本發明屬于納米材料，具體涉及一種基于二氧化硅-稀土氟化物的富集增強型發光生物探針及其制備方法和應用。

背景技術：

1、癌癥是一種由異常細胞無限增殖和侵襲組織器官引起的疾病，嚴重威脅著人類的生命安全。在惡性腫瘤生長、侵襲和轉移過程中，某些癌癥標志物或癌細胞會釋放到血液、胸腔積液、腹水和尿液等體液中。這些癌癥標志物和脫落的癌細胞具有豐富的生物學信息，在癌癥發生、發展和治療等方面具有特定的生物學意義。在癌癥發生早期確診并及時治療可以顯著提高患者的生存率。然而，體液中癌癥標志物和癌細胞的稀少性以及細胞種類的復雜性給癌癥的早期診斷帶來了很大的困難。

2、熒光生物分析技術在科研及醫療機構已獲得廣泛應用。然而，傳統的熒光生物探針，如有機熒光染料及量子點等，易受到雜散光和生物組織自身熒光的干擾，導致生物檢測的靈敏度相對較低。例如公開號為cn115141219a，申請日為2022年6月29日的中國專利公開了一種用于卵巢癌細胞成像的熒光探針、合成方法及應用，該探針通過吡啶正離子功能化三芳基硼結構，其吡啶正離子不僅可以與dna和lpa結合，還可以作為吸電子基團調節其光物理性質。它可以選擇性地響應dna和lpa(溶血磷脂酸)，而不對atp、adp和amp等響應，且對dna和lpa具有不同的熒光信號輸出，但是該探針無法應用于其他癌細胞成像或癌癥標志物的識別，且當卵巢癌細胞含量較低時無法滿足超靈敏生物檢測的要求。公開號為cn103513025a，申請日為2012年6月21日的中國專利提供胃癌靶向量子點及其制備方法和應用，利用量子點在生物體內具有良好的生物相容性，能夠隨循環系統運行，制得靶向量子點對胃癌細胞進行免疫熒光成像，并將進一步檢測在胃癌動物模型的腫瘤轉移部位與腫瘤細胞結合，激發后發射熒光，使腫瘤細胞顯像，從而達到腫瘤檢測的目的。但該免疫熒光探針在應用過程中易受非特異性光線的干擾從而影響熒光信號的檢測，同時生物組織自身存在的熒光物質也會發出熒光與探針信號疊加，降低了信號特異性。

3、稀土離子由于具有豐富的能級結構，稀土摻雜的納米發光材料以其優異的物理化學性能近年來在眾多發光材料中脫穎而出，引起了廣泛的關注，在彩色顯示、生物醫療熒光標記、無機液體激光器等方向具有重大應用價值。利用稀土摻雜無機納米顆粒的長熒光壽命，結合時間分辨熒光探測技術可以有效地消除短壽命的背景熒光，實現無背景的超靈敏檢測。特別是氟化鈰(cef3)納米顆粒，因其ce3+離子獨特的4f-5d電偶極躍遷，表現出優異的敏化能力。在cef3納米顆粒中摻雜tb3+離子可以增強綠色發光，達到毫秒級長熒光壽命。迄今為止，大多數cef3納米顆粒的合成需要較長的反應時間、各種有機溶劑以及較高的溫度。所制備的納米顆粒通常尺寸較小且不均一，導致其單顆粒發光相對較弱且不均勻，無法滿足超靈敏生物檢測的要求。

4、因此，急需開發合成策略簡單且單顆粒發光強的高靈敏稀土摻雜氟化物發光生物探針。利用樹枝狀介孔二氧化硅對稀土氟化物的富集作用改善納米生物探針的單顆粒發光強度，設計出一種二氧化硅-稀土氟化物發光納米材料，通過對其表面功能化修飾實現癌癥標志物超靈敏檢測、癌細胞成像和癌細胞體外檢測等生物應用，對于癌癥的早期診斷和治療效果評估具有重要的參考價值和實用意義。

