本發明涉及生物醫藥，特別是涉及一種人來源遠端氣道類器官copd模型的構建方法及應用。

背景技術：

1、慢性阻塞性肺疾?。╟opd）是一種異質性強的慢性呼吸道疾病，疾病特征主要是出現慢性呼吸道癥狀(呼吸困難、咳嗽、排痰)，這是由于呼吸道重塑、炎癥和/或肺泡異常引起的進行性不可逆氣流阻塞而導致的。

2、由于肺活量測定法是目前診斷copd的金標準，動物模型仍是研究copd的主要載體。然而不同物種之間存在種屬差異，在動物模型中得到的研究結果與copd在人體內的發生發展機制有所出入。同時由于copd患者通常缺乏必要手術指征，手術適用范圍小，相關臨床樣本難以獲取，極大限制了研究進展，亟需開發能反映人類copd病理特征的模型來進行相關研究。研究表明，遠端氣道是copd早期及主要病變的部位。然而現有的人來源氣道類器官主要是近端大氣道的支氣管類器官或沒有明確定位，不適用于體外研究copd在遠端氣道的病變和疾病發生發展機制。

3、此外，copd患病率和吸煙率直接相關，吸煙是引起copd的主要危險因素。將香煙煙霧提取物（ciga.rette?smoke?extract,?cse）用于copd體外造模，可在體外構建copd類器官模型模擬copd病變，為相關研究提供一個可用模型。然而，以往的cse體外造模主要集中于2d細胞或肺泡類器官，在氣道類器官上的使用比較少。如何利用cse構建人來源遠端氣道類器官copd模型，以模擬遠端氣道的copd病變，是本領域技術人員需要解決的技術問題。

技術實現思路

1、本發明提供一種人來源遠端氣道類器官copd模型的構建方法及應用，以利用cse構建人來源遠端氣道類器官copd模型，更好的模擬遠端氣道的copd病變。

2、本發明的一方面提供一種人來源遠端氣道類器官copd模型的構建方法，包括：

3、步驟s1，將人來源遠端肺組織浸泡于消化液中，37℃消化30-45min，使用溫和的樣本緩沖液終止消化，將組織切成碎塊，通過反復吹打獲得單細胞懸液，離心后獲得人來源肺組織單細胞a；

4、步驟s2，將單細胞a用細胞篩網過濾收集人來源肺組織單細胞b，離心后去除上清液，使用清洗液清洗1-2次后獲得人來源肺組織單細胞c；

5、步驟s3，觀察單細胞c是否出現紅色團塊，若未見紅色團塊，則直接執行步驟s4；若可見紅色團塊，則加入1?ml紅細胞裂解液于室溫下裂解3分鐘，然后以300g的速度進行分離，棄上清，得到人來源肺組織單細胞d；

6、步驟s4，將單細胞c或單細胞d與基質膠混勻后進行種板，在細胞培養箱中倒扣靜置，待膠凝固后，加入類器官擴增培養基，繼續于細胞培養箱中培養，每間隔3-4天更換一次培養基，培養得到元代人來源肺類器官；

7、步驟s5，將元代人來源肺類器官酶解后，與基質膠混勻后進行種板，在細胞培養箱中倒扣靜置，待膠凝固后，加入類器官擴增培養基，繼續于細胞培養箱中進行傳代培養，培養7-10天更換類器官分化培養基，每間隔3-4天更換一次培養基，培養11-14天得到人來源遠端氣道類器官；

8、步驟s6，將1支香煙剪去濾嘴，近濾嘴端接連接管的一端，連接管的另一端接吸有5ml類器官分化培養基的注射器針頭連接座，點燃香煙，吸取香煙煙霧至注射器中，當香煙剩余預設長度時，使用針頭帽和封口膠密封注射器，隨之將含有香煙煙霧和類器官分化培養基的注射器放入37℃搖床搖晃混勻10min；

9、步驟s7，解開封口膠和針頭帽時未見有香煙煙霧逸出，則提示香煙煙霧與培養基已充分混勻，得到香煙煙霧提取物e，使用0.22μm的過濾器過濾香煙煙霧提取物e，吸取100μl至96孔板中，酶標儀檢測320nm處吸光值a320和540nm處吸光值a540，當a320-a540=1.2時，定義香煙煙霧提取物e為100%cse；

10、步驟s8，使用類器官分化培養基將100%cse稀釋成20%cse，使用20%cse連續培養人來源遠端氣道類器官72h，每24h更換一次新鮮20%cse，即得人來源遠端氣道類器官copd模型。

