一種新城疫病毒偽型病毒的制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新城疫病毒偽型病毒的制備方法以及偽型病毒的用途，制備方法包括（1）攜帶F、HN基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建；（2）整合有新城疫病毒囊膜蛋白的偽型病毒NDV-PP的制備。其中，擴增F基因和HN基因的兩對引物分別為F-sense與F-antisense、HN-sense與HN-antisense，引物序列分別為SEQ?ID?No.1與SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.3與SEQ?ID?No.4。本發(fā)明擬建立一種敏感、快速、適合大批樣本檢測的新城疫病毒中和抗體檢測方法，以期替代傳統(tǒng)的中和抗體檢測手段，為疫病的快速診斷、疫苗效果評價等提供有益工具。
【專利說明】一種新城疫病毒偽型病毒的制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新城疫病毒偽型病毒的制備方法和用途，屬于病毒的制備與應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]新城疫是一種可引起多種禽類發(fā)生群體死亡的急性、高度接觸性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須通報的疫病。對其進行迅速、準(zhǔn)確的血清學(xué)診斷不僅可以有效評價動物機體的感染狀態(tài)，也是控制該病流行的必要前提。目前對該病常用的血清學(xué)診斷方法包括血凝抑制試驗(HI)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)及全病毒中和試驗(VN)。在這些方法中，VN所檢測的是能夠使機體免受病毒感染的中和性抗體，因此與H1、ELISA相比，VN檢測結(jié)果更能體現(xiàn)出動物機體阻止病毒感染的狀態(tài)。
[0003]VN通常是在細胞中進行檢測。檢測之前需事先培養(yǎng)支持NDV復(fù)制的細胞，如雞成纖維細胞CEF或DF1，將待檢測樣品與一定劑量的病毒孵育后，接種于細胞中，1-4天后，觀察細胞是否有病毒感染導(dǎo)致的病變，或用染料染色，檢查病毒感染細胞所產(chǎn)生的空斑數(shù)量或大小，繼而確定所檢測樣品(血清或抗體)是否具有中和活性及其中和效價。這種檢測方法具有如下幾個缺點:
[0004](I)實驗周期較長，與血清孵育的病毒接種細胞后，往往要1-4天才能出現(xiàn)細胞病變(不同毒力的毒株產(chǎn)生細胞病變的時間有所差異)。長時間的檢測過程不利于第一時間對于病毒感染做出診斷，特別是在病毒大范圍流行期間，有可能延誤疫病的防治。
[0005](2)敏感性較差。該方法的檢測閾值較高，若血清樣品數(shù)量較少，或中和抗體效價較低，則無法應(yīng)用該方法。
[0006](3)結(jié)果判斷過于主觀。病毒接種細胞后產(chǎn)生的細胞病變或者空斑的減少需要主觀判斷，沒有一個客觀、統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。
[0007]本發(fā)明檢測中和抗體，有效減少了檢測所需時間(不超過48小時)；由于本發(fā)明采用熒光素酶的放大系統(tǒng)，即便樣品中含有極少量的中和抗體，也能檢出，且理論上單次同時檢測的樣品數(shù)量沒有上限，因此更適合大規(guī)模，高通量的樣品檢測；本項發(fā)明測定熒光素酶表達水平即可作為判定血清的中和效價的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因此判定結(jié)果更加客觀；本發(fā)明應(yīng)用過程中，不涉及活病毒的操作，避免了對其他實驗材料或動物的交叉感染，因此具有生物安全優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]由于傳統(tǒng)的基于細胞或者雞胚的中和試驗方法具有以上諸多弊端，本發(fā)明擬建立一種敏感、快速、適合大批樣本檢測的新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)中和抗體檢測方法，以期替代傳統(tǒng)的中和抗體檢測手段，為疫病的快速診斷、疫苗效果評價等提供有益工具。本發(fā)明提供了一種新城疫病毒偽型病毒(pseudotyped particle, PP)的制備方法及其用途。
[0009]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0010]1.新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)屬于副黏病毒科，病毒粒子表面有血凝素-神經(jīng)氨酸酶(hemagglutinin-neuminidase，HN)和融合蛋白(fusionprotein, F)兩種表面囊膜蛋白。攜帶F、HN基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0011](I)提取NDV F48E9毒株的總RNA，利用隨機引物和禽逆轉(zhuǎn)錄病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；
[0012](2)合成擴增F基因和HN基因的兩對引物:F_sense與F-antisense、HN-sense與 HN-antisense，引物序列分別為 SEQ ID N0.1 與 SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 與 SEQ IDN0.4 ；
