專利名稱：一種通過紅姜花體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法
技術領域：
本發明屬于姜科(Zingiberaceae)姜花屬(Hedychium)生物技術育種領域，特別涉及一種通過紅姜花(Hedychium coccineum Buch.-Ham)體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法。通過該方法能夠建立紅姜花胚性細胞懸浮培養系(embryogenic cellsuspensions, ECS),以及從胚性細胞懸浮培養系獲得高效的體細胞胚胎發生頻率，成功建立高效的植株再生體系。
背景技術：
紅姜花(Hedychiumcoccineum Buch.-Ham)為姜科姜花屬(Hedychium)多年生草本植物，分布于我國西藏、云南和廣西一帶，沿喜馬拉雅諸國及斯里蘭卡、緬甸及越南也有分布。紅姜花是姜花屬中的珍品，觀賞價值極高，鮮紅色的穗狀花序，宜做高檔鮮切花或園林綠化使用；紅姜花的花紅色艷麗、花型美麗，似群蝶飛舞，也是極好的花卉育種材料。但紅 姜花主要通過無性分株進行繁殖，分生能力弱，自然狀態下繁殖系數低，不耐移植，遠遠不能滿足大規模生產的需要；紅姜花鮮切花插花期只有3 5天，植株高達2米，也限制了其作為觀賞花卉的商業價值。因此，提高紅姜花繁殖系數、培育鮮切花瓶插期長、矮化的紅姜花新品種是加快紅姜花農業生產規模化和品種改良的有效措施。包括離體快繁技術、體外誘變、轉基因、體細胞雜交等生物技術方式是進行紅姜花大規模快繁和進行品種改良的有效手段。建立穩定的紅姜花胚性細胞懸浮培養系及經體胚發生途徑的高效的植株再生體系則是實現紅姜花生物技術育種的有效前提條件。目前還沒有關于紅姜花ECS的建立以及通過ECS進行高頻體胚發生再生植株的報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一種通過紅姜花體細胞胚胎(體胚)發生途徑高效再生植株的方法。該方法首次建立紅姜花的胚性細胞懸浮培養系，并提供一種通過體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法，為紅姜花的離體快速繁殖和生物技術育種奠定基礎。本發明的目的通過下述方案實現一種通過紅姜花體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法，包括如下步驟(I)愈傷組織的誘導和胚性愈傷組織的優化增殖以紅姜花未成熟的花絲和/或花藥為外植體，接種于愈傷組織誘導培養基上誘導培養出愈傷組織；將誘導出的愈傷組織繼代培養在愈傷組織優化與增殖培養基上，得到黃白色粉狀的胚性愈傷組織；(2)均一穩定的胚性細胞懸浮培養系的建立將步驟(I)的黃白色粉狀的胚性愈傷組織O. 5 2. Og轉入液體培養基中，置于90 IlOrpm搖床上懸浮培養I 2個月，得到分散、均質的胚性細胞懸浮培養系；(3)體細胞胚胎的誘導取步驟(2)得到的胚性細胞懸浮培養系，調整細胞密度為10%SCV懸浮培養物(settled cell volume，簡稱SCV，是指懸浮細胞靜置后所得的細胞沉淀體積)，取0. 