本發(fā)明屬于生物檢測，具體涉及一種用于腸炎模型病理共定位評(píng)價(jià)的染色試劑盒及染色方法。

背景技術(shù)：

1、腸炎模型是用于研究腸炎疾病的重要工具，尤其以潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerativecolitis，uc)模型應(yīng)用最廣，潰瘍性結(jié)腸炎的主要表現(xiàn)為包括腹瀉、黏液樣便、粘膜潰瘍、腸壁增厚、纖維化肉芽腫、血管增生、水腫、炎癥浸潤、杯狀細(xì)胞與分泌細(xì)胞減少或分泌異常影響消化菌群紊亂等。而相關(guān)藥物研發(fā)的效果及毒性需要在相關(guān)癥狀上進(jìn)行測試才能知道其藥物效果以及毒理變化，故在動(dòng)物身上進(jìn)行基因敲除或化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)以達(dá)到腸炎疾病的組織學(xué)變化。

2、目前關(guān)于研究腸炎疾病的組織學(xué)變化的方法是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行制片，然后分別進(jìn)行he染色、免疫組化染色、特殊染色在相同組織不同深度的切片進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與評(píng)分評(píng)估。

3、現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)在于：(1)前期制備多張切片的過程，包括切片、染色、掃描及質(zhì)量控制，耗時(shí)時(shí)間較多(超過三天)，不僅繁瑣費(fèi)力，而且對研發(fā)委托方與檢測方而言，均存在時(shí)間與成本的巨大浪費(fèi)；(2)在組織化學(xué)染色階段，切片脫落是常見問題，這會(huì)導(dǎo)致多張切片在共同定位層面的分析結(jié)果不佳，當(dāng)細(xì)胞不在同一層面時(shí)，分析總結(jié)藥物或器械的效果將變得更加困難，且結(jié)果偏差大；(3)當(dāng)前使用的方法繁多且復(fù)雜，且不同機(jī)構(gòu)間的使用條件還不一致，導(dǎo)致無法完全復(fù)刻出相同的染色結(jié)果，這進(jìn)一步增加了評(píng)估的不確定性和難度；(4)行業(yè)內(nèi)對于單個(gè)藥物的研發(fā)評(píng)估存在多種質(zhì)量差異，結(jié)果差異過大不僅導(dǎo)致研發(fā)方的經(jīng)費(fèi)投入巨大，還不利于藥物研發(fā)技術(shù)的改進(jìn)和成熟上市，成為制約藥物研發(fā)進(jìn)程的重要因素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種用于腸炎模型病理共定位評(píng)價(jià)的染色試劑盒及染色方法。

2、本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)上述目的：

3、本發(fā)明提供了一種用于腸炎模型病理共定位評(píng)價(jià)的染色試劑盒，所述染色試劑盒包括如下組分：蘇木素染色液、阿利新藍(lán)染色液、高碘酸溶液、schiff試劑、脫蠟抗原修復(fù)液(ph9.0)、過氧化物酶抑制劑、直用型一抗cd4、非特異性抗原封閉液、直用型二抗hrp-山羊抗兔igg聚合物、dab顯色劑、磷酸鹽緩沖液(pbs)、tris緩沖鹽溶液(ph7.6)、磷酸鹽緩沖液洗滌劑、透明劑。

4、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化方案，所述阿利新藍(lán)染色液為1％阿利新藍(lán)染色液，所述1％阿利新藍(lán)染色液的獲得方法為，將1g阿利新藍(lán)8gx粉末加入3ml醋酸和97ml蒸餾水中，充分溶解，并靜置1小時(shí)后獲得。

5、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化方案，所述高碘酸溶液的獲得方法為，將0.5g高碘酸加水100ml，并靜置30min后獲得。

6、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化方案，所述schiff試劑由堿性品紅lg、1mol/l鹽酸20ml、偏重亞硫酸鈉1.5g、蒸餾水200ml、活性炭2g配制獲得；

7、所述schiff試劑的獲得方法為，將1g堿性品紅溶于80℃的200ml蒸餾水中，加熱煮沸片刻，并充分?jǐn)嚢瑁鋮s至50℃時(shí)過濾，加入1mol/l鹽酸20ml，冷卻至25℃時(shí)加入1.5g偏重亞硫酸鈉，密封后室溫下暗處放置24h，此時(shí)溶液呈淡土黃色或淡紅色，再加入2g活性炭粉末，充分振蕩溶液，靜置2h后過濾后獲得，此時(shí)溶液呈無色、清澈透明狀態(tài)。

8、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化方案，所述過氧化物酶抑制劑由質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％過氧化氫10份、磷酸鹽緩沖液90份配制獲得。

9、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化方案，所述直用型一抗cd4由cd4一抗抗體1份、牛血清白蛋白1份、疊氮鈉溶液0.1份、磷酸鹽緩沖液97.9份配制獲得。

10、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化方案，所述非特異性抗原封閉液由山羊血清50份、甘油49.9份、疊氮鈉溶液0.1份配制獲得。

11、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化方案，所述磷酸鹽緩沖液由氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g、去離子純水800ml配制獲得。

12、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化方案，所述tris緩沖鹽溶液的ph為7.6，所述tris緩沖鹽溶液由三羥甲基氨基甲烷6.05g、氯化鈉8.76g、去離子純水800ml配制獲得。

