨基酸、1×青霉素-鏈霉素、1×丙酮酸鈉、50ng/ml兩性霉素b，20ug/ml慶大霉素以及1×胰島素-硒-轉鐵蛋白復合物，小室下由完全培養基添加0.5～1ug/ml重組人b細胞活化因子baff。

3.根據權利要求2所述的培養方法，其特征在于，直接在96孔板中培養時，按最終體積200ul，1.5×106活細胞/孔，在96孔超低附著板中鋪板。

4.根據權利要求2所述的培養方法，其特征在于，采用細胞培養小室的氣液交互法培養時，按每孔100ul細胞懸液種板到可滲透膜中。

5.根據權利要求4所述的培養方法，其特征在于，可滲透膜采用0.4μm孔徑。

6.根據權利要求4所述的培養方法，其特征在于，將24孔尺寸的聚四氟乙烯或聚碳酸酯膜置于標準12孔板；或帶有單孔接收盤的96孔聚碳酸酯膜板。

7.根據權利要求2所述的培養方法，其特征在于，按照以下方法獲得用于培養的腺樣體細胞：將新鮮離體的腺樣體組織浸泡在含有normocin、青霉素和鏈霉素的ham’s?f12培養基中，在4℃下浸泡1小時后沖洗，在生物安全柜中將組織置于小培養皿中，加入hank’s液，剪碎，然后在100μm細胞篩上將組織碾碎成單細胞。

8.權利要求2～7任意一項所述的培養方法培養得到的腺樣體類器官，所述腺樣體類器官同時包含b淋巴細胞、t淋巴細胞和巨噬細胞，不包含上皮細胞。

技術總結
本發明提供了腺樣體類器官及其培養基與培養方法，腺樣體類器官的培養基包括RPMI1640培養基，所述RPMI1640培養基中添加有10％FBS、1×非必需氨基酸、1×青霉素?鏈霉素、1×丙酮酸鈉、50ng/ml兩性霉素B、20ug/ml慶大霉素、1×胰島素?硒?轉鐵蛋白復合物以及0.5～1μg/ml重組人B細胞活化因子BAFF。本發明可以成功培養出來源于免疫細胞的腺樣體類器官，所培養的類器官同時包含B淋巴細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞，而不包含上皮細胞，并且各種免疫細胞可以成功維持2周，可以真實地模擬腺樣體組織的免疫環境，是進行腺樣體及相關疾病體外研究的絕佳模型。

技術研發人員：丁仁博,趙萌,趙文文,鄭成龍,王曉鳳,徐欣
受保護的技術使用者：海南大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24