5 2. OmL 10%SCV懸浮培養物接種于體胚誘導培養基中，置于28±1°C黑暗中進行體細胞胚胎誘導，得到成熟體細胞胚胎；(4)體細胞胚胎的萌發及其植株再生將步驟(3)誘導出的成熟體細胞胚胎轉入體胚萌發培養基中，置于28土 1°C黑暗培養，待葉鞘抽出后，將其轉至生根壯苗培養基中繼續培養，進一步發育成健壯的紅姜花再生小植株；步驟(I)中所述的紅姜花優選為6月中旬到7月中旬的紅姜花未成熟的花序小花；所述的花序小花優選采用以下方法進行前處理取紅姜花未成熟的花序小花，用自來水沖洗30min,然后用O. lwt%HgCl2消毒8 12min,用無菌水沖洗4 6遍,剝除外部苞片，切取花藥和/或花絲備用； 所述的愈傷組織誘導培養基的組成為MS培養基+ (2 4)mg -1^2, 4-D (2，4_ 二氯苯氧乙酸)+ (2 4) mg · T1NAA (萘乙酸)+Img · Ll-BA (6-芐基腺嘌呤)+30g · Γ1蔗糖+7g · Γ1瓊脂粉，pH 5.8,高溫高壓滅菌；優選的，所述的愈傷組織誘導培養基的組成為MS培養基+4mg -1^2, 4_D+4mg -L^1NAA+Img · L—VBA+SOg · L-1 蔗糖 +7g · L-1 瓊脂粉，pH 5. 8，高溫高壓滅菌；所述的誘導培養優選于28±1°C黑暗條件下培養4個月；所述的愈傷組織優化與增殖培養基的組成為MS培養基+ (I 2) mg · 1^2，4-D+(O. 25 l)mg · L 1NAA+ (O. 25 l)mg · L ^-BA+SOg · L 1 鹿糖 +7g · L 1 瓊脂粉，pH 5. 8，高溫高壓滅菌；優選的，所述的愈傷組織優化與增殖培養基的組成為MS培養基+Img -1^2, 4-D+0 25mg · L_1NAA+0. 25mg · L_16-BA+30g · L-1 鹿糖 +7g · L-1 瓊脂粉，pH 5. 8,高溫高壓滅菌；所述的高溫高壓滅菌的條件優選為在121°C、1. 06kg/cm2滅菌15min ；所述的繼代培養的時間優選為2 4個月；步驟(2)中所述的液體培養基的組成為MS培養基的無機鹽+IOOmg · L—1麥芽水解物+IOOmg · L 1 谷氛酸胺 +230mg · L 1 腦氛酸 + (O. 02 O. 25) mg · L 1NAA+ (O. 5 I)mg · U12, 4-D+B5 培養基的維生素(Gamborg et al, 1968) +45g · L-1 鹿糖，pH 5. 3,高溫高壓滅菌；優選的，所述的液體培養基的組成為MS培養基的無機鹽+IOOmg -T1麥芽水解物+IOOmg · L-1 谷氨酰胺 +230mg · L-1 脯氨酸 +0. 02mg · L^1NAA+Img · U12, 4_D+B5 培養基的維生素+45g · L—1鹿糖，pH 5. 3,高溫高壓滅菌；所述的高溫高壓滅菌的條件優選為在121°C、1. 06kg/cm2滅菌15min ；所述的液體培養基的體積優選為30mL ；所述的懸浮培養的溫度優選為28± 1°C ；所述的懸浮培養I 2個月優選采用以下方法進行在培養的第一個月每周吸棄2/3的舊培養液，用等體積的新鮮的液體培養基補充，同時用900 μ m孔徑篩網過濾除去不易分散的大顆粒，其后每2周更換一次培養基，再繼代一個月后，得到分散、均質的紅姜花胚性細胞懸浮培養系；步驟(3)中所述的10%SCV懸浮培養物優選按下述方法制備得到吸取步驟(2)得到的胚性細胞懸浮培養系于IOmL刻度管中，靜置，直到獲得細胞沉淀lmL，棄上清液，將所得的細胞沉淀用不含瓊脂粉的體胚誘導培養基稀釋至總體積10mL，得10%SCV懸浮培養物，此時細胞體積含量為總體積的10% ；所述的胚性細胞懸浮培養系的體積視胚性細胞懸浮培養系中的細胞濃度而定，只要獲得細胞沉淀ImL即可；所述的紅姜花細胞接種量優選為O. 