本發明涉及生物檢測領域，具體的，本發明涉及一種基于酶促解鎖檢測技術(sherlock)檢測幽門螺桿菌23srrna基因耐藥突變的方法及其應用。

背景技術：

1、幽門螺桿菌(helicobacter?pylori，hp)感染及其相關疾病是重大的衛生健康問題，有效的hp感染根除治療能夠顯著降低和預防相關疾病的發生和發展，節約大量的醫療資源，減少由此所導致的沉重疾病負擔和嚴重不良后果。因此，如何持久、高效地根除hp感染具有非常重要的臨床和研究意義。

2、個體化治療策略和方法能夠從根本上解決經驗性治療本身固有的缺陷(必然誘發耐藥菌越來越多，根除療效越來越差)，在獲得滿意持久療效的同時，有效地減少抗生素不合理使用，有利于克服目前hp菌株相關抗生素耐藥率普遍明顯升高的嚴峻形勢。

3、目前國內外還沒有一個被臨床廣泛應用的hp感染個體化診治技術方法。選取便捷的糞便樣本，配合不依賴設備和場地、簡便快速、高靈敏度的新型檢測技術將有利于徹底改變hp感染的診治模式，具有很好的研究意義。

4、hp菌株對克拉霉素(大環內酯類抗生素)耐藥分子機制：克拉霉素的殺菌機制主要是藥物穿透進入菌體細胞內，與核糖體緊密結合，作用于23s?rrna?v區的多肽轉移環，抑制多肽轉移酶，影響核糖體的移位過程，阻止肽鏈延長，抑制細菌蛋白質的合成，從而達到殺菌的效果。關于hp菌株對克拉霉素的耐藥機制，比較一致的觀點是hp?23srrna基因點突變導致克拉霉素與核糖體結合力下降，突變位點包括a2142g、a2142c、a2143g等。

5、目前，檢測幽門螺桿菌23srrna基因耐藥突變的方法圍繞著兩個維度：

6、第一：基于黏膜樣本開展的檢測方法，幽門螺桿菌大多定植于胃黏膜表面。因此，對于試劑的靈敏度要求比較低且因為胃部是酸性環境，微生物菌群豐度較低，干擾少，試劑開發的難度較小。但是，以胃黏膜為樣本就意味著要依賴胃鏡取樣，這樣給患者帶來了沉重的醫療負擔和不便；

7、第二：基于q-pcr的方法，這類方法針對23srrna基因或23srrna基因耐藥突變位點設計特定的擴增引物，設計相應探針，利用報告基團的熒光信號，q-pcr儀進行檢測；第二：基于飛行時間質譜方法學、二代測序，這一類的方法通量大、前處理復雜、檢測時間長，但是通量高，從檢測成本和時間經濟性角度出發，不適于單一23srrna基因的檢測。

技術實現思路

1、為了克服現有技術的障礙，本發明提供一種檢測幽門螺桿菌23srrna基因耐藥突變的方法及其應用。并具體提供如下技術方案：

2、本發明的第一個方面，提供一種用于檢測幽門螺桿菌23srrna基因耐藥突變的sherlock引物組，所述引物組包括重組酶聚合酶擴增(rpa)引物和探針，其序列分別如seqid?no.12、20、23、4、5、32所示。

3、本發明的第二個方面，提供上述引物組在制備檢測幽門螺桿菌23srrna基因耐藥突變的產品中的應用。

4、在一種實施方式中，所述產品包括試紙條、試劑盒、基因芯片等。優選的，所述試紙條為膠體金試紙條。

5、在一種實施方式中，所述應用包括利用所述產品檢測受試者生物樣本中幽門螺桿菌23srrna基因是否耐藥突變，所述生物樣本選自胃黏膜或糞便。

6、在一種實施方式中，所述試紙條的使用方式為：利用sherlock金標檢測法對生物樣本中的幽門螺桿菌23srrna耐藥基因位點進行檢測，隨后將反應液滴入針對不同突變位點的檢測試紙條，如試紙條c條帶顯色，t條帶不顯色證明檢測為陽性，c條帶不顯色證明實驗失敗，t條帶顯色，c條帶顯色表明檢測為陽性。

