專利名稱：一種橄欖酚類天然抗氧化劑的制備方法
技術領域：
本發明提供了一種橄欖酚類天然抗氧化劑的制備方法，屬于添加劑加工制造技術領域。
背景技術：
橄欖(Canarium album Raeusch.)為我國南方特有的亞熱帶常綠果樹，與原產歐洲地中海地區的油橄欖(Oleaeuropaea L.)實為不同科屬的植物。橄欖果實又名青果，是我國傳統的藥食兩用資源，具有很高的藥用保健價值。據古代醫書記載，橄欖性味甘、酸、澀、 平，入肺、胃兩經，有清熱解毒、利咽化痰、生津止渴、健胃消食和除煩解酒等功能，對癌癥也有一定的療效。橄欖果實中含有大量的酚類化合物，現代藥學分析表明酚類化合物是橄欖主要的藥效成分。酚類化合物由于其分子結構中含有多個酚性羥基，具有較強的抗氧化作用和清除自由基的能力，對預防疾病和促進人體健康具有非常積極的作用，引起人們開發利用天然酚類化合物的極大興趣。從上世紀80年代末以來，在崇尚“追求自然”的消費觀念下，以酚類化合物為主的天然產物的開發利用開始興起，人們將酚類成分從天然資源中安全有效地提取出來并廣泛應用于制藥、食品、生化、日化、精細化工、營養、植保、功能高分子材料等多個領域。目前，有關橄欖酚類產品的工業化開發研究剛起步，主要還是集中在橄欖酚類成分的提取實驗研究上。常用的橄欖酚類提取方法有熱水浸提法、堿(石灰水)提取酸(鹽酸) 沉淀法、709Γ95%乙醇浸提法、甲醇常溫浸提法，超聲波輔助乙醇溶液提取法、微波輔助乙醇溶液提取法，常溫溶劑提取法一般提取時間在廣4 h，提取效率不高，而超聲波輔助提取在 0. 5^1 h左右，微波輔助提取法一般廣10 min，提取時間短，效率相對較高，相比于傳統的溶劑浸提法具有明顯的優勢。但是，經溶劑提取得到的僅為酚類粗提物，酚類含量一般在 40%以下，雜質較多，達不到抗氧化劑使用的實際要求。目前，也有相關研究者對橄欖酚類粗提物進行純化研究，如顏貽謙等人(CN 1333203A)通過往橄欖酚類乙醇粗提液中加入適量 AlCl3并調節pH值，使酚類絡合沉淀，然后加入HCl溶液溶解沉淀，再用乙酸乙酯多次萃取， 萃取液濃縮去除乙酸乙酯，并經真空干燥制得橄欖酚類產品，產品酚類含量達76%;傅遍紅在橄欖黃酮的提取制備工藝中，采用陽離子交換樹脂分離除去橄欖黃酮粗提液中的雜質， 制得橄欖黃酮產品，產品純度可達70% ；陳崗等人采用AB-8大孔樹脂對微波輔助提取的橄欖酚類提取液進行分離純化，以除去粗提液中的雜質。綜合而言，現有的橄欖酚類產品提取制備工藝還是存在提取效率不高、產品酚類得率及純度有待進一步提高的問題。因此，尋求更高效的提取方法及更適用于橄欖酚類吸附及解吸分離的專一性強的柱層析材料是制備高純度橄欖酚類抗氧化劑產品的關鍵。超聲波-微波協同萃取是近些年出現的一種新的提取技術，它在提取過程中，同時利用了超聲波振動的空化作用、機械攪拌作用和微波的高能作用，大大加快了提取進程， 彌補了單獨用超聲波或微波提取帶來的某些不足，具有高效、快速、能耗小等優點。聚酰胺樹脂是由酰胺鍵聚合形成的高分子化合物，其酰胺基可與羥基酚類、酸類、醌類、硝基等化合物以氫鍵形成結合而被吸附，其脂肪長鏈可作為分配層析的載體。聚酰胺層析樹脂特別適用于多元酚類化合物如黃酮、醌類、酚酸、含羰基化合物、羧基化合物的分離。而有關超聲波_微波協同萃取技術和聚酰胺樹脂層析方法應用于橄欖酚類化合物的研究尚未見文獻報道。

