專利名稱：蘆筍莖枯病苗期抗性鑒定方法
技術領域：
本發明專利涉及一種蘆筍莖枯病的苗期抗性鑒定的方法，該方法可以對1月齡的蘆筍苗進行快速鑒定，具有簡單，快捷，鑒定過程中各種條件容易控制等特點，鑒定結果準確可信；主要應用于蘆筍種質資源和新品種選育過程中的抗病篩選。
背景技術：
P筍{Asparagus officinalis Lirme)又稱石刁柏，百合科天門冬屬，是世界十大名菜之一，在國際市場上被稱為“蔬菜之王”。由于其營養價值高，并能潤肺、鎮咳、祛痰， 具有抑制腫瘤生長的藥理功能，深受人們的喜愛。近年來，隨著蘆筍市場與栽培面積的擴大，在生產上病害的發生也逐年增加，尤其莖枯病的嚴重發生已嚴重影響了蘆筍的產量與質量。其病原菌為天門冬擬莖點霉D^offlOASi1S asparagi (Sacc. ) Bubak]，是一種世界性分布的毀滅性病害，在中國、日本、泰國、印尼等亞洲蘆筍種植國家發生比較嚴重，歐美發生則比較少，只有零星報道。蘆筍莖枯病已發展成為我國蘆筍產業的限制性因子之一。初步鑒定，它是由真菌天冬擬莖點菌引發的莖部病害。在亞洲尤以中國發病最為嚴重，我國臺灣、廣東、廣西、福建、浙江、江西、江蘇、上海、安徽、湖北、四川、陜西、河南、山東、河北、遼寧、黑龍江等蘆筍生產省份均發生普遍，輕者生長發育不良，降低產量與品質，重者病株提前枯死，全田毀滅，嚴重影響蘆筍生產與創匯。本專利旨在系統建立蘆筍莖枯病抗性鑒定方法，并用該方法篩選蘆筍抗病種質資源。目前，國內學者在蘆筍莖枯病的癥狀、病原、侵染循環、田間發生規律及防治方法等方面開展了不少的研究工作。蘆筍莖枯病癥狀研究已比較清楚，研究發現莖枯病主要發生在蘆筍莖枝上，有時也發生在擬葉上，但果實上未見病斑，重癥株地上枯死甚至根盤腐爛；在不同環境條件下，莖稈上可形成兩種不同類型的病斑一是急性型病斑，二是慢性型病斑，二者形態上有一定區別(苗華民，1991 ；康業斌等，1999)。病原菌的形態特征與生物學特性，研究報道不少，形態特征基本清楚，菌絲生長條件明確，但莖枯病原菌鑒定結果尚存爭議，國內大多認為蘆筍莖枯病菌為天門冬擬莖點霉菌[/^ffiOASi1S asparagi (Sacc.) Bubak](劉克均等，1991 ；章月梅等，1996)。蘆筍莖枯病菌侵染循環研究表明，病菌主要主要以分生孢子器和分生孢子、菌絲體在田間病殘體重越冬，成活，適宜條件下進行初次侵染，再次侵染(陳光宇，2005)。田間發生規律與流行因素基本闡明，不同生態區的蘆筍主產區有所不同，氣候條件、栽培條件、品種特性等是主要影響因素(葉曉輝等，2009)。病害防治技術研究(孫淑建等，2002 ；王政逸等，1995 ；盛全學等，2007 ；李術臣等，2009報道非常多，但比較零散，缺乏系統和全面的論述，主要以化學防治為主，開展了藥劑篩選與藥效試驗(林佩力等，1995 ；胡翠鳳等，1996 ；施德等，1997 ；羅時華等，2003 ；徐玉恒等，2005 ；張金良等，2007)、拮抗菌篩選(陳福如等，1995 ；馬利平等，2008)、與對殺菌劑敏感性(鄭元梅等，1995;陳新建，1999)等試驗，農業措施防治已為人們所接受，最近幾年興起設施栽培避雨防病和生物防治。而關于蘆筍莖枯病菌的侵染過程和致病生理生化機制、寄主的抗病機制尚未見有報道，在侵入和致病過程中，病菌分泌的角質酶、纖維素酶和果膠酶及毒素等可能起重要作用，加強這些方面的研究將有助于進一步認識病害的本質和抗病品種的選育，并在病害防治上取得更大成功。