專利名稱：一種基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測傳感器的制作方法
技術領域：
本發明涉及銅離子檢測領域，具體涉及脫氧核酶水凝膠在銅離子檢測傳感器中的用途。
背景技術：
銅是人類最早使用的金屬，銅離子廣泛存在于自然界，銅離子也是人類必需的微量元素，但是銅超標對人體的危害也很大，主要是由重金屬離子銅帶來的危害。當人體內殘存了大量的重金屬之后，急易對身體內的臟器造成負擔，特別是肝和膽，當這兩種器官出現問題后，維持人體內的新陳代謝就會出現紊亂，肝硬化，肝腹水甚至更為嚴重。美國環境保護局對飲用水中銅離子的檢測濃度要求是不高于20 μ Mo傳統對于銅離子的檢測采用的是原子吸收或ICP-MS等復雜、昂貴的儀器。采用脫氧核酶(DNAzyme)水凝膠體系對高靈敏檢測水中銅離子的含量的應用存在巨大的潛力。本發明提供脫氧核酶水凝膠在銅離子檢測中的用途。本發明可實現銅離子的快速檢測，在不需要昂貴復雜儀器設備的同時還具有很高的選擇性、測定速度快等優點。

發明內容
本發明提供一種基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測傳感器，脫氧核酶(DNAzyme) 水凝膠使得銅離子檢測傳感器具有很高的選擇性和測定速度快等優點。為了實現上述目的，本發明的解決方案如下
一種基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測傳感器，包括脫氧核酶水凝膠，脫氧核酶水凝膠是由甲基丙烯基團修飾的底物鏈和甲基丙烯基團修飾的脫氧核酶通過堿基互補配對交聯形成的三維網狀的水凝膠，并且在水凝膠上包裹有金納米顆粒。為了更好地理解本發明的實質，下面結合具體實例描述脫氧核酶水凝膠在銅離子檢測中的應用。脫氧核酶水凝膠的制備過程如下
1)合成丙烯酸亞磷酰胺單體
丙烯酸亞磷酰胺單體的合成分為三個步驟a)將Ig 6-氨基-1-己醇，2. 36mL三乙胺加入IOOmL 二氯甲烷中冰浴，在無水無氧條件下逐滴加入2. 67g甲基丙烯酰氯，在室溫條件下攪拌反應2小時；b)將溶劑旋干，向產物中加入IOmL乙醇和15%Na0H，將產物選擇性水解成6-異氰酸根合己基-甲基丙烯酰氯，再用硅膠柱分離純化；c)將0. 50g純化后的6-異氰酸根合己基-甲基丙烯酰氯溶于IOmL無水二氯甲烷中，在0° C條件下逐滴加入0. 98g N, N- 二異丙基乙胺，再逐滴加入0. 87ml 2-氰乙基N，N- 二異丙基氯代亞磷酰胺，在冰浴上反應2小時；將溶劑旋干后，將產物用乙酸乙酯環己烷三乙胺40:60:3的洗脫液在硅膠柱上洗脫，得到的終產物為無色油狀液體；
2)甲基丙烯基團修飾的底物鏈和脫氧核酶的合成與純化
5 ‘端標記的底物鏈和脫氧核酶用CPG作為固相載體，使用DNA單體在DNA合成儀上從3'端開始合成，最后在5'端修飾步驟1)中合成的丙烯酸亞磷酰胺單體；合成結束后，將上述CPG轉移至anl Eppendorf管中，加入0. 5 mL 25 %的氨水在65°C下氨解8 hr，使DNA 從CPG上切割下來；氨解完畢取上清液進行酒精沉淀，加入0. 1倍體積的3M NaCl和3倍體積的乙醇在-20° C冰箱中靜置20min，將得到的沉淀去除上層清液，再將沉淀溶于0. IM的醋酸三乙胺溶液中，用0. 22 μ m的濾膜過濾，再用高效液相色譜儀進行純化；
