本發(fā)明屬于基因工程，涉及 stsam-mt基因及其應用。

背景技術：

1、馬鈴薯作為全球重要的糧蔬兩用作物，長期以來一直面臨著各種病原菌的侵襲，其中由致病疫霉菌（ phytophthora?infestans）引發(fā)的晚疫病尤為嚴重，它極大地威脅著馬鈴薯的產量，甚至可能導致絕產。

2、植物在應對外界不良因素侵擾時，進化出了兩個層次的分子免疫系統(tǒng)來進行防御。植物的第一層免疫系統(tǒng)是通過細胞膜上的模式識別受體（prrs）來直接識別病原菌釋放的病原相關分子模式（pamps），從而觸發(fā)模式觸發(fā)免疫（pti）。這一機制是植物抵抗病原菌侵染的第一道防線，能夠有效地抵御部分病原菌的入侵。然而，當病原菌突破第一層免疫系統(tǒng)后，植物會啟動更為強烈的第二層免疫系統(tǒng)，即效應子觸發(fā)免疫（eti）（jones?et?al.,2006）。這一系統(tǒng)依賴于植物細胞內的抗病基因（ r基因）編碼的nb-lrr蛋白，這些蛋白能夠識別病原菌釋放的效應分子，并觸發(fā)更為強烈的免疫反應。 r基因常被用于培育對特定病原體具有抗性的作物。大多數(shù) r基因編碼核苷酸結合位點富含亮氨酸的重復序列蛋白，這些蛋白直接或間接識別致病性效應蛋白并觸發(fā)免疫。然而，大多數(shù) r基因介導的抗病性具有小種特異性，病原體可以通過突變其效應基因來逃避植物的免疫防御。

3、鑒于 r基因介導的抗病性存在的局限性，近年來，科學家們開始探索破壞植物感病基因作為培育抗病植物的新策略。感病基因是病原菌侵染并致病所必需的寄主基因，相較于抗病基因，由感病基因突變所介導的抗性通常具有持久性和廣譜抗性。例如， mlo基因是一個典型的感病基因，其功能喪失突變能夠顯著增強植物對白粉病的廣譜抗性（li?etal.,?2022）。類似地，小麥中的感病基因 tapsipk1的編輯品系在田間試驗中也表現(xiàn)出了高抗條銹病的能力，且不影響小麥的主要農藝性狀（wang?et?al.,?2022）。

4、sam-mt是植物次生代謝過程中的一個重要酶，它能夠將s-腺苷甲硫氨酸（sam）的甲基轉移到一個或多個次生代謝產物的結構上，從而改變這些化合物的結構和生物活性。例如，在木質素、類苯基丙烷和類黃酮類等化合物的合成過程中，sam-mt能夠催化甲基化反應，生成具有特定結構和功能的次生代謝產物。此外，sam-mt還通過甲基化修飾影響茉莉酸等植物激素的合成和信號傳導，進而調節(jié)植物的生長發(fā)育過程。在植物防御機制的啟動和調節(jié)中，sam-mt同樣發(fā)揮著重要作用，它能夠影響甲基化反應，從而影響植物的抗病性和抗蟲性。有文獻報道指出， wuschel能夠抑制某些植物s-腺苷-l-甲硫氨酸依賴的甲基轉移酶（包括可能的sam-mt）的表達，進而抑制病毒蛋白的合成（haijun?et?al.,?2020）。此外，甲基轉移酶超家族的 tasam基因已被證明有助于小麥對赤霉病的抗性（malla?et?al.,2024）。基于這些發(fā)現(xiàn)，本技術人推測在馬鈴薯中，s-腺苷-l-甲硫氨酸依賴的甲基轉移酶基因（特別是本技術人發(fā)現(xiàn)的 stsam-mt）可能在馬鈴薯抗晚疫病過程中發(fā)揮重要作用。本技術人的研究結果顯示， stsam-mt是一個馬鈴薯晚疫病感病基因。