7、在一種實施方式中，所述生物樣本選自口腔黏膜或糞便。

8、本發明的第三個方面，提供一種非診斷目的的檢測幽門螺桿菌23srrna基因耐藥突變的方法，所述方法包括利用sherlock技術，使用上述引物組對生物樣本進行檢測。

9、在一種實施方式中，所述sherlock的反應為：

10、rpa條件如下：

11、

12、

13、cas13a-crrna反應條件如下：

14、

15、在一種實施方式中，所述生物樣本選自口腔黏膜或糞便。

16、相對于現有技術，本發明具有如下顯著的進步：

17、1.目前大部分幽門螺桿菌耐藥基因檢測產品都是基于胃粘膜取樣，然而胃粘膜取樣受到了胃鏡的限制，增加了醫療資源的浪費也限制了幽門螺桿菌個體化用藥的應用場景和推廣；然而糞便取樣需要檢測方法上提高幽門螺桿菌耐藥基因檢測的靈敏度和特異性并克服腸道中幽門螺桿菌耐藥基因的片段化，本發明基于sherlock方法學的幽門螺桿菌耐藥基因的檢測能夠很好的解決靈敏度和特異性的問題：

18、 sherlock方法學 檢測靈敏度 1copy/ul 檢測特異性 1100copies/ul突變比例0.1％ 對糞便樣本的檢出率 90％

19、2.目前市面上產品基于q-pcr方法學或是基于質譜檢測都要基于定量pcr儀或者質譜，pcr儀的價格8-20萬不等而質譜的價格一般在100萬左右；sherlock檢測不需要設備，可以最大程度上節省檢測成本；3.目前q-pcr在檢測后往往需要對結果進行判讀，不熟悉分子檢測的人員很難操作，質譜的檢測對于產品的前處理和操作人員對分子診斷的掌握更加嚴格，不適于廣泛推廣，sherlock檢測與常規的金標試紙檢測類似，只需要將pcr反應液加入到加樣口處，幾分鐘后即可判讀，操作非常簡便，容易掌握，實現了操作的簡便性。

技術特征：

1.一種用于檢測幽門螺桿菌23srrna基因耐藥突變的sherlock引物組，其特征在于，所述引物組包括重組酶聚合酶擴增引物和探針，其序列分別如seq?id?no.12、20、23、4、5、32所示。

2.如權利要求1的引物組在制備檢測幽門螺桿菌23srrna基因耐藥突變的產品中的應用。

3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述產品包括試紙條、試劑盒、基因芯片。

4.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述應用包括利用所述產品檢測受試者生物樣本中幽門螺桿菌23srrna基因是否耐藥突變，所述生物樣本選自胃黏膜或糞便。

5.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述試紙條為膠體金試紙條。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述試紙條的使用方式為：利用sherlock金標檢測法對生物樣本中的幽門螺桿菌23srrna耐藥基因位點進行檢測，隨后將反應液滴入針對不同突變位點的檢測試紙條，如試紙條c條帶顯色，t條帶不顯色證明檢測為陽性，c條帶不顯色證明實驗失敗，t條帶顯色，c條帶顯色表明檢測為陰性。

7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述生物樣本選自口腔黏膜或糞便。

8.一種非診斷目的的檢測幽門螺桿菌23srrna基因耐藥突變的方法，其特征在于，所述方法包括利用sherlock技術，使用如權利要求1所述的引物組對生物樣本進行檢測。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述sherlock的反應為：

10.如權利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述生物樣本選自胃黏膜或糞便。

技術總結
本發明涉及生物檢測領域，具體的，本發明涉及一種檢測幽門螺桿菌23SrRNA基因耐藥突變的方法及其應用。本發明提供一種用于檢測幽門螺桿菌23SrRNA基因耐藥突變的SHERLOCK引物組，該引物組對于不同的幽門螺桿菌23SrRNA基因耐藥突變具有良好的區分能力。此外本發明還針對SHERLOCK反應體系進行了條件的篩選和優化，并提供一種可用于檢測幽門螺桿菌23SrRNA基因耐藥突變的試紙條。具有良好的應用前景。

技術研發人員：索寶軍,宋志強
受保護的技術使用者：北京大學第三醫院（北京大學第三臨床醫學院）
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28