3)底物鏈和脫氧核酶分別與丙烯酰胺單體聚合形成線性高分子鏈
將經過步驟2)經甲基丙烯基團修飾的底物鏈和經甲基丙烯基團修飾的脫氧核酶分別溶解到含4%丙烯酰胺單體的50mM HEPES緩沖溶液中，抽真空lOmin，再向體系中加入終體積1. 4%的10%過硫酸銨和終體積1. 4%的5%四甲基乙二胺中，再次抽真空IOmin ；底物鏈和脫氧核酶分別與丙烯酰胺單體聚合形成線性高分子鏈；
4)金納米的修飾
取1. 5mL合成好的金納米顆粒于1. 5mL離心管中，再向管中加入質量體積比為1. 5%的牛血清蛋白；金納米和牛血清蛋白孵育2-3小時之后，離心并去除上清液，將下層重新溶于水中就得到保護的金納米粒子；
5)脫氧核酶水凝膠的制備
將10 μ L兩條聚合好的DNA聚丙烯酰胺加入1/10體積的牛血清蛋白封閉的金納米顆粒，振蕩混勻后，再將兩條聚合鏈混合，將混合后的溶液置于60° C干浴器中IOmin后自然冷卻至室溫，得到包裹金納米顆粒的脫氧核酶水凝膠。脫氧核酶/底物鏈序列選擇性的驗證為了驗證該體系中銅離子對脫氧核酶/底物鏈的切割是由于脫氧核酶/底物鏈序列特異性識別所導致，而不是銅離子對序列的隨機切割形成的，合成一條于底物鏈完全互補的甲基丙烯基團修飾的cDNA作為參照。由于DNA 雙鏈之間的堿基互補配對，底物鏈和底物鏈的cDNA也可以形成穩定的DNA水凝膠。通過實驗得出，底物鏈和底物鏈cDNA形成的水凝膠和脫氧核酶水凝膠在加入銅離子之前與上層的反應溶液都能形成明顯的膠-溶液界面，但是在兩個體系中都加入銅離子之后，底物鏈/ cDNA水凝膠的體系對目標物沒有響應，仍然保持著膠的狀態，可是對于脫氧核酶水凝膠，在銅離子加入之后，整個膠就瓦解，整個體系變成溶液狀態，并且隨著金納米的擴散，原來體系中下層是酒紅色的水凝膠逐漸擴散開來，酒紅色的溶液擴散到這個體系中來。這種明顯的變化用肉眼就可以清楚地分辨出來，不需要任何復雜，昂貴的儀器。脫氧核酶水凝膠的動力學研究金納米顆粒在波長520nm處有較強的吸收，用紫外/可見分光光度計在不同時段檢測波長520nm處的吸收可以對整個體系的反應動力學進行研究。實驗中可以得到，當銅離子在100 μ M水平時，整個膠在大約1.5小時就完全瓦解， 說明該系體系不僅方便可視化檢測，并且對目標物具有較快的響應。需要指出，銅離子濃度對整個體系的反應速度也有影響。當銅離子濃度提高至10mM，整個反應在15min就可完全反應。如果反應過夜，即使在5 μ M的水平，水凝膠也能有所響應。脫氧核酶水凝膠的可視化檢測限雖然不同濃度的銅離子對這個體系瓦解的響應時間不同，但是在某一相同的時間，不同濃度的銅離子對膠的瓦解程度是不同的。通過實驗可以得到，在1. 5小時內，100 μ M的銅離子可以將10 μ L的脫氧核酶完全瓦解，而隨著對銅離子濃度的降低，水凝膠瓦解的比例呈梯度逐漸減少，當檢測濃度處于10 μ M時，大約只有 10%水凝膠瓦解。這使得水凝膠體系可以定量或者半定量的檢測溶液中銅離子的濃度。美國環境保護局對飲用水中銅離子的檢測濃度要求是不高于20 μ Μ,因此該水凝膠體系對高靈敏檢測水中銅離子的含量的應用存在巨大的潛力。 本發明脫氧核酶水凝膠在銅離子檢測中的應用，可作為可視化銅離子檢測傳感器中的應用，具體為
