一種檢測耳聾基因20個突變位點的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及檢測臨床樣品中耳聾20個熱點突變位點的檢測方法，特別是設(shè)及W 多重PCR技術(shù)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜（簡稱MLDI-T0FΜ巧技術(shù)通 過質(zhì)譜技術(shù)與多引物延伸技術(shù)和MassARRAY技術(shù)結(jié)合使用進行SNP基因型分析的檢測方 法。 技術(shù)背景
[0002] 耳聾是是臨床上最常見的遺傳病之一。據(jù)2006年第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查結(jié) 果顯示，我國現(xiàn)有聽力言語殘疾者達2780萬人，占全國8296萬殘疾人的33. 5%，其中聽力 殘疾者2004萬，居各類殘疾之首，并W每年新增3-10萬聾兒的速度在增長。按照目前的增 長速度，至2050年，聽力損失患者將增長至3231萬人。導(dǎo)致耳聾的原因有環(huán)境因素、遺傳 因素或者環(huán)境因素與遺傳因素共同作用。其中遺傳因素是主要的部分，據(jù)報道，有60%的耳 聾是由遺傳缺陷引起的，另外在大量的遲發(fā)性聽力下降患者中，亦有許多患者也是由于自 身的基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多態(tài)性造成對致聾環(huán)境因素易感性增加而致病。近 年來隨著對健康的重視及社會醫(yī)療的發(fā)展，使環(huán)境因素如感染、聲損傷及其他疾病導(dǎo)致的 耳聾逐漸減少，更加突顯出遺傳因素的重要性。
[0003] 耳聾設(shè)及的致病基因數(shù)量多，迄今為止發(fā)現(xiàn)了超過100個基因區(qū)域和46個致病基 因，而每個基因中又存在數(shù)目眾多的耳聾突變位點，因而具有較高的基因和位點遺傳異質(zhì) 性。最近，在國內(nèi)開展的大規(guī)模耳聾分子流行病學(xué)研究表明，相當(dāng)一部分非綜合征性耳聾僅 由為數(shù)不多的幾個基因突變引起，如GJB2、化C26A4、mtDNA12srRNA及GJB3等。運為我們 大規(guī)模開展耳聾基因篩查及診斷提供了理論依據(jù)。
[0004] GJB2基因突變在1997年首次被定位，它在兒童語前聾中占20%，在兒童非綜合征 耳聾（N甜I)中占40%。GJB2基因突變在亞洲人遺傳性耳聾中有一定的發(fā)生比例，中國學(xué) 語前聾兒（耳聾在5歲前發(fā)病）中26%。33%為GJB2基因突變所致，占常染色體隱性遺傳 性耳聾的28%。GJB2基因突變方式復(fù)雜多變，具有明顯的種族差異性。目前已檢出的GJB2 基因中的不同的致病突變中最多見為30delG或35delG突變。而在我國大量流行病學(xué)調(diào)查 顯示，GJB2基因致聾突變頻率最高的為235delC，其次為299_300delAT及176dell6。在地 中海國家和美國遺傳性非綜合征耳聾患者中30delG或35delG位點的突變占60-85%，而 我國相對較低。在對GJB2基因突變方式的研究中，發(fā)現(xiàn)猶太人中最常見的突變?yōu)?67delT 的突變。戴樸等人對中國18個省份聾校的1680例非綜合征性耳聾病例GJB2基因235delC 突變的篩查中，發(fā)現(xiàn)235delC等位基因的攜帶率最高，其次為299-300delAT，176dell化P， 其它致病突變等位基因的攜帶率較低。臨床和流行病學(xué)研究表明約80%的遺傳性非綜合征 型語前聾為常染色體隱性遺傳。SLC26A4是常染色體隱性遺傳性耳聾最常見的致病基因之 一，占語前聾患兒的5%~10%，僅次于GJB2基因。SLC26A4突變是歐美人群化mired綜合 征和非綜合征型耳聾的常見原因，也是導(dǎo)致中國大部分遺傳性耳聾的常見病兇之一。