5 2. OmL 10%SCV懸浮培養物；所述的紅姜花細胞接種量更優選為I. OmL 10%SCV懸浮培養物；所述的體胚誘導培養基的組成為SH培養基(Schenk和Hildebrandt, 1972)的無機鹽+IOOmg · L-1麥芽提取物+IOOmg · L-1谷氨酰胺+230mg · L-1脯氨酸+ (O. 02 O. 25)mg · T1NAA+ (50 250) μ g · T1TDZ (N-苯基-N-1, 2，3-噻二唑 ~5~ 脲)+B5 培養基的維生素+45g · Γ1蔗糖+7g · Γ1瓊脂粉，pH 5.8,高溫高壓滅菌； 優選的，所述的體胚誘導培養基的組成為SH培養基(Schenk和Hildebrandt,1972)的無機鹽+IOOmg · L—1麥芽提取物+IOOmg · L—1谷氨酰胺+230mg · L—1脯氨酸+0. 25mg · L^1NAA+150 μ g · I^TDZ+Bs 培養基的維生素 +45g · L-1 蔗糖 +7g · L-1 瓊脂粉，pH5. 8,聞溫聞壓滅囷；所述的體胚誘導培養基采用以下方法進行配制將TDZ配制成100 μ g -mL-1母液，過濾滅菌后添加到PH 5. 8、經高溫高壓滅菌后降至45°C的含有其余培養基成分的培養基中，混合均勻，得到體胚誘導培養基；所述的含有其余培養基成分的培養基的組成為SH培養基(Schenk和Hildebrandt, 1972)的無機鹽 +IOOmg · L-1 麥芽提取物 +IOOmg · L-1 谷氨酰胺 +230mg · L-1脯氨酸+ (O. 02 O. 25) mg · Γ'ΝΑΑ+Βδ培養基的維生素+45g · L-1蔗糖+7g · L-1瓊脂粉，pH 5. 8,聞溫聞壓滅囷；所述的含有其余培養基成分的培養基的組成優選為SH培養基(Schenk和Hildebrandt, 1972)的無機鹽 +IOOmg · L-1 麥芽提取物 +IOOmg · L-1 谷氨酰胺 +230mg · L-1脯氨酸+0. 25mg · L^NAA+B5培養基的維生素+45g · L-1蔗糖+7g · L-1瓊脂粉，pH 5. 8，高溫高壓滅菌；所述的不含瓊脂粉的體胚誘導培養基的組成為SH培養基(Schenk和Hildebrandt, 1972)的無機鹽 +IOOmg *L_1 麥芽提取物 +IOOmg *L_1 谷氨酰胺 +230mg *L_1 脯氨酸 + (O. 02 O. 25) mg · L-1NAA+ (50 250) μ g · L_1TDZ+B5 培養基的維生素 +45g · Γ1鹿糖，pH 5. 8,高溫高壓滅菌；優選的，所述的不含瓊脂粉的體胚誘導培養基的組成為SH培養基(Schenk和Hildebrandt, 1972)的無機鹽 +IOOmg ·廠1 麥芽提取物 +IOOmg · L-1 谷氨酰胺 +230mg · L-1脯氨酸 +0. 25mg · L^1NAA+150 μ g · I^TDZ+Bs 培養基的維生素 +45g · L-1 蔗糖，pH 5. 8，高溫高壓滅菌；所述的高溫高壓滅菌的條件優選為在121°C、1. 06kg/cm2滅菌15min ；所述的體細胞胚胎誘導的時間優選為20天；步驟(4)中所述的體胚萌發培養基的組成優選為SH培養基(Schenk和Hildebrandt，1972)的無機鹽 + (O. 25 2. O) mg · L_16-BA+0. 