本技術涉及細胞培養制備，具體地涉及一種人源星形膠質細胞的誘導制備方法。

背景技術：

1、星形膠質細胞在人體內扮演著至關重要的角色，它們能夠發揮調節神經遞質、維持離子平衡、支持血腦屏障、提供能量、參與晝夜節律調節、促進神經保護與修復等作用，對神經系統的健康至關重要。另外，星形膠質細胞在神經退行性疾病中也起著雙重作用：一方面，它們可能通過釋放神經毒性因子和參與能量代謝異常導致神經元損傷；另一方面，它們也參與神經保護。這些細胞的活化狀態與神經炎癥和退行性變的發展緊密相關，使其成為治療這些疾病的潛在靶點。相關研究表明，將培育出的星形膠質細胞移植到白質中風患者腦內，可修復其大腦損傷，誘導被中風破壞的腦細胞愈合，并刺激受損的少突膠質細胞祖細胞恢復新生長軸突上的髓鞘，傳統方法誘導制備星形膠質細胞存在誘導時間長和安全性風險差等問題。

技術實現思路

1、為克服上述缺點，本技術的目的在于：提供一種人源星形膠質細胞的誘導制備方法，從而有效地解決上述技術問題。

2、為了達到以上目的，本技術采用如下技術方案：

3、本技術提供的一種人源星形膠質細胞的誘導制備方法，包括如下步驟：

4、取靜脈外周血，對所述外周血進行稀釋，在稀釋后的外周血中加入細胞密度梯度分離液，對所述外周血和所述細胞密度梯度分離液的混合液進行離心以實現分層效果，吸出分層后溶液中含有血漿的黃色上層后將含有外周血單個核細胞的白色中間層轉移出，對外周血單個核細胞進行磷酸鹽緩(psb)沖液重懸并進行離心得到第一細胞沉淀，將所述第一細胞沉淀與紅細胞裂解緩沖液混合并孵育，對第一細胞沉淀和紅細胞裂解緩沖液的混合液采用磷酸鹽緩沖液稀釋并進行離心得到第二細胞沉淀，對所述第二細胞沉淀采用磷酸鹽緩沖液重懸并進行離心，將離心后的沉淀重懸以得到外周血單個核細胞懸液，在懸液中的外周血單個核細胞加入外周血單個核細胞培養基進行孵育培養以得到外周血單個核細胞樣品；

5、取仙臺病毒載體，所述仙臺病毒載體攜帶基因八聚體結合轉錄因子3/4(oct3/4)、性別決定區y-box?2(sox2)、骨髓細胞瘤癌基因(c-myc)、krüppel樣因子4(klf-4)，通過所述仙臺病毒載體對外周血單個核細胞進行轉染以得出擴增的外周血單個核細胞，分離仙臺病毒載體和轉染細胞，將所述轉染細胞重懸于外周血單個核細胞培養基中進行轉染培養，在轉染培養后將轉染培養形成的傳代細胞轉移于基質膠包被好的培養板上繼續培養，取神經前體細胞分化培養基，通過所述神經前體細胞分化培養基對傳代細胞進行培養以形成人誘導神經前體細胞；

6、取神經膠質祖細胞誘導培養基，通過所述神經膠質祖細胞誘導培養基對所述人誘導神經前體細胞進行懸浮培養以形成神經膠質祖細胞；

7、取星形膠質細胞誘導培養基，通過所述星形膠質細胞誘導培養基對所述神經膠質祖細胞進行貼壁培養以得到星形膠質細胞。

8、進一步地，所述外周血單個核細胞培養基通過體積比1:1的伊思柯夫改良杜爾貝科培養基(imdm培養基)和漢姆f-12營養混合物(ham's?f-12培養基)、體積比1％的胰島素-轉鐵蛋白-硒-乙醇胺培養基補充劑(its-x)、體積比1％的化學成分明確的脂質濃縮液、質量體積比1％的l-谷氨酰胺、30-80μg/ml?l-抗壞血酸、5mg/ml牛血清白蛋白，200μm硫代甘油、100ng/ml重組人干細胞因子、100μg/ml全鐵轉鐵蛋白，40ng/ml胰島素樣生長因子1、10ng/ml白細胞介素3、2u/ml促紅細胞生成素、1μm地塞米松形成。