[0005] GJB3基因于1998年由夏家輝等研究中國2個常染色體顯性遺傳非綜合征耳聾家 系時定位并克隆。GJB3定位于人類染色體Ip33-p35,編碼有270個氨基酸的連接蛋白31，全 長3617bp。其突變在中國人群中常見，為導(dǎo)致常染色體顯性和隱性遺傳非綜合征耳聾的原 因之一。1998年，夏家輝等最早報道了兩個引起顯性遺傳高頻聽力下降的GJB3突變，他們 對42個遺傳性耳聾的家系進行篩查，在一個浙江的耳聾家系中發(fā)現(xiàn)了一個錯義突變，GJB3 基因編碼區(qū)的第547位堿基由G突變成A，使得連接蛋白Cx31的第183號氨基酸由谷氨酸 變成賴氨酸183K。同時他們還在一個湖南懷化家系中發(fā)現(xiàn)了一個無義突變。GJB3的第538 位堿基由C變成T，導(dǎo)致第180號氨基酸變?yōu)榻K止密碼子（Cx31R180x)。
[0006] 1993年，Prezant等首次提出線粒體A1555G點突變與氨基糖巧類抗生素致聾的相 關(guān)性。部分個體對氨基糖巧類藥物具有易感性，即應(yīng)用正常劑量或微量的藥物就可造成聽 力損失，現(xiàn)已證實線粒體A1555G突變和氨基糖巧類抗生素導(dǎo)致的藥物性聾密切相關(guān)。戴樸 等在中國不同省份特教學(xué)校的2016例非綜合征型耳聾患者線粒體DNAA1555G突變篩查中， 發(fā)現(xiàn)陽性病例57例，檢出率為2. 83%。2004年，有研究又明確了mtDNA1494C>T突變是 另一個可W由氨基糖巧類藥物單次劑量應(yīng)用導(dǎo)致耳聾的線粒體基因突變類型。
[0007] 基于大量的實驗研究，我們最終選擇了 4個基因（GJB2、GJB3、化C26A4基因和12S rRNA)的 20 個突變位點：GJB2 基因上的 35delG、167delT、176-191dell6、299_300delAT和 235delC突變；GJB3 基因上的 538C>T和 547G>A突變；SLC26A4 基因上的 281C>T、589G >A、IVS7-2A>GU174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2162C>T、 2168A>G和IVS15+5G>A突變；及線粒體DNA的 1494C>T和 1555A>G突變。
[0008] 耳聾基因檢測可W明確大部分遺傳性耳聾的原因，通過耳聾基因檢測結(jié)果的分 析，可W確定遺傳方式，計算耳聾再發(fā)風(fēng)險，對患者及其家庭成員的患病風(fēng)險、攜帶者風(fēng)險、 子代的再發(fā)風(fēng)險作出準(zhǔn)確評估與解釋。通過客觀、準(zhǔn)確的指導(dǎo)和干預(yù)措施，從根本上預(yù)防和 阻斷遺傳性耳聾，是實現(xiàn)預(yù)防耳聾出生缺陷目標(biāo)的重要步驟和手段。
[0009]基質(zhì)輔助激光解吸電離（matrixassistedlaserdeso;rpti〇]Vionization， MALDI)是一種脈沖式軟電離技術(shù)。經(jīng)電離的樣本從離子源轉(zhuǎn)送到質(zhì)量分析器內(nèi)進行分析， 得到分子量。由于MLDI離子源產(chǎn)生的離子常用飛行時間（timeoffli曲t，T(F)質(zhì)量分 析器來分析，所WMALDI常與TOF連在一起使用，稱為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 (MLDI-T0F-M巧。由于質(zhì)譜技術(shù)與多引物延伸技術(shù)和MassARRAY技術(shù)結(jié)合使用，可W在一 個反應(yīng)體系中同時檢測多個突變位點，大大減輕了工作量，提高了檢測通量，并降低了檢測 費用。
[0010] 本發(fā)明人應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)，通過設(shè)計PCR引物 和巧LEX?單堿基延伸引物而進行SNP基因型分析的一種高準(zhǔn)確性，高通量，低成本，快速的 檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種耳聾突變位點的檢測方法，該檢測方法是W基質(zhì)輔助激 光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)檢測基因組DNA，通過擴增20個耳聾疾病相關(guān)的SNP位 點，再進行單堿基延伸，使在SNP位點上延伸1個堿基。由于離子的質(zhì)量不同，則再根據(jù)在 真空小管中飛行的時間長短也不同，借W來判斷離子質(zhì)量的大小，從而判斷位點的基因型。