5、綜上所述，挖掘和利用感病基因為培育植物抗病品種提供了新的思路。通過破壞或編輯感病基因，可以培育出具有持久性和廣譜抗性的植物品種，從而更有效地應對病原菌的威脅。該策略有助于提高植物的抗病性，為農業(yè)生產提供可持續(xù)和環(huán)保的病害防控方案。未來，本技術人將進一步解析 stsam-mt在植物免疫中的作用機制，以期為馬鈴薯抗晚疫病育種提供新的策略和方法。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于進一步發(fā)掘出具有調控馬鈴薯抗致病疫霉菌的關鍵基因，采取有效手段拓展功能基因在提高馬鈴薯抗晚疫病方面的應用。對此，本發(fā)明提供了s-腺苷-l-甲硫氨酸依賴的甲基轉移酶stsam-mt的應用來為豐富抗病基因資源及分子輔助選育和創(chuàng)制抗病材料提供新的技術思路。

2、本技術發(fā)明人從馬鈴薯cdna文庫中成功分離克隆出一種馬鈴薯s-腺苷-l-甲硫氨酸依賴的甲基轉移酶基因（ stsam-mt基因），并驗證 stsam-mt基因在馬鈴薯響應致病疫霉菌侵染的免疫調控過程中所發(fā)揮的作用。

3、為實現(xiàn)這一技術目的，本發(fā)明采用如下技術方案。

4、第一方面，本發(fā)明提供 stsam-mt基因，所述 stsam-mt基因：

5、a1）編碼stsam-mt蛋白；

6、b1）具有如seq?id?no:2所示的核苷酸序列。

7、第二方面，本發(fā)明提供stsam-mt蛋白，所述stsam-mt蛋白：

8、1）具有如seq?id?no:1所示的氨基酸序列；

9、2）由1）中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失和/或添加一個或者幾個氨基酸獲得的衍生的氨基酸序列，所述衍生的氨基酸序列具有1）中所示的氨基酸序列的活性；或者

10、3）與1）中的氨基酸序列具有至少80%同源性的氨基酸序列。

11、優(yōu)選的，所述 stsam-mt基因與馬鈴薯致病疫霉菌免疫調控相關。

12、優(yōu)選的，所述 stsam-mt基因在馬鈴薯抗致病疫霉菌免疫反應中具有負調控作用。

13、優(yōu)選的，過表達所述 stsam-mt基因可減弱寄主植物對致病疫霉菌 phytophthora? infestans的抗性。

14、優(yōu)選的，所述 stsam-mt基因具有核苷酸序列如seq?id?no:3所示的特異性基因片段，沉默所述特異性基因片段可增強寄主植物對致病疫霉菌 phytophthora?infestans的抗性。

15、第三方面，提供表達載體，所述表達載體含有本發(fā)明所述的 stsam-mt基因。

16、此外，還提供抗致病疫霉菌 phytophthora?infestans植物品種的培育方法，包括將本發(fā)明所述的表達載體轉入寄主植物和沉默 stsam-mt基因的步驟。

17、再者，還提供本發(fā)明所述的 stsam-mt基因或本發(fā)明所述的表達載體在抗致病疫霉菌 phytophthora?infestans植物品種培育中的應用。

18、優(yōu)選的，包括：

19、a2）沉默 stsam-mt基因的核苷酸序列，增強寄主植物對致病疫霉菌 phytophthora? infestans的抗性；或者

20、b2）降低stsam-mt蛋白的活性和/或表達量，增強寄主植物對致病疫霉菌 phytophthora?infestans的抗性。

21、在本發(fā)明中，降低植物中某一具體蛋白活性和/或表達量可通過vigs、rna干擾、同源重組、基因定點編輯等本領域熟知的方法，達到降低植物中某一蛋白活性和/或表達量的目的。

22、在本發(fā)明中，本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發(fā)明的 stsam-mt基因的核苷酸序列進行突變。因此，本發(fā)明請求保護所述s-腺苷-l-甲硫氨酸依賴的甲基轉移酶基因 stsam-mt在選育和創(chuàng)制抗馬鈴薯致病疫霉菌種質資源材料中的應用。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的 stsam-mt基因的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要編碼 stsam-mt基因且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