[0013](3)以步驟(I)中獲得的cDNA為模板，用步驟(2)合成的引物F-sense與F-antisense、HN-sense 與 HN-antisense PCR 擴增 F 基因和 HN 基因；
[0014](4)用EcoR 1、Xho I酶切F基因片段，用BamH1、XhoI酶切HN基因片段，然后連接到用相應(yīng)酶酶切處理的真核表達載體pcDNA3.1 ( + )(英俊公司生產(chǎn))上，進行核酸測序，確認重組子的讀碼框正確，分別命名為Pc-F和pc-HN，然后將兩重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎細胞(293T)。48小時后，用質(zhì)量濃度為0.05%的胰酶消化細胞，涂布于載玻片，用預(yù)冷的丙酮固定。以NDV全病毒免疫的雞血清作為一抗進行免疫熒光染色，確認F和HN基因能夠正常表達。
[0015]2.整合有NDV囊膜蛋白的`偽型病毒(命名為NDV-PP)的制備
[0016]提前一天將293T細胞在無菌條件下鋪于IOcm細胞培養(yǎng)皿中，待細胞單層長至80%左右時，取質(zhì)粒pc-F、pc-HN及攜帶有熒光素酶同時缺失Env囊膜蛋白和R蛋白基因的HIV病毒載體(pNL4-3-Luc-R_E_)各10yg，利用轉(zhuǎn)染試劑HiTrans (杰普生公司生產(chǎn))轉(zhuǎn)染293T細胞。三種質(zhì)粒與50 μ L轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育30分鐘后，緩慢加入IOcm細胞培養(yǎng)皿中。48-72小時后，收獲轉(zhuǎn)染細胞上清，通過0.45 μ m濾膜過濾后，收集轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清放置_80°C保存。陽性對照組用表達水泡性口炎病毒囊膜蛋白(VSV-G)質(zhì)粒和pNL4-3-Luc-RI各10 μ g轉(zhuǎn)染293T細胞；陰性對照用pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒和pNL4-3-Luc-RT_ 各 10 μ g 轉(zhuǎn)染 293T 細胞。
[0017]本發(fā)明以復(fù)制缺陷型的偽型病毒為工具，檢測樣品中NDV特異性中和抗體，具有以下優(yōu)點:
[0018]I)檢測周期短，傳統(tǒng)方法應(yīng)用全病毒在細胞或雞胚上檢測，依不同毒力毒株而言，通常需要4天左右的時間完成檢測，應(yīng)用本發(fā)明的方法最長2天，即可完成中和抗體檢測。
[0019]2)敏感性高。由于本發(fā)明引入的熒光素酶放大系統(tǒng)，使得檢測結(jié)果以報告基因的表達水平作為指示，極大的提高了檢測的敏感性，因此本發(fā)明也適用于低水平中和抗體的檢測。
[0020]3)適合大批樣本的檢測。本發(fā)明所表述內(nèi)容以96孔細胞培養(yǎng)板為例，實際操作亦可選用384孔板，理論上，每個細胞培養(yǎng)孔可用于一份樣品的檢測，而在增加細胞培養(yǎng)板數(shù)量的前提下，應(yīng)用本發(fā)明檢測樣品沒有數(shù)量上的限制。
【專利附圖】

【附圖說明】[0021]圖1為空質(zhì)粒、新城疫偽型病毒、水泡性口炎偽型病毒感染293T細胞，感染24h后檢測熒光素酶表達水平圖，其中，空質(zhì)粒是pcDNA3.1(+)和pNL4-3-LuC-RI，新城疫偽型病毒是Pc-F和pc-HN與pNL4-3-Luc-R-E-，水泡性口炎偽型病毒是VSV-G與pNL4-3-Luc-R-E-分別包裝偽型病毒；
[0022]圖2為水泡性口炎偽型病毒和新城疫偽型病毒分別與NDV陰性血清和陽性血清混合后感染293T細胞，感染24h后檢測獲得的293T細胞中熒光素酶表達水平圖。
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0024]實施例1
[0025]1.pc-F和pc-HN重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0026]提取NDV F48E9毒株的總RNA，利用隨機引物和AMV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA作為模板，合成引物F-sense與F-antisense,引物序列分別為SEQ ID N0.1與SEQ IDN0.2,通過PCR方法擴增F基因。合成引物HN-sense與HN-antisense,引物序列分別為SEQID N0.3 與 SEQ ID N0.4，通過 PCR 擴增 HN 基因。
[0027]F基因片段用EcoR I ,Xho I酶切，HN基因片段用BamH1、XhoI酶切，然后與同樣酶切處理的真核表達載體pcDNA3.1 (+)連接構(gòu)建成pc-F和pc_HN，通過核酸測序確認重組子的讀碼框正確后，將兩重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，利用全病毒免疫的雞高免血清進行間接免疫熒光試驗確認F和HN基因能夠正常表達。
[0028]2.偽型病毒NDV-PP的制備
[0029]提前一天將293T細胞鋪于IOcm細胞培養(yǎng)皿，待細胞長至80%左右單層時，取質(zhì)粒pc-F、pc-HN及pNL4-3-Luc-R-E-各10 μ g，參照轉(zhuǎn)染試劑HiTrans說明書轉(zhuǎn)染293T細胞。48-72小時后，收獲轉(zhuǎn)染細胞上清，0.45 μ m濾膜過濾后放置-80°C保存。陽性對照組用VSV-G質(zhì)粒和pNL4-3-LuC-R_E-各10 μ g轉(zhuǎn)染293T細胞；陰性對照用pcDNA3.1 (+)空質(zhì)粒和 pNL4-3-Luc-1TE-各 10 μ g 轉(zhuǎn)染 293T 細胞。