發明內容
本發明的目的提出一種橄欖酚類天然抗氧化劑的制備方法。以新鮮橄欖果實為原料，采用超聲-微波協同萃取技術提取橄欖中的酚類化合物，得到橄欖酚類粗提物，再通過聚酰胺樹脂層析柱對提取物進行分離純化，制備得到高純度的橄欖酚類抗氧化劑產品。本發明的技術方案一種橄欖酚類天然抗氧化劑的制備方法，以新鮮橄欖果實為原料，經選果、清洗、熱燙、去核、打漿、真空干燥、超聲_微波協同提取、真空濃縮、聚酰胺樹脂層析柱分離純化、真空濃縮、冷凍干燥等步驟制得橄欖酚類抗氧化劑產品。本發明方法具體包括以下步驟
1、選果、清洗選用我國橄欖科植物橄欖&albumRaeusch.的果實為原料，要求選用無霉變、無腐爛的新鮮橄欖果實，用清水清洗除去果實表面的泥沙和異物；
2、熱燙、去核將清洗干凈的橄欖鮮果放入沸水中熱燙;Γ5min，取出置于清水中冷卻， 然后破碎去核；
3、打漿破碎去核后的橄欖果肉立即加水進行打漿，果肉與水的質量比為1 0.5 1， 打漿后果漿顆粒粒徑控制在廣3 mm ；
4、真空干燥、粉碎將橄欖果漿置于真空干燥箱進行干燥，干燥后樣品粉碎，過2(Γ60 目篩得橄欖果肉粉；
5、超聲-微波協同提取橄欖酚類物質往橄欖果肉粉中加入質量濃度609Γ80%的食用級酒精溶液，橄欖果肉粉與酒精溶液的質量體積比(W/V)以g/mL計為1 1(Γ15，用超聲-微波協同萃取儀進行提取，超聲波頻率為40 KHz，功率為50 W，微波頻率為2450 MHz, 功率為10(Γ600 W，提取時間為0. 5^3 min，得橄欖酚類提取液；
6、真空濃縮橄欖酚類提取液經真空濃縮除去酒精得到酚類濃縮液，為橄欖酚類粗提取物；
7、聚酰胺樹脂層析柱分離純化用去離子水先將橄欖酚類濃縮液調整為酚類濃度廣2 g/100mL的橄欖酚類提取液，再上聚酰胺樹脂層析柱進行吸附，層析柱吸附飽和后，先用 2、倍于樹脂柱床體積的去離子水洗脫除去樣品中的糖、蛋白質等雜質，再用1.5 3倍于樹脂柱床體積、濃度為80、0%的食用級酒精溶液作為洗脫劑將酚類物質洗脫下來，收集橄欖酚類洗脫液；
8、真空濃縮、冷凍干燥橄欖酚類洗脫液經真空濃縮除去酒精溶液，并經冷凍干燥制備得到粉末狀橄欖酚類抗氧化劑產品，產品酚類含量高達88%以上，酚類得率70%以上。所述的真空干燥處理是50 60 ！的真空干燥，真空濃縮處理是45飛0°C的真空濃縮，所述的冷凍干燥處理是在-50 _55°C溫度下的冷凍干燥。本發明中橄欖酚類抗氧化劑產品的ABTS自由基清除能力測定按以下方法進行 (1)工作液制備用超純水將ABTS和高硫酸鉀分別溶解并混合，使其最終濃度分別為7
4mmol/L和2.45 mmol/L，在室溫、避光條件下放置16 h，形成ABTS自由基儲備液，使用前用 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)稀釋，使其在734 nm處吸光值為0. 700 士0. 020。(2) ABTS自由基清除能力測定將橄欖酚類抗氧化劑產品分別稀釋成不同酚類濃度的樣品溶液(0. 01、0. 02、0. 03、0. 05 和 0. 1 mg/mL)。將 0. 1 mL 樣品液與 3. 9 mL ABTSX 作液充分混合，30°C反應10 min后，于734 nm波長處測定吸光值Al，以超純水作空白測得吸光值AO。ABTS 自由基清除率=[(AO - Al) / AO] X 100%
