本發明涉及生物，具體地說，涉及一種含sumo標簽的融合蛋白及其制備方法與應用。

背景技術：

1、隨著抗生素的長期大量使用，細菌等病原體對抗生素的耐藥性不斷增加，導致傳統抗生素治療效果下降，甚至出現無藥可用的情況，嚴重威脅人類健康。因此需要找尋其他替代方案來抵抗病原體。

2、抗菌肽是一類廣泛存在于自然界生物體中的小分子多肽，通常由12-50個氨基酸殘基組成。它們是生物體內先天免疫系統的重要組成部分，具有廣譜抗菌活性，能夠對抗細菌、真菌、病毒、寄生蟲等多種病原體。且由于其獨特的抗菌機制，病原體不易對其產生耐藥性，因此被認為是解決抗生素耐藥性問題的有力候選。

3、抗菌肽的制備方法主要有以下幾種：1.?直接提取法：直接從生物體中提取抗菌肽，這種方法簡單但產量低，適合實驗室研究。2.?酶解法：通過酶解蛋白質來獲得抗菌肽。這種方法利用特定的酶將蛋白質分解成小肽段，但需要復雜的分離和篩選過程，不利于大規格工業化純品的生產。3.?化學合成法：主要方法包括液相合成（lpps）和固相合成（spps）。液相合成（lpps）是在溶液中直接進行氨基酸連接的多肽合成方法。固相合成技術（spps）是通過在固相支持物上反復添加氨基酸，從c-末端到n-末端合成肽鏈。但化學合成方法需要精確控制操作過程，且成本較高。4.?重組dna技術：利用基因工程技術在微生物（如大腸桿菌、酵母菌）中表達抗菌肽。這種方法較適于大規模生產抗菌肽。

4、在重組dna技術中，抗菌肽的表達面臨一個關鍵問題：其自身抗菌活性可能會對宿主細胞造成傷害。當宿主細胞表達抗菌肽時，可能會觸發細胞的自我保護機制，導致表達效率下降或細胞受損，甚至影響抗菌肽的產量和活性，進而增加生產成本。

5、為解決這一問題，通常采用融合標簽與抗菌肽共表達的策略。然而，若融合標簽選擇不當，可能會出現抗菌肽表達不足或在后續處理中失去活性的情況。因此，如何精準選擇合適的融合標簽，確保抗菌肽在宿主細胞中高效、安全地表達，同時通過優化酶切、裂解和復性步驟，最終獲得高純度且活性良好的抗菌肽，仍是當前研究的重要方向。

技術實現思路

1、本發明的目的之一在于提供一種既能在宿主細胞內高效表達，又可在表達、復性后，仍具備抑菌活性的融合蛋白。

2、本發明提供了一種融合蛋白，其包括：sumo標簽和抗菌肽；所述抗菌肽可抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，所述抗菌肽的氨基酸序列如seq?id?no.10、seq?id?no.6、seq?idno.8、seq?id?no.12、seq?id?no.15或seq?id?no.17所示。

3、在基因重組工程中，sumo（small?ubiquitin-related?modifier）標簽是一種融合標簽。它是一種小的蛋白質標簽，來源于?sumo?蛋白家族。sumo?蛋白在真核生物細胞中天然存在，并且在許多細胞過程中發揮重要作用，如蛋白質的定位、穩定性和功能調節等。但并非所有的抗菌肽都可使用該標簽來成功實現表達。

4、本發明通過大量實驗發現，只有將特定的融合標簽和抗菌肽進行組合時，才能在保證融合蛋白有效表達的同時，保留抗菌肽復性后的抗菌性。而針對不同的抗菌肽/融合標簽，采用何種具體的組合方式才能實現預期結果并沒有普適性的規律可循，需經過發明人的大量實驗摸索才有望獲得組合效果好的融合蛋白。

5、本發明的融合蛋白即是通過大量摸索實驗后獲得的，具體地，本發明以特定的融合標簽與抗菌肽進行組合，成功實現了融合蛋白的可溶性表達。這種融合蛋白不具有原有抗菌肽的抗菌活性，避免了對宿主細胞造成傷害，且經過純化裂解后釋放出的單獨的抗菌肽，仍具有良好的抑菌效果，從而可實現本發明特定抗菌肽在原核表達系統中的大量制備。

