本發明涉及生物，尤其是涉及一種利用熒光pcr毛細管電泳技術檢測豬親緣關系及個體識別的檢測試劑盒及其應用。

背景技術：

1、分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是dna水平遺傳多態性直接的反映，可廣泛應用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關系鑒別、基因庫構建、基因克隆等研究領域。微衛星標記，又稱簡單重復序列(str)，均勻分布于真核生物基因組中，由1-6個核苷酸的串聯重復片段構成。由于str重復基序和重復次數的不同使其在個體間呈高度變異性，且數量豐富，被廣泛應用于遺傳雜交育種、繪制染色體遺傳圖譜等領域。與其他的分子標記(rflp、vntr、rapd、aflp、snp等)相比，str標記具有多態性信息含量高、共顯性遺傳、技術簡單、重復性好和特異性強等特點。

2、隨著分子遺傳學、分子生物技術、數量遺傳學和計算機技術的飛速發展，畜禽育種理論和技術方法也在不斷改進。在現代育種中，特別是伴隨著人工授精技術以及在畜禽遺傳評定中動物模型的應用。要用到各種親屬信息的表型值，準確的系譜記錄顯得尤為重要。

3、然而，在凍精生產、授精、飼養管理及性能測定時，存在系譜記錄錯誤使某些個體的血緣關系無法準確確認，以致于不能準確進行個體遺傳評定，嚴重影響育種工作的開展。國內許多學者估計了系譜記錄的錯誤率大概為8%～20%，其所造成的損失與選擇所獲得的進展相關，它還影響遺傳圖譜構建和qtl定位的準確性。因此，對豬進行有效的親子鑒定，提高其遺傳評估的準確性，顯得尤為必要。

4、有鑒于此，特提出本發明。

技術實現思路

1、本發明的目的之一在于提供一種用于檢測豬親緣關系和/或個體識別的引物組合物，以至少解決現有技術中存在的技術問題之一。

2、本發明的目的之二在于提供用于檢測豬親緣關系和/或個體識別的試劑。

3、本發明的目的之三在于提供用于檢測豬親緣關系和/或個體識別的試劑盒。

4、本發明的目的之四在于提供檢測豬親緣關系和/或個體識別的方法。

5、本發明的目的之五在于提供上述鸚鵡組合物、試劑、試劑盒或方法的應用。

6、為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：

7、本發明的第一個方面，提供了用于檢測豬親緣關系和/或個體識別的引物組合物，其特征在于，所述引物組合物由擴增如下21個str位點的引物對組成：sw72、sw830、sw122、sw632、nc_010448.4：30771560-30771774、nc_010444.4：79465902-79466147、sw2410、sw857、s0090、s0026、nc_010461.5：125168617-125168844、nc_010448.4：133201992-133202223、sw24、sw951、sw787、s0068、nc_010446.5：111894542-111894769、nc_010456.5：2142411-2142640、nc_010445.4：30015724-30015971、nc_010445.4：61466571-61466802和igf1，其中：

8、擴增sw72的上游引物sw72-f，核苷酸序列如seq?id?no.1所示；

9、擴增sw72的下游引物sw72-r，核苷酸序列如seq?id?no.2所示；

10、擴增sw830的上游引物sw830-f，核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

11、擴增sw830的下游引物sw830-r，核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

12、擴增sw122的上游引物sw122-f，核苷酸序列如seq?id?no.5所示；

13、擴增sw122的下游引物sw122-r，核苷酸序列如seq?id?no.6所示；

14、擴增sw632的上游引物sw632-f，核苷酸序列如seq?id?no.7所示；

15、擴增sw632的下游引物sw632-r，核苷酸序列如seq?id?no.8所示；

16、擴增nc_010448.4：30771560-30771774的上游引物nc_010448.4：30771560-30771774-f，核苷酸序列如seq?id?no.9所示；

17、擴增nc_010448.4：30771560-30771774的下游引物nc_010448.4：30771560-30771774-r，核苷酸序列如seq?id?no.10所示；

18、擴增nc_010444.4：79465902-79466147的上游引物nc_010444.4：79465902-79466147-f，核苷酸序列如seq?id?no.11所示；

19、擴增nc_010444.4：79465902-79466147的下游引物nc_010444.4：79465902-79466147-r，核苷酸序列如seq?id?no.12所示；