一種可用于檢測銅離子的脫氧核酶水凝膠檢測傳感器，該傳感器由1.5mL離心管裝載制備好的脫氧核酶水凝膠緩沖體系(表示為Al，下同)組成。它用于測定水樣中銅離子殘留的測定方法為
1)將 οομL待測水樣用移液器加入脫氧核酶水凝膠緩沖體系上部的緩沖液層，置于 37°C干浴器中，用吸管輕輕吸打緩沖液層，使緩沖液與加入的待測水樣均勻混合；
2)將加入了待測水樣的脫氧核酶水凝膠緩沖體系于37°C干浴器中放置1.5小時，并用肉眼觀察體系中下層酒紅色的水凝膠是否逐漸擴散開來；
3)目測結果，陰性樣品在脫氧核酶水凝膠可視化檢測傳感器中，上下次酒紅色水凝膠不擴散，陽性樣品下層酒紅色水凝膠均勻擴散至上層緩沖液體系；
4)銅離子檢測傳感器中加入IOOyL已知道濃度的銅離子水溶液，銅離子濃度小于 1000 μ M，重復步驟1)和步驟2)；
5)步驟2)和步驟4)中的脫氧核酶水凝膠檢測傳感器下層酒紅色水凝膠的擴散瓦解程度，擴散瓦解程度大的樣品銅離子的含量高。本發明中的銅離子檢測方法可通過目測結果，簡單直觀，因此可用于研制銅離子可視化檢測傳感器。脫氧核酶-水凝膠應用于銅離子檢測的工作原理為首先將銅離子的脫氧核酶裁剪成兩段，一條底物鏈，另一條是酶鏈，將裁剪的兩段單鏈DNA修飾上丙烯酰胺單體。再將修飾好的底物鏈和脫氧核酶分別和丙烯酰胺單體聚合，使這兩段DNA嵌入到丙酰胺聚合鏈中。接下來把這兩段高聚物混合，在堿基互補配對的作用下，兩段DNA雜交，將兩段高聚物交聯在一起，使整個體系形成具有三維網狀的水凝膠結構，這個體系也由溶液態變為凝膠狀。底物鏈和脫氧核酶形成的雜交結構同時具有剛性結構，這種剛性結構也為包埋物質提供了空間。當向凝膠體系中加入銅離子，銅離子便會識別由底物鏈和脫氧核酶形成的雜交結構；底物鏈在銅離子作用下被切割，脫氧核酶/底物鏈之間的雜交也被破壞，水凝膠的三維結構也隨之消失，整個體系又從凝膠狀變為溶液態。這種狀態的改變是可以通過指示劑的加入直接通過肉眼就可以觀察。本發明的優點在于本發明可對水樣中銅離子含量留進行定性及半定量檢測，本發明應用于銅離子檢測的傳感器具有操作簡便、快速、經濟等優點，非常適用于現場檢測和試驗室對批量樣品粗篩。
具體實施例方式實施例1 基于脫氧核酶-水凝膠的銅離子傳感器的制備方法 1、丙烯酸亞磷酰胺單體的合成
丙烯酸亞磷酰胺單體的合成分為三個步驟1)將6-氨基-1-己醇(lg，8，53mmol)，三乙胺(2. 36mL, 17mmol)加入IOOmL 二氯甲烷中冰浴，在無水無氧條件下逐滴加入甲基丙烯酰氯(2. 67g，2. 55mmol)，之后整個體系在室溫條件下攪拌反應2小時。2)之后將溶劑旋干，向產物中加入IOmL乙醇和15%Na0H (4mL)將產物選擇性水解成6-異氰酸根合己基-甲基丙烯酰氯。將6-異氰酸根合己基-甲基丙烯酰氯用乙酸乙酯在硅膠柱分離之后進行下一步反應。3)將純化后的6-異氰酸根合己基-甲基丙烯酰氯(0. 50g，2. 70mmol)溶于IOmL 無水二氯甲烷中，在0° C條件下逐滴加入N，N-二異丙基乙胺(DIPEA，0.98g，7. 5mmol)，再逐滴加入2-氰乙基N，N- 二異丙基氯代亞磷酰胺(0. 87ml, 3. 25mmol),在冰浴上反應2小時。將溶劑旋干后，將產物用乙酸乙酯環己烷三乙胺40:60:3的洗脫液在硅膠柱上洗脫。得到的終產物為無色油狀液體。