[0030]3.偽型病毒NDV-PP的鑒定
[0031]取150 μ L含有NDV-PP的上清液以及陰性、陽性對照，接種于生長在96孔細胞培養(yǎng)板中的293Τ細胞，48小時后，利用Promega公司的Bright-Glo Luciferase AssaySystem檢測各孔感染細胞的熒光素酶表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性對照VSVG-PP及NDV-PP感染孔能夠檢測到熒光素酶的表達，表明其能有效感染293T細胞，而陰性對照檢測不到熒光素酶的表達(見圖1)。說明NDV-PP構(gòu)建成功。
[0032]4.利用NDV-PP檢測NDV中和抗體
[0033]取實驗室感染NDV的雞陽性血清、SPF雞陰性血清各15 μ L，10倍稀釋后與等體積的NDV-PP或水泡性口炎偽型病毒混合，室溫孵育2小時后加入96孔板中的293Τ細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時,檢測各個孔的熒光素酶表達水平,其中水泡性口炎偽型病毒為陽性對照組。簡言之，孵育有NDV-PP和血清或水泡性口炎偽型病毒與血清混合物的細胞用ρΗ7.4的
1xPBS緩沖液洗I次,取Promega公司的Cell lysis buffer20 μ L室溫條件下裂解細胞，20分鐘后，每個檢測孔加入100 μ L熒光素酶底物，利用Perkin Elmer公司的多功能熒光分析儀檢測熒光素酶的表達水平。結(jié)果表明，NDV感染雞的陽性血清與NDV-PP混合后感染293Τ細胞，檢測不到熒光素酶的表達，說明NDV-PP對293Τ細胞的感染被中和抗體所中和，而SPF雞血清與NDV-PP混合感染能夠檢測到熒光素酶的表達，表明檢測樣品中不含有NDV中和抗體(見圖2)。NDV的陽性血清可特異性的阻斷NDV-PP對細胞的感染，而陰性血清不能阻斷NDV-PP的感染。
【權(quán)利要求】
1.一種新城疫病毒偽型病毒的制備方法，包括以下步驟: (1)攜帶F、HN基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建 ①提取新城疫病毒F48E9毒株的總RNA，利用隨機引物和禽逆轉(zhuǎn)錄病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為cDNA ； ②合成擴增F基因和HN基因的兩對引物:F_sense與F-antisense、HN-sense與HN-antisense，引物序列分別為 SEQ ID N0.1 與 SEQ ID N0.2, SEQ ID Νο.3 與 SEQ ID N0.4 ； ③以步驟①中獲得的cDNA為模板,用步驟②合成的引物F-sense與F-antisense、HN-sense 與 HN-antisense PCR 擴增 F 基因和 HN 基因； ④用EcoRI ,Xho I酶切F基因片段，用BamH1、XhoI酶切HN基因片段，然后連接到用相應(yīng)酶酶切處理的真核表達載體pcDNA3.1(+)上，進行核酸測序，確認重組子的讀碼框正確，分別命名為pc-F和pc-HN,然后將兩重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎細胞，即293T ；48小時后，用質(zhì)量濃度為0.05%的胰酶消化細胞，涂布于載玻片，用預(yù)冷的丙酮固定；以NDV全病毒免疫的雞血清作為一抗進行免疫熒光染色，確認F和HN基因能夠正常表達； (2)整合有新城疫病毒囊膜蛋白的偽型病毒NDV-PP的制備 提前一天將293T細胞在 無菌條件下鋪于IOcm細胞培養(yǎng)皿中，待細胞單層長至80%左右時，取質(zhì)粒pc-F、pc-HN及攜帶有熒光素酶同時缺失Env囊膜蛋白和R蛋白基因的HIV病毒載體pNL4-3-Luc-R-E-各10μ g，利用轉(zhuǎn)染試劑HiTrans轉(zhuǎn)染293T細胞；三種質(zhì)粒與50 μ L轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育30分鐘后，緩慢加入IOcm細胞培養(yǎng)皿中；48-72小時后，收獲轉(zhuǎn)染細胞上清，通過0.45 μ m濾膜過濾后，收集轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清放置_80°C保存；陽性對照組用表達水泡性口炎病毒囊膜蛋白VSV-G質(zhì)粒和pNL4-3-Luc-R_E_各10 μ g轉(zhuǎn)染293T細胞；陰性對照用pcDNA3.1 ( + )空質(zhì)粒和pNL4-3-Luc-R-E-各10 μ g轉(zhuǎn)染293T細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法制備的新城疫病毒偽型病毒。
3.如權(quán)利要求2所述的新城疫病毒偽型病毒在新城疫病毒中和抗體檢測中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/569GK103451159SQ201310369421
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】劉恒貴, 王斌, 劉培欣 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所