20、擴增sw2410的上游引物sw2410-f，核苷酸序列如seq?id?no.13所示；

21、擴增sw2410的下游引物sw2410-r，核苷酸序列如seq?id?no.14所示；

22、擴增sw857的上游引物sw857-f，核苷酸序列如seq?id?no.15所示；

23、擴增sw857的下游引物sw857-r，核苷酸序列如seq?id?no.16所示；

24、擴增s0090的上游引物s0090-f，核苷酸序列如seq?id?no.17所示；

25、擴增s0090的下游引物s0090-r，核苷酸序列如seq?id?no.18所示；

26、擴增s0026的上游引物s0026-f，核苷酸序列如seq?id?no.19所示；

27、擴增s0026的下游引物s0026-r，核苷酸序列如seq?id?no.20所示；

28、擴增nc_010461.5：125168617-125168844的上游引物nc_010461.5：125168617-125168844-f，核苷酸序列如seq?id?no.21所示；

29、擴增nc_010461.5：125168617-125168844的下游引物nc_010461.5：125168617-125168844-r，核苷酸序列如seq?id?no.22所示；

30、擴增nc_010448.4：133201992-133202223的上游引物nc_010448.4：133201992-133202223-f，核苷酸序列如seq?id?no.23所示；

31、擴增nc_010448.4：133201992-133202223的下游引物nc_010448.4：133201992-133202223-r，核苷酸序列如seq?id?no.24所示；

32、擴增sw24的上游引物sw24-f，核苷酸序列如seq?id?no.25所示；

33、擴增sw24的下游引物sw24-r，核苷酸序列如seq?id?no.26所示；

34、擴增sw951的上游引物sw951-f，核苷酸序列如seq?id?no.27所示；

35、擴增sw951的下游引物sw951-r，核苷酸序列如seq?id?no.28所示；

36、擴增sw787的上游引物sw787-f，核苷酸序列如seq?id?no.29所示；

37、擴增sw787的下游引物sw787-r，核苷酸序列如seq?id?no.30所示；

38、擴增s0068的上游引物s0068-f，核苷酸序列如seq?id?no.31所示；

39、擴增s0068的下游引物s0068-r，核苷酸序列如seq?id?no.32所示；

40、擴增nc_010446.5：111894542-111894769的上游引物nc_010446.5：111894542-111894769-f，核苷酸序列如seq?id?no.33所示；

41、擴增nc_010446.5：111894542-111894769的下游引物nc_010446.5：111894542-111894769-r，核苷酸序列如seq?id?no.34所示；

42、擴增nc_010456.5：2142411-2142640的上游引物nc_010456.5：2142411-2142640-f，核苷酸序列如seq?id?no.35所示；

43、擴增nc_010456.5：2142411-2142640的下游引物nc_010456.5：2142411-2142640-r，核苷酸序列如seq?id?no.36所示；

44、擴增nc_010445.4：30015724-30015971的上游引物nc_010445.4：30015724-30015971-f，核苷酸序列如seq?id?no.37所示；

45、擴增nc_010445.4：30015724-30015971的下游引物nc_010445.4：30015724-30015971-r，核苷酸序列如seq?id?no.38所示；

46、擴增nc_010445.4：61466571-61466802的上游引物nc_010445.4：61466571-61466802-f，核苷酸序列如seq?id?no.39所示；

47、擴增nc_010445.4：61466571-61466802的下游引物nc_010445.4：61466571-61466802-r，核苷酸序列如seq?id?no.40所示；

48、擴增igf1的上游引物igf1-f，核苷酸序列如seq?id?no.41所示；

49、擴增igf1的下游引物igf1-r，核苷酸序列如seq?id?no.42所示。

50、進一步的，所述引物組合物按照str位點分為四組，所述引物組合物由第一組str位點的擴增引物、第二組str位點的擴增引物、第三組str位點的擴增引物和第四組str位點的擴增引物組成；

51、第一組str位點包括：sw72、sw830、sw122、sw632、nc_010448.4：30771560-30771774和nc_010444.4：79465902-79466147；

52、第二組str位點包括：sw2410、sw857、s0090、s0026、nc_010461.5:125168617-125168844和nc_010448.4:133201992-133202223；

53、第三組str位點包括：sw24、sw951、sw787和s0068；

54、第四組str位點包括：nc_010446.5:111894542-111894769、nc_010456.5:2142411-2142640、nc_010445.4:30015724-30015971、nc_010445.4:61466571-61466802和igf1；

