本發明涉及生物醫藥技術及分子診斷，尤其涉及一種基于單端測序的多重pcr擴增建庫方法及其應用。

背景技術：

1、腫瘤是目前危害人類健康的主要疾病之一，其復雜性和多樣性給現代醫學帶來了巨大的挑戰。隨著現代醫學和分子生物學的進步，腫瘤的個體化治療已經成為腫瘤治療的重要方向。腫瘤常伴有多種基因突變，這些突變不僅決定了腫瘤的發生發展，也影響患者對某些藥物的敏感性，因此準確檢測并識別這些基因突變對制定合理的治療方案至關重要。

2、目前，腫瘤靶向治療和高通量測序（ngs）技術已成為腫瘤精準醫療領域的重要組成部分。其中，腫瘤靶向治療是通過特異性抑制腫瘤細胞的關鍵信號通路而實現的，其代表性分子標志物如egfr、her2、kras、braf、alk、ros1、met等，這些基因的突變或擴增在多種癌癥類型中具有重要的臨床意義。例如，egfr突變是非小細胞肺癌（nsclc）患者選擇egfr抑制劑藥物的重要依據；her2基因擴增則是乳腺癌患者接受曲妥珠單抗治療的指征；alk基因重排（融合）的nsclc患者可從克唑替尼治療中獲益；?ros1重排的nsclc患者可從克唑替尼治療中獲益；met基因14?號外顯子跳躍突變的nsclc?患者可以從谷美替尼和特泊替尼治療中獲益；攜帶braf基因v600e突變患者可從braf抑制劑與mek抑制劑的聯合治療中獲益等。

3、高通量測序（ngs）技術可以同時分析數百到數千個基因位點，在研究和臨床上廣泛用于全面了解腫瘤基因組的復雜性。這種技術以其高通量、高靈敏度和高特異性的特點，已成為基因突變檢測的主流手段。然而，在實際應用過程中，現有ngs試劑盒在多重pcr擴增和文庫構建過程中仍然面臨一些問題：（1）擴增特異性差：多重pcr反應容易產生非特異性擴增產物，這會增加假陽性結果的風險。（2）擴增偏好性強：不同目標片段之間可能存在擴增效率差異，導致某些低頻突變無法被有效檢測到。（3）文庫構建復雜：ngs文庫構建步驟繁瑣，涉及多次純化和酶切處理，操作時間長且容易引入誤差。（4）ngs測序時間長,使得醫生無法及時獲得基因檢測結果，難以根據患者的基因特征進行個體化治療方案調整，影響臨床決策和治療方案調整。

4、因此，開發一種新型、高效、快速的ngs檢測試劑盒及相應的多重pcr擴增建庫方法，以提高擴增特異性和均勻性，簡化文庫構建過程，顯得尤為迫切和必要。這不僅能夠提高檢測的準確性和可靠性，還能更好地服務于腫瘤個體化治療需求，推動精準醫學的發展。

技術實現思路

1、本發明的目的在于提供一種基于單端測序的多重pcr擴增建庫方法及其應用，該擴增建庫方法檢測的靈敏度和特異性高，可檢測與腫瘤靶向治療相關的基因突變，檢測流程快速，最快可在16小時內完成核酸提取、建庫及測序，用于癌癥診斷、復發監測和用藥指導。