[0012] 為了實現(xiàn)本發(fā)明，采用了一下技術(shù)方案：
[001引 （1)可特異性的檢測基因組DM中的SNPs位點；
[0014] (2)針對一組特異性染色體SNPs位點進行多種PCR擴增的引物序列；
[0015] (3)針對一組特異性染色體SNPs位點進行多種PCR延伸的引物序列；
[0016] (4)W基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜方法檢測一組特異性染色體SNPs位 點。
[0017] 基于W上檢測方法又W下四步組成：
[001引 （1)合成引物序列：合成耳聾突變基因特異性SNPs位點的PCR擴增引物及單堿基 延伸引物序列；
[0019] (2)多重PCR擴增SNPs位點基因片段：通過多重擴增體系一次擴增覆蓋特異性 SNPs位點的耳聾突變基因片段；
[0020] (3)單堿基延伸SNPs位點：通過多重延伸體系一次延伸耳聾突變基因的SNPs位 占.
[0021] (4)上機檢測基因型：通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜方法，檢測數(shù)據(jù) 并分析各突變位點的基因型。
[002引根據(jù)本發(fā)明的PCR擴增引物和延伸引物，可一孔等效率的擴增多個SNP位點和延 伸多個SNP位點，針對該20個耳聾疾病相關(guān)位點，所使用的PCR擴增引物和單堿基延伸引 物分別是：針對GJB2基因上的rs80338939 (35delG)位點，PCR擴增引物是：
[0023] 5, -ACGTTGGATGGTCCTAGCTAGTGATTCCTG-3'（沈QIDNO:01);
[0024] 5' -ACGTTGGATGTCTGGGTTTTGATCTCCTCG-3'（沈QIDNO:02);
[0025] 單堿基延伸引物是：
[0026] 5' -TGCTAGTGGAGTGTTTGTTCACACCCCC-3'(沈QIDNO:03);
[0027] 針對GJB2基因上的rs80338942(167delT)位點，PCR擴增引物是：
[0028] 5, -ACGTTGGATGTCTGGGTTTTGATCTCCTCG-3'（沈QIDNO:04);
[0029] 5, -ACGTTGGATGGTCCTAGCTAGTGATTCCTG-3'（沈QIDNO:05);
[0030] 單堿基延伸引物是：
[0031] 5, -CCGACTTTGTCTGCAACACCC-3,（沈QIDNO:06);
[003引針對GJB2基因上的176_191dell6位點，PCR擴增引物是：
[0033] 5, -ACGTTGGATGGTCCTAGCTAGTGATTCCTG-3'（沈QIDNO:07);
[0034] 5, -ACGTTGGATGTCTGGGTTTTGATCTCCTCG-3'（沈QIDNO:08);
[0035] 單堿基延伸引物是：
[0036] 5, -GGAAGTAGTGATCGTAGC-3,（SEQIDNO:09);
[0037] 針對GJB2基因上的rs80338943(235delC)位點，PCR擴增引物是，
[0038] 5' -ACGTTGGATGGTCCTAGCTAGTGATTCCTG-3'（沈QIDNO:10);
[0039] 5' -ACGTTGGATGTCTGGGTTTTGATCTCCTCG-3'（沈QIDNO:11);
[0040] 單堿基延伸引物是：
[0041] 5, -AAGATCAGCTGCAGG-3,（沈QIDNO:12);
[0042]針對GJB2 基因上的rslll033204(299_300delAT)位點，PCR擴增引物是：
[0043] 5, -ACGTTGGATGGTCCTAGCTAGTGATTCCT