2mg · L_1NAA+MS 培養基的維生素 +30g · L-1 鹿糖+7g ·じ1瓊脂粉，pH 5.8,高溫高壓滅菌；更優選的，所述的體胚萌發培養基的組成為SH培養基的無機鹽+1. Omg ·じ16-BA+O. 2mg ·じ1NAA+MS培養基的維生素+30g ·じ1蔗糖+Ig ·じ1瓊脂粉，pH5. 8,聞溫聞壓滅囷；所述的生根壯苗培養基的組成優選為1/2MS培養基+30g ·じ1蔗糖+0. lwt%活性炭+7g ·じ1瓊脂粉，pH 5.8,高溫高壓滅菌；所述的高溫高壓滅菌的條件優選為在121°C、1. 06kg/cm2滅菌15min ；
·
所述的繼續培養優選為30 μ mol · πΓΥ1光強(白色熒光燈)、16L/8D光條件下繼續
培養ー個月；步驟(4)所得的紅姜花再生小植株可不經過馴化，直接種植到富含有機質的土壌中，在陰棚內種植成活；本發明的機理為本發明以紅姜花未成熟的花絲和/或花藥為外植體，接種于愈傷組織誘導培養基上誘導培養出愈傷組織；將誘導出的愈傷組織繼代培養在愈傷組織優化與増殖培養基上，優化篩選出胚性狀態良好的胚性愈傷組織；通過控制培養基中激素和維生素含量，尤其是2，4-D與NAA濃度的配比關系，建立穩定的紅姜花胚性細胞懸浮培養系；進行體胚誘導時，通過控制培養基中的無機鹽及TDZ的含量，誘導出大量成熟的體胚；在體胚萌發過程中，通過控制培養基中的無機鹽及6-ΒΑ的含量，使體胚獲得高頻率的萌發，進而發育成健壯的紅姜花再生小植株。本發明具有如下的優點及效果(I)本發明以紅姜花未成熟的花絲和/或花藥為外植體進行愈傷組織的誘導，經過優化、篩選、繼代培養獲得高質量的胚性愈傷組織。將胚性愈傷組織進行懸浮培養，建立紅姜花的胚性細胞懸浮培養系。利用胚性細胞懸浮培養物進行體胚誘導可獲得大量體胚，采用SH無機鹽、150 μ g ·じ1TDZ時可獲得最佳效果，其體胚發生頻率可達到4429個/mLSCV。(2)所獲得的體胚在體胚萌發培養基上可萌發出帶有芽、根的幼苗，當以SH為基本培養基、6-BA為I. Omg ·じ1時，體胚的萌發頻率可達100% ;幼苗轉移到成苗培養基中，可獲得健壯的再生小植株；所獲得的再生小植株可直接移栽到裝有富含有機質的培養土的花盆中，在蔭棚中成活。(3)本發明提供一種通過紅姜花體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法，為紅姜花的離體快速繁殖和生物技術育種奠定基礎，有利于大規模的推廣應用，具有較好的應用前景。


圖I為實施例I紅姜花胚性細胞懸浮系的建立及其經體胚發生途徑再生植株的過程圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進ー步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