技術實現思路

1、為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種基于二氧化硅-稀土氟化物的富集增強型發光生物探針及其制備方法和應用，所述富集增強型發光生物探針具有熒光壽命長、單顆粒發光強、特異性靶向好的特點，在癌癥標志物的超靈敏檢測、癌細胞成像以及體外檢測領域具有廣闊的應用前景。

2、本發明的技術方案如下：

3、本發明的目的之一在于提供一種基于二氧化硅-稀土氟化物的富集增強型發光生物探針的制備方法，以樹枝狀介孔二氧化硅作為稀土氟化物限域生長的載體，利用樹枝狀介孔二氧化硅超大介孔的富集作用，使大量稀土氟化物納米顆粒在孔內原位限域生長，得到二氧化硅-稀土氟化物納米材料，而后在二氧化硅-稀土氟化物納米材料表面修飾靶向分子，制得基于二氧化硅-稀土氟化物的富集增強型發光生物探針。

4、進一步地，包括以下步驟：

5、s1、通過陰離子輔助合成法制備樹枝狀介孔二氧化硅納米顆粒，對表面進行羧基改性，制得表面為羧基基團的所述樹枝狀介孔二氧化硅；

6、s2、在所述樹枝狀介孔二氧化硅孔內通過靜電作用吸附稀土陽離子，引入氟化氫鈉nahf2使得稀土氟化物在孔內原位限域生長，形成二氧化硅-稀土氟化物納米材料；

7、s3、在s2所制得的二氧化硅-稀土氟化物納米材料溶液中引入靶向劑對其表面進行修飾，超聲離心后多次水洗并去除上清液，制得所述基于二氧化硅-稀土氟化物的富集增強型發光生物探針。

8、進一步地，所述s1包括以下步驟：

9、s11、在超純水中加入三乙醇胺60～90℃攪拌后，加入十六烷基三甲基溴化銨和水楊酸鈉至上述體系繼續攪拌反應1h，而后加入原硅酸四乙酯繼續攪拌反應2h，12000rpm離心5min后去除上清液；

10、其中超純水、三乙醇胺、十六烷基三甲基溴化銨、水楊酸鈉的質量比為6250:17:95:42；超純水與原硅酸四乙酯的體積比為25:4；

11、s12、將s11所制得的中間產物a分散于含有濃鹽酸的甲醇溶液中于40～90℃下攪拌均勻，12000rpm離心5分鐘后用無水乙醇洗三次，去除上清液；

12、其中濃鹽酸與甲醇的體積比為1:60；中間產物a與甲醇的質量比為3:350；

13、s13、將s12所制得的中間產物b分散于含有氨水和3-氨丙基三乙氧基硅烷的無水乙醇溶液中，室溫下攪拌12h，12000rpm離心5min后無水乙醇洗三次，去除上清液；

14、其中氨水、3-氨丙基三乙氧基硅烷、無水乙醇的體積比為3:1:150；中間產物b與無水乙醇的質量比為1:160；

15、s14、將s13所制得的中間產物c再次分散于含有琥珀酸酐的n,n-二甲基甲酰胺溶液中，室溫下攪拌6h，12000rpm離心5分鐘后無水乙醇洗三次，去除上清液并真空干燥，制得所述表面為羧基基團的所述樹枝狀介孔二氧化硅；

16、其中中間產物c、琥珀酸酐、n,n-二甲基甲酰胺的質量比為1:5:379；

17、所述樹枝狀介孔二氧化硅納米顆粒的粒徑為5～1000nm，孔徑為2～50nm。

18、進一步地，樹枝狀介孔二氧化硅納米顆粒的粒徑為100～300nm，孔徑為5～30nm。

19、進一步地，所述s2在含有稀土硝酸鹽的水溶液中加入s1所制得的樹枝狀介孔二氧化硅，超聲反應1～6min后加入氟化氫鈉nahf2水溶液繼續超聲1～6min，8000rpm離心3min后水洗三次，去除上清液制得二氧化硅-稀土氟化物納米材料；