終產物的核磁表征數據如下1H NMR (CDC13) 5 5. 92 (br, 1H)，5.63 (m, 1H)，5. 27 (m. 1H)，3.86-3. 72 (m, 2H)，3.66-3.49 (m, 4H)， 3. 30-3. 23 (m, 2H)，2. 61 (t, 2H)，1. 92 (m, 3H)，1. 58-1. 50 (m, 4H) 1.37—1.32 (m, 4H) 1. 17-1. 13 (m, 12H). 13C NMR (CDC13) δ 168.6, 140.4，119.3，118.0，63.8, 63. 6，58. 6，58. 3，43. 2，43. 1，39. 8，31. 3，29. 7，26. 8，25. 8，24. 9，24. 8，24. 7， 19. 0. 31Ρ (CDC13) δ 148.
2、甲基丙烯基團修飾的底物鏈和脫氧核酶的合成與純化
5'端標記的底物鏈和脫氧核酶用普通CPG作為固相載體，使用DNA單體在DNA合成儀上從3'端開始合成，最后在5'端修飾上前節中合成的丙烯酸亞磷酰胺單體。具體合成的序列見表3. 3。合成結束后，將上述CPG轉移至2ml潔凈滅菌的Eppendorf管中，加入0. 5 mL 25 %的氨水在65°C下氨解8 hr，使DNA從CPG上切割下來。氨解完畢取上清液進行酒精沉淀，加入0. 1倍體積的3M NaCl和3倍體積的乙醇在-20° C冰箱中靜置20min，將得到的沉淀產物在HOOOrpm條件下去除上清，再將沉淀溶于0. IM的醋酸三乙胺溶液中，用 0. 22 μ m濾膜過濾。用高效液相色譜儀進行純化；
3、底物鏈和脫氧核酶與丙烯酰胺的聚合
將修飾好的底物鏈和脫氧核酶(DNAzyme )分別溶解到含4%丙烯酰胺單體的50mM HEPES (3M NaCl，pH7.0)緩沖溶液中，DNA的終濃度為ImM。抽真空lOmin，再向體系中加入終體積1. 4%的10%過硫酸銨(0. 05g溶于0. 5mL)和終體積1. 4%的5%四甲基乙二胺(25 μ L 溶于0. 5mL)中，再次抽真空lOmin。此時底物鏈和脫氧核酶分別與丙烯酰胺單體聚合形成線性高分子鏈；
4、金納米的修飾
金納米的修飾高鹽體系和丙烯酰胺單體中的自由基能讓金納米團聚，因此需要對金納米進行封閉保護。保護方法如下取1.5mL合成好的金納米顆粒于1.5mL離心管中，再向管中加如質量體積比為1.5%的牛血清蛋白(BSA)。金納米和BSA孵育2-3小時之后， HOOOrpm離心，去除上清液，將下層物質重新溶于水中就得到保護的金納米粒子；
5、脫氧核酶水凝膠的制備
將兩條聚合好的DNA聚丙烯酰胺(10 μ L)分別加入1/10體積的BSA封閉的金納米顆粒(1 μ L)，振蕩混勻后，再將兩條聚合鏈混合，將混合后的溶液置于60° C干浴器中IOmin 后自然冷卻至室溫，就得到包裹金納米顆粒的脫氧核酶水凝膠。
實施例2 應用脫氧核酶水凝膠生物傳感器檢測水樣中含有銅離子
IOOyL待測水樣用移液器加入脫氧核酶水凝膠生物傳感器上部的緩沖液層，置于 37°C干浴器中，用吸管輕輕吸打緩沖液層，使緩沖液與加入的待測水樣均勻混合。于37°C干浴器中放置1. 5小時，并用肉眼觀察體系中下層酒紅色的水凝膠是否逐漸擴散開來。若下層酒紅色水凝膠均勻擴散至上層緩沖液體系，則該水樣中含有銅離子。若脫氧核酶水凝膠可視化檢測傳感器中上下次酒紅色水凝膠不擴散，則該水樣中沒含有銅離子。實施例3 應用脫氧核酶水凝膠生物傳感器半定量檢測水樣中含有銅離子的濃度