本實施例所需各種培養基如下愈傷組織誘導培養基MS培養基+ (2 4) mg ·じ12，4-D+ (2 4)mg ·じ1 NAA+lmg ·じ16_BA+30g ·じ1鹿糖+7g ·じ1瓊脂粉，pH 5. 8,高溫高壓滅菌；愈傷組織篩選優化與增殖培養基MS培養基+1 2mg ·じ12，4-D+ (O. 25 I. O)mg ·じ1NAA+ (O. 25 I. O) mg ·じ16_BA+30g ·じ1 鹿糖 +7g ·じ1 瓊脂粉，pH 5. 8,高溫高壓滅菌；液體培養基MS培養基的無機鹽+IOOmg ·じ1麥芽水解物+IOOmg ·じ1谷氨酰胺+230mg · L 1 腦氛酸 + (O. 02 O. 25) mg · L 1NAA+ (O. 5 I) mg · L 4，4_D+B5 培養基的維生素+45g ·じ1鹿糖，pH 5. 3,高溫高壓滅菌；體胚誘導培養基SH培養基(Schenk和Hildebrandt, 1972)的無機鹽+IOOmg *L 1麥芽提取物+IOOmg じ1谷氨酰胺+230mg じ1月甫氨酸+ (O. 02 O. 25) mg じ1NAA+ (50 250) yg*じ1TDZ+B5培養基的維生素+45g ·じ1蔗糖+7g ·じ1瓊脂粉，高溫高壓滅菌；體胚萌發培養基SH培養基(Schenk和Hildebrandt, 1972)的無機鹽+ (O. 25 2. O) mg ·じ16-BA+O. 2mg ·じ1NAA+MS培養基的維生素+30g ·じ1蔗糖+Ig ·じ1瓊脂粉，pH5. 8,聞溫聞壓滅囷；生根壯苗培養基1/2MS培養基+30g ·じ1蔗糖+0. lwt%活性炭+7g ·じ1瓊脂粉，pH 5. 8,聞溫聞壓滅囷；所述的高溫高壓滅菌為在121°C、1. 06kg/cm2滅菌15min ；實施例I建立紅姜花高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，包括如下步驟(I)姜花品種的選取選用的品種為開花繁密、花艷麗、花期長、可直接用于園林布置和進行花丼育種材料的紅姜花(Hedychium coccineum Buch.-Ham),未成熟花序取自仲愷農業工程學院番禹試驗基地；(2)愈傷組織的誘導和胚性愈傷組織的優化增殖于6月中旬到7月中旬取紅姜花未成熟的花序小花，用自來水沖洗30min,然后用O. lwt%HgCl2消毒IOmin,用無菌水沖洗5遍；在超凈工作臺上剝除外部苞片，切取花藥和花絲為O. 5cm的條段，接種于愈傷組織誘導培養基上，于28土 1°C黑暗條件下培養4個月，誘導出紅姜花的愈傷組織；愈傷組織誘導培養基為MS培養基+4mg ·じ12，4-D+4mg ·じ1NAA+lmg ·じ16_BA+30g ·じ1蔗糖+7g ·じ1瓊脂粉，pH5. 8，高溫高壓滅菌；將誘導出的愈傷組織繼代接種到愈傷組織優化與増殖培養基中，經過3月的篩選，得到黃白色的粉狀胚性愈傷組織；愈傷組織優化與增殖培養基為MS培養基+O. 5mg·じ12，4-D+O. 5mg じ1ΝΑΑ+0. 25mg じ16_BA+30g じ1 鹿糖+7g じ1 瓊脂粉,pH 5. 8,高溫高壓滅菌；(3)均一穩定的紅姜花胚性細胞懸浮系的建立將步驟(2)得到的黃白色粉狀胚性愈傷組織O. 5g轉入含30mL液體培養基的IOOmL錐形瓶中，置于28土 1°C、90 IlOrpm搖床上黑暗培養2個月，在培養的第一個月每周吸棄2/3的培養液，用等體積的新鮮的液體培養基補充，同時用900 μ m孔徑篩網過濾除去不易分散的大顆粒，其后每2周更換一次培養基，再繼代ー個月后，得到分散、均質的紅姜花胚性細胞懸浮培養系；液體培養基的組成為MS培養基的無機鹽+IOOmg ·じ1麥芽水解物+IOOmg ·じ1谷氨酰胺+230mg ·じ1脯氨酸+0. 25mg ·じ1ΝΑΑ+0. 5mg ·じ12，4_D+B5培養基的維生素+45g ·じ1鹿糖，pH 5. 