本技術(shù)涉及微生物檢測(cè)相關(guān)，具體提供了一種鐮刀菌的選擇性培養(yǎng)基及其在水產(chǎn)品檢測(cè)中的用途。

背景技術(shù)：

1、鐮刀菌病（fusarium?disease）是一種在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的常見疾病，尤其是在蝦類養(yǎng)殖中極為普遍，被認(rèn)為是養(yǎng)殖蝦類“第一殺手”。

2、鐮刀菌生長(zhǎng)速度快，幾天內(nèi)就可以形成肉眼可見的菌落，并且爆發(fā)時(shí)間通常與高溫、高密度養(yǎng)殖、水質(zhì)差及飼養(yǎng)管理不當(dāng)有密切關(guān)系。鐮刀菌種類繁多，至今已報(bào)道超過500種，一些鐮刀菌可產(chǎn)生真菌毒素，如伏馬菌素、脫氧雪腐鐮刀菌醇和玉米赤霉烯酮。

3、近年來，研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的危害日趨嚴(yán)重。鐮刀菌廣泛存在于水體中，水產(chǎn)動(dòng)物很容易接觸到鐮刀菌，鐮刀菌孢子或菌絲首先需要附著在水產(chǎn)動(dòng)物的體表，特別是受損的皮膚或鰓部。然后通過機(jī)械方式穿透受損的皮膚或鰓部，侵入后會(huì)迅速生長(zhǎng)，形成菌絲網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步向周圍組織擴(kuò)展并分泌多種酶為真菌提供養(yǎng)分。真菌在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)扎根后會(huì)產(chǎn)生各種毒素，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，don）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，zea）等，這些毒素可以直接損害宿主的組織，影響其生理功能，甚至導(dǎo)致死亡。其還會(huì)通過分泌效應(yīng)蛋白或其他機(jī)制來抑制宿主的免疫系統(tǒng)，降低其防御能力，導(dǎo)致組織損傷，如皮膚潰瘍、鰭部腐爛，侵入內(nèi)臟器官，最后造成肝、腎等器官的損害。

4、近年來，隨著分子生物學(xué)的飛躍式發(fā)展，可以通過設(shè)計(jì)特異性的引物檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)鐮刀菌的dna，這是一種靈敏且特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法。但是，該種方法需要較高的設(shè)備需求和專業(yè)技術(shù)人員操作，不利于進(jìn)行養(yǎng)殖實(shí)地檢測(cè)。顯微鏡觀察方法檢查體組織，可以識(shí)別出鐮刀菌的孢子或菌絲的存在，但是該種方法可能存在一定的誤差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于此，本技術(shù)提供一種鐮刀菌的選擇性培養(yǎng)基及其在水產(chǎn)品檢測(cè)中的用途。本技術(shù)利用選擇性培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)鐮刀菌，再根據(jù)菌落的形態(tài)特征判斷水產(chǎn)品中是否感染鐮刀菌，該方法不僅簡(jiǎn)便且可操作性強(qiáng)，且準(zhǔn)確高。

2、第一方面，本技術(shù)提供了一種選擇性培養(yǎng)鐮刀菌的選擇性培養(yǎng)基，所述選擇性培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、鏈霉素、氯霉素和頭孢霉素；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自無(wú)氮培養(yǎng)基；所述鏈霉素的濃度為(60～100)μg/ml，所述氯霉素的濃度為(10～50)μg/ml，所述頭孢霉素的濃度為(60～100)μg/ml。

3、在一些可選實(shí)施方式中，所述鏈霉素的濃度為(70～90)μg/ml；例如70μg/ml、71μg/ml、72μg/ml、73μg/ml、74μg/ml、75μg/ml、76μg/ml、77μg/ml、78μg/ml、79μg/ml、80μg/ml、81μg/ml、82μg/ml、83μg/ml、84μg/ml、85μg/ml、86μg/ml、87μg/ml、88μg/ml、89μg/ml或90μg/ml等。在一些具體實(shí)施方式中，所述鏈霉素的濃度為80μg/ml。

4、在一些可選實(shí)施方式中，所述氯霉素的濃度為(20～40)μg/ml；例如20μg/ml、21μg/ml、22μg/ml、23μg/ml、24μg/ml、25μg/ml、26μg/ml、27μg/ml、28μg/ml、29μg/ml、30μg/ml、31μg/ml、32μg/ml、33μg/ml、34μg/ml、35μg/ml、36μg/ml、37μg/ml、38μg/ml、39μg/ml或40μg/ml等。在一些具體實(shí)施方式中，所述氯霉素的濃度為30μg/ml。

5、在一些可選實(shí)施方式中，所述頭孢霉素的濃度為(70～90)μg/ml；例如70μg/ml、71μg/ml、72μg/ml、73μg/ml、74μg/ml、75μg/ml、76μg/ml、77μg/ml、78μg/ml、79μg/ml、80μg/ml、81μg/ml、82μg/ml、83μg/ml、84μg/ml、85μg/ml、86μg/ml、87μg/ml、88μg/ml、89μg/ml或90μg/ml等。在一些具體實(shí)施方式中，所述頭孢霉素的濃度為80μg/ml。