6、本發明的融合蛋白中，所述sumo標簽的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

7、本發明的抗菌肽都可以和sumo形成可溶性共表達。

8、本發明的融合蛋白中，所述sumo標簽和抗菌肽之間還包括ulp1蛋白酶酶切位點。

9、本發明的融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.23、seq?id?no.19、seq?id?no.21、seq?id?no.25、seq?id?no.27或seq?id?no.29所示。

10、本發明還提供編碼上述融合蛋白的核酸。

11、本發明的核酸的序列如seq?id?no.24，seq?id?no.20，seq?id?no.22，seq?idno.26，seq?id?no.28或seq?id?no.30所示。

12、本發明還提供含有上述核酸的生物材料，所述生物材料為表達盒、載體或宿主細胞。

13、本發明還提供上述融合蛋白，或核酸，或生物材料在制備抗菌肽中的應用。

14、本發明還提供一種制備抗菌肽的方法，其包括使大腸桿菌表達上述融合蛋白的步驟。

15、本發明的方法包括：

16、（1）將上述核酸插入表達載體中獲得表達質粒；

17、（2）將所述表達質粒轉化到大腸桿菌中；

18、（3）將轉化有所述表達質粒的大腸桿菌進行擴大培養和誘導表達；

19、所述誘導表達中，所述誘導表達的溫度為16℃-37℃，優選為32℃；

20、以終濃度為0.25mm?-2.0mm的iptg進行誘導表達，優選以終濃度為0.75mm-1.0mm的iptg進行誘導表達；

21、所述誘導表達的時間1-6h，優選為5-6h。

22、以本發明優選的誘導表達條件，可獲得更佳的表達量。

23、本發明的有益效果至少在于：

24、本發明的融合蛋白可抑制抗菌肽對大腸桿菌的抑菌效果，避免對宿主細胞造成傷害，從而可通過原核表達系統實現高效表達，且融合蛋白表達后又可通過酶切成功實現抗菌肽的復性，恢復抗菌肽對大腸桿菌的抑制活性，從而可實現抗菌肽的高效制備。

技術特征：

1.一種融合蛋白，其特征在于，包括：sumo標簽和抗菌肽；所述抗菌肽可抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，所述抗菌肽的氨基酸序列如seq?id?no.10、seq?id?no.6、seq?idno.8、seq?id?no.12、seq?id?no.15或seq?id?no.17所示。

2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述sumo標簽的氨基酸序列如seq?idno.1所示。

3.根據權利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述sumo標簽和抗菌肽之間還包括ulp1蛋白酶酶切位點。

4.根據權利要求1-3任一項所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.23、seq?id?no.19、seq?id?no.21、seq?id?no.25、seq?id?no.27或seq?idno.29所示。

5.編碼權利要求1-4任一項所述的融合蛋白的核酸。

6.根據權利要求5所述的核酸，其特征在于，序列如seq?id?no.24，seq?id?no.20，seqid?no.22，seq?id?no.26，seq?id?no.28或seq?id?no.30所示。

7.含有權利要求5或6所述的核酸的生物材料，所述生物材料為表達盒、載體或宿主細胞。

8.權利要求1-4任一項所述的融合蛋白，或權利要求5或6所述的核酸，或權利要求7所述的生物材料在制備抗菌肽中的應用。

9.一種制備抗菌肽的方法，其特征在于，包括使大腸桿菌表達權利要求1-4任一項所述的融合蛋白的步驟。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，包括：

技術總結
本發明涉及生物技術領域，具體公開了一種含SUMO標簽的融合蛋白及其制備方法與應用。本發明的融合蛋白，包括：SUMO標簽和抗菌肽；所述抗菌肽可抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ?ID?No.10、SEQ?ID?No.6、SEQ?ID?No.8、SEQ?ID?No.12、SEQ?ID?No.15或SEQ?ID?No.17所示。本發明的融合蛋白可通過原核表達系統實現高效表達，且在酶切純化后可成功實現抗菌肽的復性，恢復其抑菌活性，從而實現抗菌肽的高效制備。

技術研發人員：楊霞
受保護的技術使用者：楊霞
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24