9、進一步地，將所述轉染細胞重懸于外周血單個核細胞培養基中進行轉染培養包括如下步驟：

10、在轉染后的第一天更換新的外周血單個核細胞培養基以取出病毒載體，

11、在轉染后的第二天更換新的外周血單個核細胞培養基以得到傳代細胞，

12、在轉染后的第三天將傳代細胞轉移至基質膠包被好的培養板上繼續培養，

13、在轉染后的第四天更換神經前體細胞分化培養基培養以得到人誘導神經前體細胞。

14、進一步地，在更換神經前體細胞分化培養基進行培養后，每兩天更換一次新的神經前體細胞分化培養基，持續培養直至得到人誘導神經前體細胞。

15、進一步地，所述神經前體細胞分化培養基通過體積比1:1的杜氏改良eagle培養基/漢姆f-12營養混合物(dmem/f12培養基)和神經基礎培養基(neurobasal培養基)、加入體積比1％的n2添加劑、體積比2％的b27添加劑、體積比1％的非必需氨基酸、體積比1％的谷氨酰胺補充劑、5-20ng/ml重組人白血病抑制因子、2-6μm?6-氨基嘌呤衍生物和2-4μm?4-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1h-咪唑-2-基]-苯酰胺水合物(sb431542)形成。

16、進一步地，通過所述神經膠質祖細胞誘導培養基對所述人誘導神經前體細胞進行懸浮培養包括：

17、取神經膠質祖細胞誘導培養基對人誘導神經前體細胞進行懸浮培養(密度為5e5/ml)，每天更換新的神經膠質祖細胞誘導培養基直至第14天收集懸浮細胞球貼壁培養，再次使用神經膠質祖細胞誘導培養基進行培養，每兩天更換一次新的神經膠質祖細胞誘導培養直至收集爬出的神經膠質祖細胞。

18、進一步地，所述神經膠質祖細胞誘導培養基通過體積比1:1的杜氏改良eagle培養基/漢姆f-12營養混合物(dmem/f12培養基)和神經基礎培養基(neurobasal培養基)，加入體積比1％的n2添加劑、體積比2％的b27添加劑、體積比1％的非必需氨基酸、體積比1％的谷氨酰胺補充劑、40-80ng/ml三碘甲狀腺原氨酸、10-30ng/ml血小板衍生生長因子aa、5-20ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、80-200nm視黃酸、0.5-2μm嘌嗎啡胺形成。

19、進一步地，通過所述星形膠質細胞誘導培養基對所述神經膠質祖細胞進行貼壁培養包括：

20、使用星形膠質細胞誘導培養基對神經膠質祖細胞進行貼壁培養，每2天更換一次新的星形膠質細胞誘導培養基直至細胞傳代，細胞傳代后繼續使用星形膠質細胞誘導培養基進行貼壁培養，每兩天更換一次新的星形膠質細胞誘導培養基直至獲取星形膠質細胞。

21、進一步地，所述星形膠質細胞誘導培養基通過體積比1:1的杜氏改良eagle培養基/漢姆f-12營養混合物(dmem/f12培養基)和神經基礎培養基(neurobasal培養基)，加入體積比1％的n2添加劑、體積比1％的非必需氨基酸、體積比1％的谷氨酰胺補充劑、10-30ng/ml表皮生長因子、10-30ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、150-200ng/ml胰島素樣生長因子1、10-20ng/ml睫狀神經營養因子形成。

22、有益效果

23、本技術采用人誘導神經前體細胞體外誘導分化形成星形膠質細胞的培養方式，先懸浮培養再貼球，大大縮短了星形膠質細胞的體外誘導分化時間，且不對細胞進行整合型基因編輯操作，安全性較高。