同時將100 μ L待測水樣和100 μ L標準銅離子水溶液(濃度要求小于1000 μ Μ)于分別用移液器加入兩個脫氧核酶水凝膠生物傳感器上部的緩沖液層，置于37°c干浴器中，用吸管輕輕吸打緩沖液層，使緩沖液與加入的待測水樣均勻混合。于37°C干浴器中放置1. 5小時，并用肉眼觀察體系中下層酒紅色的水凝膠擴散程度，若加入待測水樣的傳感器中的水凝膠擴散瓦解程度大，則該水樣中的銅離子的含量高于標準銅離子水溶液的含量，否則其銅離子含量則低于標準銅離子水溶液的含量。實施例4 應用脫氧核酶水凝膠生物傳感器檢測其他金屬離子的響應
為了考察其他金屬離子對脫氧核酶水凝膠是否有響應，本實驗選擇Cu2+，Na+, K+, Mg2+，Ca2+，Fe3+, Hg2+，Pb2+, Cd2+作為考察對象，并且這些離子濃度10倍于銅離子。實驗中可得出，在所有考察的金屬中，只有銅離子能將脫氧核酶水凝膠瓦解，而其他的金屬離子對銅離子的脫氧核酶體系沒有響應。這充分證明該體系能夠不受其他體系的干擾，顯示了其能在復雜體系中應用的潛力?？梢岳斫?，很多細節的變化是可能的，但這并不因此違背本發明的范圍和精神，任何所屬技術領域的普通技術人員對其所做的適當變化，皆應視為不脫離本發明專利的范
權利要求
1.一種基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測傳感器，其特征在于包括脫氧核酶水凝膠， 所述脫氧核酶水凝膠是由甲基丙烯基團修飾的底物鏈和甲基丙烯基團修飾的脫氧核酶通過堿基互補配對交聯形成的三維網狀的水凝膠，且在水凝膠上包裹有金納米顆粒。
2.根據權利要求1所述的一種基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測傳感器，其特征在于所述脫氧核酶水凝膠的制備方法包括如下步驟1)合成丙烯酸亞磷酰胺單體丙烯酸亞磷酰胺單體的合成分為三個步驟a)將Ig 6-氨基-1-己醇，2. 36mL三乙胺加入IOOmL 二氯甲烷中冰浴，在無水無氧條件下逐滴加入2. 67g甲基丙烯酰氯，在室溫條件下攪拌反應2小時；b)將溶劑旋干，向產物中加入IOmL乙醇和15%Na0H，將產物選擇性水解成6-異氰酸根合己基-甲基丙烯酰氯，再用硅膠柱分離純化；c)將0. 50g純化后的6-異氰酸根合己基-甲基丙烯酰氯溶于IOmL無水二氯甲烷中，在0° C條件下逐滴加入0. 98g N, N- 二異丙基乙胺，再逐滴加入0. 87ml 2-氰乙基N，N- 二異丙基氯代亞磷酰胺，在冰浴上反應2小時；將溶劑旋干后，將產物用乙酸乙酯環己烷三乙胺40:60:3的洗脫液在硅膠柱上洗脫，得到的終產物為無色油狀液體；2)甲基丙烯基團修飾的底物鏈和脫氧核酶的合成與純化5'端標記的底物鏈和脫氧核酶用CPG作為固相載體，使用DNA單體在DNA合成儀上從 3'端開始合成，最后在5'端修飾步驟1)中合成的丙烯酸亞磷酰胺單體；合成結束后，將上述CPG轉移至anl Eppendorf管中，加入0. 5 mL 25 %的氨水在65°C下氨解8 hr，使DNA 從CPG上切割下來；氨解完畢取上清液進行酒精沉淀，加入0. 