國外研究報道極少，1991年UECKER對蘆筍莖枯病菌的形態學及分類地位進行了報道，2001年澳大利亞報道發生蘆筍莖枯病(DaViS，2001)。培育和利用抗性品種是植物病蟲害綜合防治中的最安全環保最為經濟有效的措施和關鍵技術，這也是今后蘆筍莖枯病綜合防治研究的發展方向和迫切需求。進行蘆筍抗莖枯病育種，首先需要抗性種質資源，探明寄主的抗性遺傳規律才有助于抗性性狀的遺傳改良。而蘆筍莖枯病的抗性鑒定方法國內外尚無公開報道。本專利將系統建立蘆筍莖枯病苗期鑒定方法，并用該方法篩選蘆筍種質資源。

發明內容
本發明的目的在于建立蘆筍莖枯病的苗期抗性鑒定方法，提供一種簡便、有效、準確的抗性鑒定方法。為了達到以上目的，本發明采用如下技術方案 1.分級標準的制定
制定了苗期接種的4級分級標準0級無發病；1級發病面積占株冠面積的10%以下；2級發病面積占株冠面積的11%_30% ；3級發病面積占株冠面積的31%-50% ；4級發病面積占株冠面積的50%以上。2.接種方法的篩選
以江西省農科院創制的蘆筍品種作為供試材料，比較成菌絲塊基部接種法、菌絲塊中部接種法、菌絲塊中基部接種法、孢子噴霧法等4種接種方法的優劣，選擇一種最為靈敏、 有效的方法，用于蘆筍抗性鑒定方法的建立。具體方法如下 (1)菌絲塊基部接種法
選擇1月齡的蘆筍幼苗10-20株作為實驗對象，將蘆筍幼苗缽置于50厘米長30厘米寬的塑料盤平放，將5毫米直徑的菌絲塊放置到蘆筍莖的基部，噴無菌水保濕，并用保鮮膜覆蓋，25- ！黑暗培養2天后轉到玻璃恒溫溫室25-28 ！培養，每天噴水3次，保持濕度， 6-10天后觀察實驗結果。(2)菌絲塊中部接種法
選擇1月齡的蘆筍幼苗10-20株作為實驗對象，將蘆筍幼苗缽置于50厘米長30厘米寬的塑料盤平放，將5毫米直徑菌絲塊放置到蘆筍莖的中部，噴無菌水保濕，并用保鮮膜覆蓋，25- ！黑暗培養2天后轉到玻璃恒溫溫室25-28 ！培養，每天噴水3次，保持濕度， 6-10天后觀察實驗結果。(3)菌絲塊中基部接種法
選擇1月齡的蘆筍幼苗10-20株作為實驗對象，將蘆筍幼苗缽置于50厘米長30厘米寬的塑料盤平放，將5毫米直徑菌絲塊分別放置到蘆筍莖的中部和基部，噴無菌水保濕，并用保鮮膜覆蓋，25-28 ！黑暗培養2天后轉到玻璃恒溫溫室25-28 °C培養，每天噴水3次， 保持濕度，6-10天后觀察實驗結果。(4)孢子噴霧法
選擇1月齡的蘆筍幼苗10-20株作為實驗對象，配制10的6次方至10的7次方個蘆筍莖枯病菌強致病力菌株的孢子懸浮液，在配置好的孢子懸浮液中按每100毫升加5-10微升的比例加入吐溫-20后噴霧，黑暗保濕培養2天后轉到玻璃恒溫溫室25-28 °C培養，每天噴水3次，保持濕度，6-10天后觀察實驗結果。結果發現菌絲塊中基部接種法相對菌絲塊中部接種法和菌絲塊基部接種法發病略重，但相對孢子噴霧法發病較輕，且操作操作難度較大。孢子噴霧法操作簡單，發病較為迅速，易根據造成病斑的長度確定病級。因此，通過對4種接種方法的比較，本專利選擇孢子噴霧法用于蘆筍種質資源的抗性鑒定。3.強致病力菌株的篩選