本發明中橄欖酚類抗氧化劑產品的DPPH自由基清除能力測定按以下方法進行 (1)試劑配制配制1 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液，冷藏放置。使用前用無水乙醇稀釋10倍。(2) DPPH自由基清除能力測定將橄欖酚類抗氧化劑產品分別稀釋成不同酚類濃度的樣品溶液(0. 001、0. 005、0. 01、0. 02和0. 1 mg/mL)。將2 mL超純水及2 mL樣品液分別加入等體積的0.1 mmol/L DPPH溶液，震蕩混合，30°C條件下反應30 min后在517 nm測定吸光值，得到AO和Al。2 mL樣品液加入等體積無水乙醇同等條件下反應，測得吸光值A2。DPPH 自由基清除率=[1 — (Al — A2) / AO] X 100%
本發明中橄欖酚類抗氧化劑產品的OH自由基清除能力測定按以下方法進行 將橄欖酚類抗氧化劑產品分別稀釋成不同酚類濃度的樣品溶液(0. 01,0. 02,0. 05,0. 1 和0.2 mg/mL)。取5 mmol/L鄰二氮菲1.0 mL加入試管，再加入0. 2 mol/L、pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液2.0 mL和樣品溶液1.0 mL，充分混勻。再加入7. 5 mmol/L的FeSO4溶液1. 0 mL，并立即混勻。再加入0.1% H2O2 1.0 mL，混勻后37°C保溫1 h，于536 nm處測其吸光值 Al，以超純水作空白測得吸光值A0。OH 自由基清除率=[(AO - Al)/AO] X 100%
本發明中橄欖酚類抗氧化劑產品的總還原力測定按以下方法進行 (1)試劑配制10 mmol/L的Fe3+-三吡啶三吖嗪(TPTZ)儲備液(用40 mmol/L的鹽酸溶解)，20 mmol/L的FeCl3溶液和0. 3 mol/L的醋酸緩沖液(pH3. 6)以體積比1 1 10 混合，并在37°C下靜置1 h得FRAP工作液。(2)總還原力測定將橄欖酚類抗氧化劑產品分別稀釋成不同酚類濃度的樣品溶液(0. 01、0· 02、0· 05、0. 1 和 0. 2 mg/mL)。將 100 μ L 樣品液，300 μ L 超純水和 3 mL FRAP 工作液充分混合，在37°C反應30 min后，于593 nm處測定吸光值，以超純水作為空白對照。 以0-600 μ mol/L的6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃_2_羧酸(Trolox)標準溶液繪制標準曲線。樣品的還原能力以TEAC值(μ mol/L Trolox)表示。本發明的有益效果本發明提供了一種橄欖酚類天然抗氧化劑的制備方法。通過超聲波_微波協同萃取技術及聚酰胺樹脂層析柱分離純化，制備獲得高純度高得率的橄欖酚類抗氧化劑產品。本發明所得產品安全性高，具有比Vc和BHA更強的自由基清除能力及抗氧化活性，制備方法操作簡單，適合工業化生產，對于橄欖酚類資源的深度開發和橄欖加工業的發展具有極大的促進作用。