55、所述第一組str位點的擴增引物、第二組str位點的擴增引物、第三組str位點的擴增引物和第四組str位點的擴增引物采用的熒光染料標記物彼此不同。

56、具體地，所述第一組str位點的擴增引物采用的熒光染料標記物為fam；所述第二組str位點的擴增引物采用的熒光染料標記物為hex；所述第三組str位點的擴增引物采用的熒光染料標記物為tamra；所述第四組str位點的擴增引物采用的熒光染料標記物為rox。

57、根據本發明的第二個方面，提供了用于檢測豬親緣關系和/或個體識別的試劑，包括上述的引物組合物。

58、進一步的，所述試劑可以為溶液；

59、在所述試劑中，第一組str位點的擴增引物終濃度為0.2μmol/l；第二組str位點的擴增引物終濃度為0.15μmol/l；第三組str位點的擴增引物終濃度為0.25μmol/l；第四組str位點的擴增引物終濃度為0.18μmol/l。

60、根據本發明的第三個方面，提供了用于檢測豬親緣關系和/或個體識別的試劑盒，所述試劑盒包括上述的引物組合物或試劑。

61、所述試劑盒可單管同時擴增21個豬的str位點，主要包括：sw72、sw830、sw122、sw632、nc_010448.4：30771560-30771774、nc_010444.4：79465902-79466147、sw2410、sw857、s0090、s0026、nc_010461.5：125168617-125168844、nc_010448.4：133201992-133202223、sw24、sw951、sw787、s0068、nc_010446.5：111894542-111894769、nc_010456.5：2142411-2142640、nc_010445.4：30015724-30015971、nc_010445.4：61466571-61466802和igf1。

62、進一步的，所述試劑盒還可以包括pcr擴增所需要的taq?dna聚合酶、dntp、pcr緩沖液、mg2+中的一種或多種。

63、所述試劑盒的各種試劑組分可以存在于分開的容器中，或者可以全部或部分預組合成試劑混合物。

64、在一些具體的實施方式中，所述試劑盒包括的pcr擴增反應體系為10μl，包括4μl2.5×master?mix、1μl各組引物混合液、4μl無核酸酶純水和1μl?dna模板。

65、根據本發明的第四個方面，提供了檢測豬親緣關系和/或個體識別的方法，包括如下步驟：

66、1）提取待測樣本dna；

67、2）以所述dna為模板，利用上述的引物組合物、試劑或試劑盒進行pcr擴增，得到擴增產物；

68、3）采用毛細管電泳進行檢測；

69、4）數據分析。

70、利用熒光pcr毛細管電泳技術檢測豬str位點信息，通過一管式擴增，可同時檢測21個str位點。與現有技術相比，檢測方法簡單快捷、成本低，且準確度高。

71、進一步地，步驟4）是通過genemapper6.0軟件分析獲得21個str分型圖譜信息。

72、上述方法中，所述pcr反應程序可以包括：

73、第1步：95℃預變性5分鐘；

74、第2步：95℃變性10秒，58℃退火及延伸2分鐘，將第2步循環30次；

75、第3步：60℃延伸45分鐘；

76、第4步：4℃低溫保存。

77、此外，根據本發明的第五個方面，還提供了上述的引物組合物、試劑、試劑盒或方法在如下任一項中的應用：

78、（a）豬個體識別或制備豬個體識別的產品；

79、（b）豬親緣關系鑒定或制備豬親緣關系鑒定的產品；

80、（c）豬群體遺傳學分析或制備豬群體遺傳學分析的產品；

81、（d）豬dna相關案件檢驗或制備豬dna相關案件檢驗的產品；

82、（e）豬dna數據庫建設或制備豬dna數據庫建設的產品。

83、進一步的，所述豬可以為大白豬、長白豬、杜洛克、中國民豬、野豬等。

84、與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

85、本發明首次將isag公布的str位點與通過高通量測序數據分析獲得的多態性高的str位進行組合篩選獲得一組適用于豬親緣關系和/或個體識別的str位點。本發明還對str位點進行了優化提高引物的特異性，相互之間不存在連鎖效應，分型豐富且兼容性好，使檢測結果準確可靠；且操作方法簡單，檢測時長短；一次性可以檢測多個位點，成本低；靈敏度高，低至2ng/μl的dna模板量可以得到準確分型；并且本發明所述的檢測試劑盒具備良好的特異性與穩定性，多次實驗無非特異產生，信號強度穩定；適用檢材類型豐富，如血液，口腔拭子，細胞，組織，精液等。