20、所述樹枝狀介孔二氧化硅、稀土硝酸鹽和氟化氫鈉nahf2三者的質量比為1:35:5；

21、所述稀土陽離子為ce3+、tb3+、nd3+、eu3+中的任意一種或兩種組合。

22、進一步地，所述s3中所述靶向劑為生物素或親和素。

23、進一步地，當所述靶向劑為親和素時，修飾方法如下：

24、s31、在含有聚丙烯酸鈉的水溶液中加入s2所制得的二氧化硅-稀土氟化物納米材料，超聲30～35min后8000rpm離心5min并水洗三次，去除上清液；

25、s32、將s31所制得的中間產物d分散于含有1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽edc和n-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽nhs的緩沖溶液中，在200w超聲功率下反應20～25min，而后8000rpm離心5min，水洗三次，去除上清液；

26、s33、將s32所制得的中間產物e分散于4-羥乙基哌嗪乙磺酸hepes緩沖溶液中，加入親和素后在120rpm下渦旋反應30～35min，8000rpm離心5min后水洗三次，去除上清液，制得親和素修飾的所述基于二氧化硅-稀土氟化物的富集增強型發光生物探針；

27、其中聚丙烯酸鈉、二氧化硅-稀土氟化物納米材料、edc、nhs和親和素的質量比為8:2:2:1:0.12。

28、進一步地，親和素修飾的所述基于二氧化硅-稀土氟化物的富集增強型發光生物探針分散在含有2％牛血清白蛋白的水溶液中，4℃冰箱保存備用。

29、進一步地，當所述靶向劑為生物素時，修飾方法如下：

30、在1ml超純水溶液中加入氨水和生物素使二者混合均勻，而后加入s2所制得的二氧化硅-稀土氟化物納米材料，超聲30～35min后8000rpm離心5分鐘，水洗三次，去除上清液，制得生物素修飾的所述基于二氧化硅-稀土氟化物的富集增強型發光生物探針；

31、其中氨水、生物素、二氧化硅-稀土氟化物納米材料的質量比為9:4:1。

32、進一步地，生物素修飾的所述基于二氧化硅-稀土氟化物的富集增強型發光生物探針分散在超純水中，4℃冰箱保存備用。

33、本發明的目的之二在于提供一種基于二氧化硅-稀土氟化物的富集增強型發光生物探針。

34、本發明的目的之三在于提供一種基于二氧化硅-稀土氟化物的富集增強型發光生物探針在結合時間分辨熒光檢測技術體外檢測癌癥標志物中的應用。

35、本發明的目的之四在于提供一種基于二氧化硅-稀土氟化物的富集增強型發光生物探針在體外特異性識別癌細胞并基于熒光靶向癌細胞成像中的應用。

36、相較于現有技術，本發明的有益效果在于：

37、1、本發明首次創新了樹枝狀介孔二氧化硅作為稀土氟化物載體，采用原位富集策略使稀土氟化物納米顆粒在樹枝狀二氧化硅超大介孔內富集，實現大量稀土氟化物納米顆粒在孔內原位限域生長，極大地增強了納米發光材料的單顆粒發光強度。本發明克服了傳統稀土氟化物納米材料形態不規則、尺寸不均一、單顆粒發光弱的問題。

38、2、本發明利用了稀土氟化物獨特的毫秒級長壽命特性，并將其與時間分辨熒光探測技術相結合，有效區分了稀土氟化物的長壽命熒光信號與短壽命的背景熒光干擾，使得即使是在極低濃度下癌癥標志物也能被準確地檢測出來，實現了超靈敏的檢測效果，并大大提高了檢測的準確性和靈敏度。

39、3、本發明所制得的基于二氧化硅-稀土氟化物的富集增強型發光生物探針表面具有極高的功能化潛力，可根據具體的檢測需求在納米材料表面修飾各種靶向劑使其具備優異的靶向能力，拓寬該發光生物探針的應用范圍。同時該富集增強型發光生物探針具有單顆粒發光強的顯著優勢，在癌細胞靶向成像及體外特異性檢測中表現出色。