圖1橄欖酚類抗氧化劑產品的ABTS自由基清除能力圖1顯示，酚類濃度在0. 0Γ0. 1 mg/mL時，橄欖酚類抗氧化劑產品具有比常規抗氧化劑Vc和BHA更強的ABTS自由基清除能力，在0. 1 mg/mL時，橄欖酚類抗氧化劑產品ABTS 自由基清除率達99%以上，分別是Vc和BHA (丁基羥基茴香醚)的2. 3倍和1. 3倍。圖2橄欖酚類抗氧化劑產品的DPPH自由基清除能力
圖2顯示，酚類濃度在0. 00Γ0. 1 mg/mL時，橄欖酚類抗氧化劑產品DPPH自由基清除能力要強于常規抗氧化劑Vc和BHA，在0. 005 mg/mL時，橄欖酚類抗氧化劑產品DPPH自由基清除率即可達90%，0. 1 mg/mL時，DPPH自由基清除率達可達98%以上。圖3橄欖酚類抗氧化劑產品的OH自由基清除能力。
圖3顯示，酚類濃度在0.0廣0.2 mg/mL時，橄欖酚類抗氧化劑產品具有一定的OH自由基清除能力，清除率最高可達52%以上，分別是Vc和BHA的9倍和1. 2倍。圖4橄欖酚類抗氧化劑產品的總還原力
圖4顯示，酚類濃度在0. 0Γ0. 2 mg/mL時，橄欖酚類抗氧化劑產品的總還原力要強于常規抗氧化劑Vc和BHA，在0. 2 mg/mL,橄欖酚類抗氧化劑產品總還原力TEAC值達1721. 5 μ mol/L Trolox,分別是Vc和BHA的2. 5倍和1. 3倍，說明其具有很好的抗氧化活性。
具體實施例方式實施例1
以新鮮橄欖果實為原料，去除其中霉變、腐爛的壞果，用清水清洗除去果實表面的泥沙和異物，放入沸水中熱燙;Γ5 min，冷卻后破碎去核。去核后的橄欖果肉按果肉與水的質量比為1 0.5加水進行打漿，果漿顆粒粒徑控制在廣3 mm。將橄欖果漿進行真空干燥， 粉碎，過2(Γ60目篩得橄欖果肉粉。按果粉與酒精溶液的質量體積比(W/V)為1 10加入609Γ80%的食用級酒精溶液，用超聲-微波協同萃取儀進行酚類提取，超聲波頻率為40 KHz，功率為50 W，微波頻率為2450 MHz，功率為100 W，提取時間為3 min。橄欖酚類提取液經真空濃縮除去酒精得到橄欖酚類粗提取物，用去離子水將橄欖酚類粗提液酚類濃度調整為1 g/100mL，上聚酰胺樹脂層析柱進行吸附，吸附飽和后，先用2倍于樹脂柱床體積的去離子水洗脫除去樣品中的糖、蛋白等雜質，再用1. 5倍于樹脂柱床體積、濃度為809Γ90% 的食用級酒精溶液將柱中吸附的酚類物質洗脫下來，收集橄欖酚類洗脫液。洗脫液經真空濃縮除去酒精溶液，并經冷凍干燥制備得到粉末狀橄欖酚類抗氧化劑產品，產品酚類含量為88%，酚類得率為70%。實施例2