3,高溫高壓滅菌；繼代I個培養周期后，細胞増殖系數為3. I (一個培養周期(14d)結束后，細胞增殖總體積除以接種細胞體積的值為細胞増殖系數；下同。);(4)紅姜花體細胞胚胎的誘導吸取ImL 10%SCV懸浮培養物(取步驟(3)得到的胚性細胞懸浮培養系于IOmL刻度管中，靜置，直到獲得細胞沉淀lmL，棄上清液，將所得的細胞沉淀用不含瓊脂粉的體胚誘導培養基稀釋至總體積10mL，此時細胞體積含量為總體積的10%，即為10%SCV懸浮培養物；下同。)接種于體胚誘導培養基中，置于28±1°C黑暗中進行體胚的誘導；培養20d后，得到成熟體胚，體胚發生頻率達2513個/mL SCV細胞；體胚誘導培養基的組成為=SH培養基(Schenk和Hildebrandt，1972)的無機鹽+IOOmg ·じ1麥芽提取物+IOOmg ·じ1谷氨酰胺+230mg ·じ1月甫氨酸+0. 25mg ·じ1ΝΑΑ+50 μ g ·じ1TDZ+B5培養基的維生素+45g ·じ1蔗糖+7g ·じ1瓊脂粉；(5)紅姜花體胚的萌發及植株再生將步驟(4)誘導出的成熟體胚轉入萌發培養基中，置于28土 1°C黑暗培養，體胚萌發率為96% ;待植株長到2cm后，將其轉至生根壯苗培 養基中，于30 μ mol · πΓΥ1光強(白色熒光燈)、16L/8D光周期條件下繼續培養ー個月，進ー步發育成健壯的紅姜花小植株；植株轉換率約為100%。體胚萌發培養基為SH培養基(Schenk 和 Hildebrandt, 1972)的無機鹽 +0. 25mg · L ^-BA+O. 2mg · L ^AA+MS 培養基的維生素+30g ·じ1蔗糖+7g ·じ1瓊脂粉，pH 5.8,高溫高壓滅菌；(6)幼苗轉移到成苗培養基中，可獲得健壯的再生小植株；所獲得的再生小植株不需要馴化，直接轉移到裝有培養土的花盆，在蔭棚中成活。圖I為實施例I紅姜花胚性細胞懸浮系的建立及其經體胚發生途徑再生植株的過程，其中A、紅姜花花序(bar=6cm) ;B、小花(bar=3cm) ;C、除去荀片的小花(bar=3cm) ;D、花絲和花藥(bar=3cm) ;E、培養4個月剛出的愈傷組織(bar=lcm) ;F、篩選與優化獲得的胚性愈傷組織(bar=5mm) ;G、從胚性愈傷組織建立的穩定的胚性細胞懸浮系(bar=2. 5cm) ;H、從胚性細胞懸浮系所誘導的體胚(bar=5mm) ;1、體胚萌發出苗(bar=2cm) ;J、從叢生胚所誘導的叢生芽(bar=lcm) ;K、再生小植株(bar=lcm)。實施例2建立紅姜花高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，包括如下步驟(I)姜花品種的選取選用的品種為開花繁密、花艷麗、花期長、可直接用于園林布置和進行花丼育種材料的紅姜花(Hedychium coccineum Buch.-Ham),未成熟花序取自仲愷農業工程學院番禹試驗基地；(2)愈傷組織的誘導和胚性愈傷組織的優化增殖于6月中旬到7月中旬取紅姜花未成熟的花序小花，用自來水沖洗30min,然后用O. lwt%HgCl2消毒12min,用無菌水沖洗4適；在超凈工作臺上剝除外部苞片，切取花藥和花絲為O. 5cm的條段，接種于愈傷組織誘導培養基上，于28土 1°C黑暗條件下培養4個月，誘導出紅姜花的愈傷組織；愈傷組織誘導培養基為MS培養基+2mg ·じ12，4-D+3mg ·じ1NAA+lmg ·じ16_BA+30g ·じ1蔗糖+7g ·じ1瓊脂粉，pH5. 