6、在一些具體實(shí)施方式中，所述鏈霉素的濃度為80μg/ml，所述氯霉素的濃度為30μg/ml，所述頭孢霉素的濃度為80μg/ml。

7、在一些可選實(shí)施方式中，以所述無(wú)氮培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，所述無(wú)氮培養(yǎng)基包括碳源(0.7～1.3)wt%（例如0.7wt%、0.8wt%、0.9wt%、1.0wt%、1.2wt%或1.3wt%等）、三水合磷酸氫二鉀(0.2～0.6)wt%（例如0.2wt%、0.3wt%、0.4wt%、0.5wt%或0.6wt%等）、磷酸二氫鉀(0～0.4)wt%（例如0wt%、0.1wt%、0.2wt%、0.3wt%或0.4wt%等）、七水硫酸鎂(0.2～0.6)wt%（例如0.2wt%、0.3wt%、0.4wt%、0.5wt%或0.6wt%等）、氯化鈣(0.15～0.35)wt%（例如0.15wt%、0.2wt%、0.25wt%、0.3wt%或0.35wt%等）、碳酸鈣(0.2～0.6)wt%（例如0.2wt%、0.3wt%、0.4wt%、0.5wt%或0.6wt%等）、瓊脂粉(1.2～1.8)wt%（例如1.2wt%、1.3wt%、1.4wt%、1.5wt%、1.6wt%、1.7wt%或1.8wt%等）、余量為水。

8、在一些可選實(shí)施方式中，所述碳源選自蔗糖、葡萄糖和半乳糖中的至少一種。在一些具體實(shí)施方式中，所述碳源選自蔗糖。

9、在一些具體實(shí)施方式中，以所述無(wú)氮培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，所述無(wú)氮培養(yǎng)基包括蔗糖1wt%、三水合磷酸氫二鉀0.4wt%、磷酸二氫鉀0wt%、七水硫酸鎂0.5wt%、氯化鈣0.25wt%、碳酸鈣0.4wt%、瓊脂粉1.5wt%、余量為水。

10、在一些具體實(shí)施方式中，以所述無(wú)氮培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，所述無(wú)氮培養(yǎng)基包括蔗糖1wt%、三水合磷酸氫二鉀0.4wt%、磷酸二氫鉀0.2wt%、七水硫酸鎂0.5wt%、氯化鈣0.25wt%、碳酸鈣0.4wt%、瓊脂粉1.5wt%、余量為水。

11、在一些具體實(shí)施方式中，以所述無(wú)氮培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，所述無(wú)氮培養(yǎng)基包括蔗糖1wt%、三水合磷酸氫二鉀0.4wt%、磷酸二氫鉀0.4wt%、七水硫酸鎂0.5wt%、氯化鈣0.25wt%、碳酸鈣0.4wt%、瓊脂粉1.5wt%、余量為水。

12、在一些可選實(shí)施方式中，所述鐮刀菌選自雪腐鐮刀菌、串珠鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、三線鐮刀菌、梨孢鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、木賊鐮刀菌、茄病鐮刀菌和尖孢鐮刀菌中的至少一種。在另一些可選實(shí)施方式中，所述鐮刀菌選自雪腐鐮刀菌、串珠鐮刀菌和禾谷鐮刀菌中的至少一種。

13、第二方面，本技術(shù)提供了一種第一方面所述的選擇性培養(yǎng)基在水產(chǎn)品檢測(cè)中的用途。

14、在一些具體實(shí)施方式中，所述水產(chǎn)品選自對(duì)蝦（penaeus?orientalis）。

15、在一些具體實(shí)施方式中，所述水產(chǎn)品檢測(cè)的檢測(cè)項(xiàng)目選自鐮刀菌檢測(cè)。

16、第三方面，本技術(shù)提供了一種檢測(cè)水產(chǎn)品中鐮刀菌的方法，所述方法包括以下步驟：

17、步驟s1、將水產(chǎn)品制成待測(cè)樣本；

18、步驟s2、將待測(cè)樣本接種于第一方面所述的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到菌落；

19、步驟s3、根據(jù)菌落中孢子的形態(tài)特征，判斷水產(chǎn)品中是否感染鐮刀菌。

20、在一些具體實(shí)施方式中，步驟s1中，所述水產(chǎn)品選自對(duì)蝦。進(jìn)一步地，步驟s1的操作過程為：將對(duì)蝦的鰓絲和頭胸甲與無(wú)菌水混合研磨，得到待測(cè)樣本。

21、在一些可選實(shí)施方式中，步驟s2中，所述培養(yǎng)的溫度為(20～40)℃（例如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等）；和/或，所述培養(yǎng)的時(shí)間為(36～84)小時(shí)（例如36小時(shí)、42小時(shí)、48小時(shí)、54小時(shí)、60小時(shí)、66小時(shí)、72小時(shí)、78小時(shí)或84小時(shí)等）。在一些具體實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)的溫度為28℃。

22、在一些可選實(shí)施方式中，步驟s3中，通過顯微鏡觀察菌落中孢子的形態(tài)特征，判斷水產(chǎn)品中是否感染鐮刀菌。

23、本技術(shù)具有以下有益效果：

24、第一、本技術(shù)利用選擇性培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)鐮刀菌，再根據(jù)菌落的形態(tài)特征判斷水產(chǎn)品中是否感染鐮刀菌，該方法不僅簡(jiǎn)便且可操作性強(qiáng)，且準(zhǔn)確高。

25、第二、，實(shí)驗(yàn)樣本中的鐮刀菌不能在含氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)；由此表明，含氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基不能用于選擇性培養(yǎng)鐮刀菌。進(jìn)一步地，無(wú)氮培養(yǎng)基中的磷酸二氫鉀的加入以及加入量能夠進(jìn)一步影響提升本技術(shù)選擇性培養(yǎng)基的準(zhǔn)確率。

26、第三、本技術(shù)使用“鏈霉素、氯霉素和頭孢霉素”的組合，能夠顯著提升本技術(shù)選擇性培養(yǎng)基的準(zhǔn)確率。