11、本發明的另一方面提供了上述構建方法得到的人來源遠端氣道類器官copd模型在非治療目的的纖毛搏動功能檢測中的應用。

12、具體的，在構建成功的人來源遠端氣道類器官copd模型中，加入含有預設濃度藥物的20%cse，連續給藥3天，期間每24h更換一次新的含有預設濃度藥物的20%cse，然后進行纖毛搏動功能檢測。

13、有益效果：

14、（1）通過本發明的方法構建出來的人來源遠端氣道類器官copd模型在轉錄水平上與copd遠端氣道組織高度相似，在蛋白表達水平和纖毛功能水平上較好地還原了copd的病理特征，說明本發明在體外構建的人來源遠端氣道類器官copd模型可以模擬遠端氣道的copd病變，為研究遠端氣道的copd病理機制提供一個可用模型。

15、（2）本發明在操作上對cse提取的時間，溫度和質檢指標要求明確，能良好地保證cse的批次間提取質量和實驗可重復性。

16、（3）本發明通過檢測纖毛搏動功能進行藥篩研究，較之以往研究從細胞形態大小、轉錄水平或蛋白水平來判斷藥物治療效果，本發明以纖毛功能為檢測指標更能反應藥物對肺功能的改善作用，可以為copd藥物研究提供功能水平的數據支持。

技術特征：

1.一種人來源遠端氣道類器官copd模型的構建方法，其特征在于，包括：

2.根據權利要求1所述的人來源遠端氣道類器官copd模型的構建方法，其特征在于，步驟s1中，消化液為含有10-50mm?edta的tryple消化液。

3.根據權利要求1所述的人來源遠端氣道類器官copd模型的構建方法，其特征在于，步驟s1中，溫和的樣本緩沖液為：含有1-3%?bsa、且不含鈣鎂離子的pbs緩沖液。

4.根據權利要求1所述的人來源遠端氣道類器官copd模型的構建方法，其特征在于，步驟s2中，清洗液的成分及含量為：兩性霉素b，1-3ug/ml；primocin，10-1000μg/ml；慶大霉素，100-500μg/ml。

5.根據權利要求1所述的人來源遠端氣道類器官copd模型的構建方法，其特征在于，步驟s1、步驟s2中離心的條件均為：離心轉速300-500g，溫度4℃，離心時間5-10min。

6.根據權利要求1所述的人來源遠端氣道類器官copd模型的構建方法，其特征在于，類器官擴增培養基的成分及含量為：advanced?dmem/f12，1x；r-spondin?1，500ng/ml；fgf?7，25ng/ml；fgf?10，100ng/ml；noggin，100ng/ml；a83-01，500nm；y-27632，5μm；sb202190，500μm；b27?supplement，1x；n-acetylcysteine，1.25mm；nicotinamide，5mm；glutamax?100x，1x；hepes，10mm；penicillin/streptomycin,?100μg/ml；primocin，50μg/ml。

7.根據權利要求1所述的人來源遠端氣道類器官copd模型的構建方法，其特征在于，類器官分化培養基的成分及含量為：advanced?dmem/f12，1x；noggin，100ng/ml；a83-01，500nm；y-27632，5μm；sb202190，500μm；b27?supplement，1x；n-acetylcysteine，1.25mm；nicotinamide，5mm；glutamax?100x，1x；hepes，10mm；penicillin/streptomycin,?100μg/ml；primocin，50μg/ml；dapt，10μm。

8.權利要求1至7任一項所述的構建方法得到的人來源遠端氣道類器官copd模型在非治療目的的纖毛搏動功能檢測中的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，在構建成功的人來源遠端氣道類器官copd模型中，加入含有預設濃度藥物的20%cse，連續給藥3天，期間每24h更換一次新的含有預設濃度藥物的20%cse，然后進行纖毛搏動功能檢測。

技術總結
本發明公開了一種人來源遠端氣道類器官COPD模型的構建方法及應用，本發明構建出來的人來源遠端氣道類器官COPD模型在轉錄水平上與COPD遠端氣道組織高度相似，在蛋白表達水平和纖毛功能水平上較好地還原了COPD的病理特征，說明本發明在體外構建的人來源遠端氣道類器官COPD模型可以模擬遠端氣道的COPD病變，為研究遠端氣道的COPD病理機制提供一個可用模型。此外，在操作上對CSE提取的時間，溫度和質檢指標要求明確，能良好地保證CSE的批次間提取質量和實驗可重復性。本發明以纖毛功能為檢測指標更能反應藥物對肺功能的改善作用，可以為COPD藥物研究提供功能水平的數據支持。

技術研發人員：陳曄光,熊敬維,宋春暉
受保護的技術使用者：南昌大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28