根據平常接種的發病情況，選擇來自江西的兩個菌株，來自福建的兩個菌株。用上述孢子噴霧法進行接種，計算病情指數，并比較其致病力，選擇一個致病力最強的菌株用于蘆筍莖枯病菌抗性鑒定方法的建立。每個菌株做3個重復，用新復極差法進行差異顯著性分析。 用孢子噴霧法接種8-10天和16-20天后分別調查發病情況，并計算病情指數。結果表明 不同菌株存在明顯的致病力分化，本專利選擇致病力最強的菌株用于苗期抗性鑒定方法的建立。4.孢子懸浮液濃度的確定
分別配制10的5次方個蘆筍莖枯病菌強致病力菌株的孢子每毫升、10的6次方個蘆筍莖枯病菌強致病力菌株的孢子每毫升、10的7次方個蘆筍莖枯病菌強致病力菌株的孢子每毫升的蘆筍莖枯病菌強致病力菌株的孢子懸浮液，分別用孢子噴霧法對江西省農科院蔬菜花卉所創制的蘆筍品種進行接種，在8-10天和16-20天后分別統計病級和計算病級指數。 結果表明當孢子懸浮液濃度達到10的6次方個蘆筍莖枯病菌強致病力菌株的孢子每毫升后蘆筍莖枯病的病情指數幾乎達到穩定，而10的6次方個蘆筍莖枯病菌強致病力菌株的孢子每毫升和10的7次方個蘆筍莖枯病菌強致病力菌株的孢子每毫升下的病情指數明顯高于10的5次方個蘆筍莖枯病菌強致病力菌株的孢子每毫升的濃度，說明10的6次方個蘆筍莖枯病菌強致病力菌株的孢子每毫升的濃度是蘆筍莖枯病孢子噴霧法接種的最佳濃度(圖 2)。5.抗性鑒定方法的驗證
選擇5個田間抗感差異較明顯的蘆筍品種，用上述建立的方法進行抗性鑒定。結果表明用本專利的鑒定結果與這5個品種的田間抗感表現相吻合，證明了本研究建立的抗性鑒定方法準確、靈敏、可靠。6.成株期與苗期鑒定的一致性分析
5個蘆筍種質資源的成株期鑒定結果表明，成株期鑒定結果與苗期鑒定一致。即蘆筍種質資源的成株期與苗期鑒定結果基本一致。苗期鑒定在栽培時間、鑒定時間等方面存在優勢，因此本發明選擇在苗期用孢子噴霧法對蘆筍種質資源進行抗病篩選。7.蘆筍種質資源的抗性鑒定
用本研究建立的苗期抗性鑒定方法對江西省農業科學院蔬菜花卉所蘆筍創新團隊提供的31個蘆筍種質資源進行了抗性鑒定。在31個種質資源中，野生天門冬的病情指數均為0，為免疫種質資源；雜交一代TX-4/SD的病情指數較低為相對抗病品種，其次較抗病的是碩豐和 UC157 ；Pacific Peak, JG701,Patron,Jersey Giant 和 B3 的病情指數較高，為相對易感品種。


圖1.不同蘆筍莖枯病菌菌株致病力測定； 圖2.孢子懸浮液濃度對病情指數的影響； 圖3.田間抗感差異較顯著蘆筍種質資源的抗病性鑒定； 圖4.蘆筍種質資源的成株期鑒定。
具體實施例方式一種蘆筍莖枯病的苗期抗性鑒定的方法，按以下步驟實現 (1)分生孢子的培養
將強致病力菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上活化，生長6天后，用5毫米直徑的打孔器在菌落邊緣打孔，用接種針挑取菌絲塊接種到新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上。將接有菌絲塊的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板置于黑光燈下，25 °C全天黑光燈誘導產孢培養，共培養14天，使之產生分生孢子器。(2)孢子懸浮液的配制
將培養皿中的分生孢子器用載玻片刮下，用紗布包裹，置于8厘米直徑的玻璃研缽中， 加入30毫升無菌水，用研杵輕輕搗碎，使分生孢子釋放。三層紗布過濾后，用血球計數板測定孢子濃度，并加無菌水調節到需要的濃度。(3)孢子噴霧法接種