23、在本發(fā)明中，術語“核苷酸序列”或“多核苷酸”是指通過磷酸二酯鍵或其類似物連接的天然或合成的核苷酸殘基的線性聚合體。其可以是單鏈的或雙鏈的，并且包括rna、dna（例如可以是基因組、cdna或合成的）、其類似物或其組合。本領域技術人員應該理解，通常核苷酸序列的表示順序從左到右是5'-3'順序，并且，除非另外指出，否則“a”是指脫氧腺苷，“c”是指脫氧胞苷，“g”是指脫氧鳥苷，“t”是指脫氧胸苷，而“u”是指核糖核苷，尿苷。通常，核苷酸序列包含四種天然脫氧核苷酸或四種天然核糖核苷酸；然而，它們還可以包含非天然核苷酸類似物。

24、在本發(fā)明中，術語“氨基酸序列”是指蛋白質中氨基酸的排列順序。這個序列由遺傳信息決定，具體來說，就是由dna或rna中的基因通過轉錄和翻譯的過程決定的。氨基酸序列通常由字母組成的字符串表示，每個字母代表一個特定的氨基酸。這些序列是按照從n端（氨基端）到c端（羧基端）的方向排列的。在生物學中，有20種不同的標準氨基酸，每種氨基酸都有一個特定的單字母或三字母縮寫。例如，蛋氨酸（lysine）的三字母和單字母縮寫分別是lys和k。

25、在本發(fā)明中，術語“基因”（gene）是遺傳變異的主要物質。它是控制性狀的基本單位，由脫氧核糖核酸（dna）或核糖核酸（rna）分子上許多決定生物性狀的不同堿基對排列順序所組成。基因通過指導蛋白質的合成來表達自己所攜帶的遺傳信息，從而控制生物個體的性狀表現(xiàn)。具體來說，基因位于染色體上，呈線性排列，在染色體上是占有一定位置的遺傳單位。基因具有雙重性，即能忠實地復制自己，以保持生物的基本特征；同時在繁衍后代中又可能發(fā)生突變。突變基因也可以繼續(xù)復制，傳遞給后代。基因不僅可以通過復制把遺傳信息傳遞給下一代，還可以使遺傳信息在蛋白質的分子結構上得到表達，因此，基因是控制性狀的基本單位。一個基因只有一個dna分子，但一個dna分子上包含多個基因。基因是dna分子上具有遺傳效應的片段，它們決定性狀的表達。

26、在本發(fā)明中，術語“蛋白”是指蛋白質，蛋白質是生命的物質基礎，是有機大分子，是構成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔者。沒有蛋白質就沒有生命。氨基酸是蛋白質的基本組成單位。它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質。

27、相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果在于：

28、（1）本發(fā)明揭示了一個對馬鈴薯晚疫病具有感病作用的s-腺苷-l-甲硫氨酸依賴的甲基轉移酶基因，即 stsam-mt基因。利用農桿菌介導的瞬時表達和病毒誘導的基因沉默技術（vigs），揭示 stsam-mt基因在增強馬鈴薯對致病疫霉菌抗性中起重要作用，為馬鈴薯抗疫病基因的鑒定提供了理論基礎和新的技術思路，為馬鈴薯抗疫病育種提供抗性基因資源。

29、（2）本發(fā)明提供的 stsam-mt基因，通過農桿菌介導的瞬時表達體系在本氏煙草中瞬時過表達，驗證了 stsam-mt基因促進致病疫霉菌對植物的侵染，減弱植物對致病疫霉菌的抗性；通過病毒誘導的基因沉默技術（vigs）在本氏煙草中沉默 nbsam-mt基因，證實 nbsam-mt基因促進致病疫霉菌對植物的侵染，減弱植物對致病疫霉菌的抗性。同時利用農桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉化體系穩(wěn)定過表達 stsam-mt基因，獲得穩(wěn)定轉化 stsam-mt基因的馬鈴薯轉基因植株。