13、作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化方案，所述磷酸鹽緩沖液洗滌劑由磷酸鹽緩沖液99.5份，聚山梨醇酯200.5份配制獲得。

14、本發(fā)明還提供了一種基于上述染色試劑盒的染色方法，具體步驟為：

15、1)制備動(dòng)物組織的石蠟切片；

16、2)脫蠟與抗原修復(fù)，提前預(yù)熱真空負(fù)壓干燥箱至93℃，使用容器倒入250ml脫蠟抗原修復(fù)液(ph9.0)浸泡步驟1)所獲得的切片，放入5min；解除壓力取出切片放入70℃的磷酸鹽緩沖液浸泡清洗3次/每次5分鐘，常溫的tris緩沖鹽溶液清洗3次/每次5分鐘；

17、3)過氧化物酶封閉，經(jīng)步驟2)處理的切片，使用過氧化物酶抑制劑滴加或浸泡常溫封閉30分鐘，去除過氧化物酶抑制劑并浸泡磷酸鹽緩沖液洗滌劑3次/每次5分鐘；

18、4)一抗標(biāo)記，經(jīng)步驟3)處理的切片，使用直用型一抗cd4常溫孵育1小時(shí)，浸泡磷酸鹽緩沖液洗滌劑3次/每次5分鐘；

19、5)經(jīng)步驟4)處理的切片，非特異性抗原封閉液，常溫孵育30min，浸泡磷酸鹽緩沖液洗滌劑3次/每次5分鐘；

20、6)二抗孵育，經(jīng)步驟5)處理的切片，直用型二抗hrp-山羊抗兔igg聚合物常溫孵育15min，浸泡磷酸鹽緩沖液洗滌劑3次/每次5分鐘；

21、7)dab顯色，經(jīng)步驟6)處理的切片，使用dab顯色劑常溫孵育顯色5min，浸泡磷酸鹽緩沖液洗滌劑1次/每次5分鐘；

22、8)阿利新藍(lán)染色，經(jīng)步驟7)處理的切片，使用阿利新藍(lán)染色液常溫染色5分鐘，純水清洗至無多余藍(lán)色脫出；

23、9)糖原氧化，經(jīng)步驟8)處理的切片，使用高碘酸溶液浸泡或者滴加至切片上2-8℃之間孵育5分鐘，去離子/純水稍洗3次；

24、10)pas染色，經(jīng)步驟9)處理的切片，浸泡入schiff試劑2-8℃之間孵育5分鐘，連著浸泡液體自來水流水沖洗5-10分鐘至液體無色；

25、11)細(xì)胞核染色，經(jīng)步驟10)處理的切片，放入蘇木素染色液體浸泡30秒，自來水流水沖洗2分鐘，純水稍洗3次；

26、12)干燥封片，經(jīng)步驟11)處理的切片，自然晾干或60℃干燥，滴加透明劑透明后用封片膠封片。

27、本發(fā)明的染色方法的優(yōu)勢在于，巧妙地融合了腸炎模型的組織學(xué)病理特征及其評(píng)分體系，采用單片切片便可將傳統(tǒng)上需三張切片完成的多重染色集成至一張切片上，進(jìn)行特定免疫細(xì)胞標(biāo)記物的免疫組化染色(棕褐色)、腸道分泌細(xì)胞的特殊染色(藍(lán)色和紫紅色)、組織上所有細(xì)胞核(淡藍(lán)色或藍(lán)白色)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)染色(紅色或粉色)、紅細(xì)胞染色(黃色)。

28、本發(fā)明的有益效果在于：

29、1)本發(fā)明相較于只是直接把傳統(tǒng)的三種染色方法結(jié)合在一起進(jìn)行評(píng)價(jià)分析的優(yōu)勢在于，本發(fā)明可以簡化并加速前期制片過程中多種染色法的復(fù)雜步驟及降低耗時(shí)，確保切片能夠更迅速地完成，從而及時(shí)進(jìn)入下一分析階段；

30、2)本發(fā)明在制片過程中，通過使用真空負(fù)壓的快速脫蠟和抗原修復(fù)方式確保切片的高度穩(wěn)定性和完整性，有效降低掉片率，同時(shí)減少切片數(shù)量和掃描次數(shù)，能夠顯著節(jié)省時(shí)間并相應(yīng)降低研發(fā)企業(yè)的成本；

31、3)本發(fā)明通過在同一張切片上實(shí)施多重染色技術(shù)，能夠有效解決因多張切片共定位分析所導(dǎo)致的結(jié)果不穩(wěn)定問題，這種方法不僅提升了分析的準(zhǔn)確性和可靠性，還極大地節(jié)省病理診斷的工作，無需再反復(fù)切換不同的分析切片，或是來回查看多個(gè)分析結(jié)果，從而能夠更高效地進(jìn)行病理診斷和研究，這一技術(shù)的應(yīng)用，無疑將大大提高病理分析的效率和準(zhǔn)確性；

32、4)本發(fā)明通過確立統(tǒng)一的病理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，旨在加速眾多研究機(jī)構(gòu)的采納進(jìn)程，有效解決了各檢測機(jī)構(gòu)間評(píng)價(jià)方法差異所導(dǎo)致的藥物評(píng)價(jià)結(jié)果不一致問題，從而促進(jìn)經(jīng)濟(jì)效益的顯著提升。