在配置好的孢子懸浮液中按每100毫升加5微升的比例加入吐溫-20，混勻后，用噴霧器均勻噴到各個處理的蘆筍幼苗上。25 °C黑暗保濕培養2天后，轉到玻璃溫室，25 °C覆膜培養，并每天噴水3次，保持濕度。(4)結果調查與分析
分別在接種8天和16天后，按照本專利建立的分級標準統計病級兩次，并分別計算病情指數，采用新復極差法進行差異顯著性分析。(5)抗感品種的確定
根據本專利制定的抗感指標，根據各個品種的病情指數，確定該品種是免疫、易感、抗病、中抗、感病五種類型中的哪一種。圖1.為不同蘆筍莖枯病菌菌株致病力測定，圖1中數據為3次重復的平均值，采用新復極差法進行差異顯著性分析，圖上不同字母者表示在5%水平上差異極顯著。圖2為孢子懸浮液濃度對病情指數的影響，圖2中數據為3次重復的平均值，采用新復極差法進行差異顯著性分析，圖上不同字母者表示在5%水平上差異極顯著
圖3為田間抗感差異較顯著蘆筍種質資源的抗病性鑒定，圖3中數據為3次重復的平均值，采用新復極差法進行差異顯著性分析，圖上不同字母者表示在5%水平上差異極顯
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者O圖4為蘆筍種質資源的成株期鑒定，圖4中數據為3次重復的平均值，采用新復極差法進行差異顯著性分析，圖上不同字母者表示在5%水平上差異極顯著。
權利要求
1. 一種蘆筍莖枯病的苗期抗性鑒定的方法，其特征在于按以下步驟，a、制定蘆筍幼苗接種的四級分級標準，分級標準如下0級無發病；1級發病面積占株冠面積的10%以下；2級發病面積占株冠面積的11%_30% ；3級發病面積占株冠面積的31%-50% ；4級發病面積占株冠面積的50%以上；b、選擇1月齡的蘆筍幼苗10-20株作為實驗對象，配制10的6次方至10的7次方個蘆筍莖枯病菌強致病力菌株的孢子懸浮液，在配置好的孢子懸浮液中按每100毫升加5-10 微升的比例加入吐溫-20后噴霧，黑暗保濕培養2天后轉到玻璃恒溫溫室25-28 °C培養，每天噴水3次，保持濕度，6-10天后觀察實驗結果；c、用孢子噴霧法接種8-10天和16-20天后分別調查發病情況，并計算病情指數。
全文摘要
一種蘆筍莖枯病的苗期抗性鑒定的方法，先制定蘆筍幼苗接種的四級分級標準，分級標準如下0級無發病；1級發病面積占株冠面積的10%以下；2級發病面積占株冠面積的11%-30%；3級發病面積占株冠面積的31%-50%；4級發病面積占株冠面積的50%以上；再選擇1月齡的蘆筍幼苗10-20株作為實驗對象，配制10的6次方至10的7次方個蘆筍莖枯病菌強致病力菌株的孢子懸浮液，在配置好的孢子懸浮液中按每100毫升加5-10微升的比例加入吐溫-20后噴霧，黑暗保濕培養2天后轉到玻璃恒溫溫室25-28℃培養，每天噴水3次，保持濕度，6-10天后觀察實驗結果；本發明選擇在苗期用孢子噴霧法對蘆筍種質資源進行抗病篩選，成株期鑒定結果與苗期鑒定一致，并具有在栽培時間、鑒定時間等方面存在優勢。
文檔編號A01G31/00GK102523907SQ20121002983
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月10日 優先權日2012年2月10日
發明者蘭波, 孟凡, 李湘民, 楊迎青 申請人:江西省農業科學院植物保護研究所