以新鮮橄欖果實為原料，去除其中霉變、腐爛的壞果，用清水清洗除去果實表面的泥沙和異物，放入沸水中熱燙;Γ5 min，冷卻后破碎去核。去核后的橄欖果肉按果肉與水的質量比為1 0.8加水進行打漿，果漿顆粒粒徑控制在廣3 mm。將橄欖果漿進行真空干燥， 粉碎，過2(Γ60目篩得橄欖果肉粉。按果粉與酒精溶液的質量體積比(W/V)為1 12加入609Γ80%的食用級酒精，用超聲-微波協同萃取儀進行酚類提取，超聲波頻率為40 KHz, 功率為50 W，微波頻率為2450 MHz，功率為300 W，提取時間為2 min。橄欖酚類提取液經真空濃縮除去酒精得到橄欖酚類粗提取物，用去離子水將橄欖酚類粗提液酚類濃度調整為 1. 5 g/100mL，上聚酰胺樹脂層析柱進行吸附，吸附飽和后，先用3倍于樹脂柱床體積的去離子水洗脫除去樣品中的糖、蛋白等雜質，再用2倍于樹脂柱床體積、濃度為809Γ90%的食用級酒精溶液將柱中吸附的酚類物質洗脫下來，收集橄欖酚類洗脫液。洗脫液經真空濃縮除去酒精溶液，并經冷凍干燥制備得到粉末狀橄欖酚類抗氧化劑產品，產品酚類含量為89%， 酚類得率為71%。實施例3
以新鮮橄欖果實為原料，去除其中霉變、腐爛的壞果，用清水清洗除去果實表面的泥沙和異物，放入沸水中熱燙;Γ5 min，冷卻后破碎去核。去核后的橄欖果肉按果肉與水的質量比為1 1加水進行打漿，果漿顆粒粒徑控制在廣3 mm。將橄欖果漿進行真空干燥，粉碎，過 20^60目篩得橄欖果肉粉。按果粉與酒精溶液的質量體積比(W/V)為1 15加入609Γ80% 的食用級酒精，用超聲-微波協同萃取儀進行酚類提取，超聲波頻率為40 KHz，功率為50 W，微波頻率為2450 MHz，功率為450 W，提取時間為1 min。橄欖酚類提取液經真空濃縮除去酒精得到橄欖酚類粗提取物，用去離子水將橄欖酚類粗提液酚類濃度調整為2 g/100mL, 上聚酰胺樹脂層析柱進行吸附，吸附飽和后，先用4倍于樹脂柱床體積的去離子水洗脫除去樣品中的糖、蛋白等雜質，再用3倍于樹脂柱床體積、濃度為809Γ90%的食用級酒精溶液將柱中吸附的酚類物質洗脫下來，收集橄欖酚類洗脫液。洗脫液經真空濃縮除去酒精溶液， 并經冷凍干燥制備得到粉末狀橄欖酚類抗氧化劑產品，產品酚類含量為91%，酚類得率為 73%。實施例4
以新鮮橄欖果實為原料，去除其中霉變、腐爛的壞果，用清水清洗除去果實表面的泥沙和異物，放入沸水中熱燙;Γ5 min，冷卻后破碎去核。去核后的橄欖果肉按果肉與水的質量比為1 :1加水進行打漿，果漿顆粒粒徑控制在廣3 mm。將橄欖果漿進行真空干燥，粉碎，過 2(Γ60目篩得橄欖果肉粉。按果粉與酒精溶液的質量體積比(W/V)為1 12加入609Γ80%的食用級酒精，用超聲-微波協同萃取儀進行酚類提取，超聲波頻率為40 KHz，功率為50 W, 微波頻率為2450 MHz，功率為600 W，提取時間為0.5 min。橄欖酚類提取液經真空濃縮除去酒精得到橄欖酚類粗提取物，用去離子水將橄欖酚類粗提液酚類濃度調整為1.5 g/100mL, 上聚酰胺樹脂層析柱進行吸附，吸附飽和后，先用4倍于樹脂柱床體積的去離子水洗脫除去樣品中的糖、蛋白等雜質，再用2. 5倍于樹脂柱床體積、濃度為809Γ90%的食用級酒精溶液將柱中吸附的酚類物質洗脫下來，收集橄欖酚類洗脫液。洗脫液經真空濃縮除去酒精溶液，并經冷凍干燥制備得到粉末狀橄欖酚類抗氧化劑產品，產品酚類含量為90%，酚類得率為 72%。
權利要求