2、為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

3、本發明提供了一種基于單端測序的多重pcr擴增建庫方法，包括如下步驟：

4、（1）從樣本中提取dna樣本和/或rna樣本；

5、（2）使用引物池對步驟（1）的dna樣本或rna樣本逆轉錄得到的cdna樣本進行多重pcr擴增和磁珠純化；

6、（3）對步驟（2）的產物中的非特異性擴增產物進行消化及純化；

7、（4）使用index引物對步驟（3）的產物進行二次pcr標記及純化，獲得針對腫瘤靶向藥的ngs文庫；

8、（5）對步驟（4）構建的ngs文庫進行單端高通量測序，對測序數據進行生物學分析。

9、優選的，在步驟（2）中，所述引物池包括用于檢測原癌基因和抑癌基因的snv/indel、cnv、fusion、msi突變中任意一種或多種的特異性引物對。

10、優選的，在步驟（2）中，所述引物池包括用于檢測akt1、alk、araf、braf、cd274、ctnnb1、ddr2、dpyd、egfr、erbb2、esr1、fbxw7、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、gnas、hras、idh1、idh2、kit、kras、map2k1、met、nras、ntrk1、ntrk3、pdgfra、pik3ca、pold1、pole、pten、ret、ros1、smad4、tert、tp53、ugt1a1中任意一種或多種基因或msi的引物組成的dna引物池或用于檢測alk、braf、cldn18、egfr、fgfr1、fgfr2、fgfr3、fgfr4、met、nrg1、ntrk1、ntrk2、ntrk3、ret、ros1中任意一種或多種基因的引物組成的rna引物池；

11、所述dna引物池用于檢測snv/indel、cnv、msi突變中任意一種或多種的基因突變類型，所述rna引物池用于檢測fusion基因突變類型；

12、所述引物池中引物的結構包括用于建立ngs文庫的搭橋序列和特異性擴增序列。

13、優選的，所述dna引物池中特異性擴增序列包括seq?id?no.1~seq?id?no.354所示序列中的一種或多種；所述rna引物池中特異性擴增序列包括seq?id?no.355~seq?idno.410所示序列中的一種或多種：所述用于建立ngs文庫的搭橋序列如seq?id?no.414、seqid?no.415所示。

14、優選的，seq?id?no.1~seq?id?no.410所示任意一種特異擴增序列可分別與seqid?no.414、seq?id?no.415所示搭橋序列連接，用于檢測原癌基因和抑癌基因的snv/indel、cnv、fusion、msi突變中任意一種或多種。

15、優選的，在步驟（4）中，所述index引物序列如下：

16、seq?id?no.411：

17、caagcagaagacggcatacgagannnnnnnncgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc，其中nnnnnnnn為8個不同的堿基序列，用于識別不同樣本的標簽序列；

18、seq?id?no.412：

19、aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatc。

20、優選的，在步驟（5）中，所述生物學分析的步驟包括：將測序數據進行質量控制并比對到參考基因組，然后使用變異檢測軟件鑒定與腫瘤靶向藥相關的基因突變及其頻率。

21、本發明還提供了一種基于單端測序的多重pcr擴增建庫方法在篩選腫瘤靶向藥、癌癥診斷或復發監測上的應用。

22、本發明還提供了一種可用于實施所述基于單端測序的多重pcr擴增建庫方法的ngs檢測裝置或試劑盒。

23、本發明還提供了一種可用于實施基于單端測序的多重pcr擴增建庫方法的ngs檢測裝置或試劑盒在篩選腫瘤靶向藥、癌癥診斷或復發監測上的應用。

24、本發明與現有技術相比的有益效果為：

25、本發明提供了一種基于單端測序的多重pcr擴增建庫方法，包括：dna或rna的提取與處理、第一輪pcr反應及純化、消化反應及純化、第二輪pcr反應及純化來構建文庫并進行檢測。上述方法通過優化引物設計、改進擴增體系和精簡文庫構建流程，顯著提升了檢測過程的靈敏度和特異性，并簡化了操作步驟，可用于檢測與腫瘤靶向治療相關的基因突變，包括單核苷酸變異（single?nucleotide?variants,?snvs）、插入缺失（insertions?anddeletions,?indels）、基因融合（fusions）、拷貝數變異（copy?number?variants）以及微衛星不穩定性（microsatellite?instability,?msi），根據檢測結果進行癌癥的診斷、復發監測和用藥指導，為科研和臨床應用提供了有力的工具支持。

26、（2）本發明基于單端測序的多重pcr擴增建庫方法檢測的準確性和特異性達到了100%，并且snv/indel的最低檢測限為1%，cnv最低檢測限為4拷貝，fusion最低檢測限為100拷貝，msi最低檢測限為10%，可精準檢測腫瘤相關突變，適用于臨床大規模檢測和科研應用，有望在腫瘤個體化治療中發揮重要作用。

27、（3）本發明基于單端測序的多重pcr擴增建庫方法可在單端的測序模式下，從引物的上下游同時測序，達到雙端測序的效果，且測序時間縮短至雙端的1/2，最快可在16小時內完成核酸提取、建庫及測序，用于癌癥診斷、復發監測和用藥指導。