1倍體積的3M NaCl和3倍體積的乙醇在-20° C冰箱中靜置20min，將得到的沉淀去除上層清液，再將沉淀溶于0. IM的醋酸三乙胺溶液中，用0. 22 μ m的濾膜過濾，再用高效液相色譜儀進行純化；3)底物鏈和脫氧核酶分別與丙烯酰胺單體聚合形成線性高分子鏈將經過步驟2)經甲基丙烯基團修飾的底物鏈和經甲基丙烯基團修飾的脫氧核酶分別溶解到含4%丙烯酰胺單體的50mM HEPES緩沖溶液中，抽真空lOmin，再向體系中加入終體積1. 4%的10%過硫酸銨和終體積為1. 4%的5%四甲基乙二胺中，再次抽真空IOmin ；底物鏈和脫氧核酶分別與丙烯酰胺單體聚合形成線性高分子鏈；4)金納米的修飾取1. 5mL合成好的金納米顆粒于1. 5mL離心管中，再向管中加入質量體積比為1. 5%的牛血清蛋白；金納米和牛血清蛋白孵育2-3小時之后，離心并去除上清液，將下層重新溶于水中就得到保護的金納米粒子；5)脫氧核酶水凝膠的制備將10 μ L兩條聚合好的DNA聚丙烯酰胺加入1/10體積的牛血清蛋白封閉的金納米顆粒，振蕩混勻后，再將兩條聚合鏈混合，將混合后的溶液置于60° C干浴器中IOmin后自然冷卻至室溫，得到包裹金納米顆粒的脫氧核酶水凝膠。
3.根據權利要求1所述的一種基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測傳感器，其特征在于它用于測定水樣中銅離子殘留的測定方法為1)將 οομL待測水樣用移液器加入脫氧核酶水凝膠緩沖體系上部的緩沖液層，置于 37°C干浴器中，用吸管輕輕吸打緩沖液層，使緩沖液與加入的待測水樣均勻混合；2)將加入了待測水樣的脫氧核酶水凝膠緩沖體系于37°C干浴器中放置1.5小時，并用肉眼觀察體系中下層酒紅色的水凝膠是否逐漸擴散開來；3)目測結果，陰性樣品在脫氧核酶水凝膠檢測傳感器中，上下次酒紅色水凝膠不擴散， 陽性樣品下層酒紅色水凝膠均勻擴散至上層緩沖液體系；4)銅離子檢測傳感器中加入IOOyL已知道濃度的銅離子水溶液，銅離子濃度小于 1000 μ M，重復步驟1)和步驟2)；5)步驟2)和步驟4)中的脫氧核酶水凝膠檢測傳感器下層酒紅色水凝膠的擴散瓦解程度，擴散瓦解程度大的樣品銅離子的含量高。
全文摘要
本發明公開一種基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測傳感器，其特征在于包括脫氧核酶水凝膠，所述脫氧核酶水凝膠是由甲基丙烯基團修飾的底物鏈和甲基丙烯基團修飾的脫氧核酶通過堿基互補配對交聯形成的三維網狀的水凝膠，并且在水凝膠上包裹有金納米顆粒。本發明同時公開基于脫氧核酶水凝膠的銅離子檢測傳感器中脫氧核酶水凝膠的制備方法，以及傳感器定性及半定量檢測水樣中銅離子含量的方法。本發明可實現銅離子的快速檢測，在不需要昂貴復雜儀器設備的同時還具有很高的選擇性、測定速度快等優點，非常適用于現場檢測和試驗室對批量樣品粗篩。
文檔編號G01N33/00GK102507877SQ201110362558
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者吳敏, 周昱, 張志剛, 徐敦明, 方恩華, 楊朝勇 申請人:廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心