1.一種橄欖酚類天然抗氧化劑的制備方法，其特征是以新鮮橄欖果實為原料，經選果、 清洗、熱燙、去核、打漿、真空干燥、粉碎，超聲-微波協同提取、真空濃縮、聚酰胺樹脂層析柱分離純化、真空濃縮、冷凍干燥步驟制成橄欖酚類抗氧化劑產品，所述方法包括如下步驟(1)選果、清洗選用我國橄欖科植物橄欖C^ari album Raeusch.的果實為原料， 要求選用無霉變、無腐爛的新鮮橄欖果實，用清水清洗除去果實表面的泥沙和異物；(2)熱燙、去核將清洗干凈的橄欖鮮果放入沸水中熱燙;Γ5min，取出置于清水中冷卻，然后破碎去核；(3)打漿破碎去核后的橄欖果肉立即加水進行打漿，果肉與水的質量比為1 0.5 1， 打漿后果漿顆粒粒徑控制在廣3 mm ；(4)真空干燥、粉碎將橄欖果漿置于真空干燥箱進行干燥，干燥后樣品粉碎，過2(Γ60 目篩得橄欖果肉粉；(5)超聲-微波協同提取橄欖酚類物質往橄欖果肉粉中加入質量濃度609Γ80%的食用級酒精溶液，橄欖果肉粉與酒精溶液的質量體積比以g/mL計為1 1(Γ15，用超聲-微波協同萃取儀進行提取，超聲波頻率為40 KHz，功率為50 W，微波頻率為M50 MHz，功率為 100^600 W，提取時間為0. 5 3 min，得橄欖酚類提取液；(6)真空濃縮橄欖酚類提取液經真空濃縮除去酒精得到酚類濃縮液，為橄欖酚類粗提取物；(7)聚酰胺樹脂層析柱分離純化用去離子水先將橄欖酚類濃縮液調整為酚類濃度 Γ2 g/100mL的橄欖酚類提取液，再上聚酰胺樹脂層析柱進行吸附，層析柱吸附飽和后，先用2、倍于樹脂柱床體積的去離子水洗脫除去樣品中的糖、蛋白質雜質，再用1. 5 3倍于樹脂柱床體積、濃度為809Γ90%的食用級酒精溶液作為洗脫劑將酚類物質洗脫下來，收集橄欖酚類洗脫液；(8)真空濃縮、冷凍干燥橄欖酚類洗脫液經真空濃縮除去酒精溶液，并經冷凍干燥制備得到粉末狀橄欖酚類抗氧化劑產品，產品酚類含量高達88%以上，酚類得率70%以上。
2.根據權利要求1所述的橄欖酚類天然抗氧化劑的制備方法，其特征是步驟(4)所述的真空干燥處理是5(T60°C的真空干燥，步驟(6)和步驟(8)的真空濃縮處理是45飛0°C的真空濃縮，步驟(8)所述的冷凍干燥處理是在-50 _55°C溫度下的冷凍干燥。
全文摘要
一種橄欖酚類天然抗氧化劑的制備方法，屬于添加劑加工制造技術領域。本發明以新鮮橄欖果實為原料，經選果、清洗、熱燙、去核、打漿、真空干燥、粉碎，然后用超聲-微波協同提取技術提取橄欖果肉漿中的酚類化合物，得到橄欖酚類粗提物，再通過聚酰胺樹脂層析柱對提取物進行分離純化，酚類洗脫液經真空濃縮、冷凍干燥，制備得到酚類含量在88%以上的橄欖酚類抗氧化劑產品。本發明方法制得的酚類抗氧化劑產品天然、無毒，具有比Vc和BHA更強的自由基清除能力及抗氧化活性，可廣泛應用于食品、保健品、藥品、化妝品及日用品領域。
文檔編號B01D15/42GK102504823SQ20111034981
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月8日 優先權日2011年11月8日
發明者何志勇, 馮英委, 曾茂茂, 王林祥, 秦昉, 陳潔, 陶冠軍 申請人:江南大學