8，高溫高壓滅菌；將誘導出的愈傷組織繼代接種到愈傷組織優化與増殖培養基中，經過2個月的篩選，得到黃白色的粉狀胚性愈傷組織；愈傷組織優化與増殖培養基為MS培養基+lmg·じ12，4-D+O. 25mg じ1 ΝΑΑ+0. 5mg じ16_BA+30g じ1 鹿糖 +7g じ1 瓊脂粉，pH 5. 8,高溫高壓滅菌；(3)均一穩定的紅姜花胚性細胞懸浮系的建立將步驟(2)的黃白色粉狀胚性愈傷組織1.5g轉入含30mL液體培養基的IOOmL錐形瓶中，置于28± 1°C、90 IIOrpm搖床上黑暗培養2個月，在培養的第一個月每周吸棄2/3的培養液，用等體積的新鮮的液體培養基補充，同時用900 μ m孔徑篩網過濾除去不易分散的大顆粒，其后每2周更換一次培養基，再繼續培養ー個月，得到分散、均質的紅姜花胚性細胞懸浮培養系；液體培養基的組成為MS培養基的無機鹽+IOOmg ·じ1麥芽水解物+IOOmg ·じ1谷氨酰胺+230mg ·じ1脯氨酸+0. Img ·じ1ΝΑΑ+0. 75mg ·じ12，4_D+B5培養基的維生素+130mmol ·じ1鹿糖，pH 5. 3,高溫高壓滅菌；繼代I個培養周期后，細胞増殖系數為2. 3 ；(4)紅姜花體細胞胚胎的誘導吸取I. 5mL 10%SCV懸浮培養物接種于體胚誘導培養基中，置于28±1°C黑暗中進行體胚的誘導；培養20d后，得到成熟體胚，體胚發生頻率高達3657個/mL SCV細胞；體胚誘導培養基的組成為SH培養基(Schenk和Hildebrandt，1972)的無機鹽+IOOmg じ1麥芽提取物+IOOmg じ1谷氨酰胺+230mg ·じ1脯氨酸+0. Img ·じ1ΝΑΑ+100 μ g ·じ1TDZ+B5培養基的維生素+45g ·じ1蔗糖+7g ·じ1瓊脂粉；(5)紅姜花體胚的萌發及植株再生將步驟(4)誘導出的成熟體胚轉入萌發培養基中，置于28土1°C黑暗培養，體胚萌發率為100%;待植株長到2cm后，將其轉至生根壯苗培養基中，于30 μ mol · Hi-2S-1光強(白色熒光燈)、16L/8D光周期條件下繼續培養ー個月，進ー步發育成健壯的紅姜花小植株；植株轉換率約為100%。體胚萌發培養基為SH培養基(Schenk 和 Hildebrandt, 1972)的無機鹽 +0. 5mg · L ^-BA+O. 2mg · L ^AA+MS 培養基的維生素+30g ·じ1蔗糖+7g ·じ1瓊脂粉，pH 5.8,高溫高壓滅菌；(6)幼苗轉移到成苗培養基中，可獲得健壯的再生小植株；所獲得的再生小植株不需要馴化，直接轉移到裝有培養土的花盆，在蔭棚中成活。實施例3建立紅姜花高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，包括如下步驟(I)姜花品種的選取選用的品種為開花繁密、花艷麗、花期長、可直接用于園林布置和進行花丼育種材料的紅姜花(Hedychium coccineum Buch.-Ham),未成熟花序取自仲愷農業工程學院番禹試驗基地；(2)愈傷組織的誘導和胚性愈傷組織的優化增殖于6月中旬到7月中旬取紅姜花未成熟的花序小花，用自來水沖洗30min,然后用O. lwt%HgCl2消毒8min,用無菌水沖洗6遍；在超凈工作臺上剝除外部苞片，切取花藥和花絲為O. 5cm的條段，接種于愈傷組織誘導培養基上，于28土 1°C黑暗條件下培養4個月，誘導出紅姜花的愈傷組織；愈傷組織誘導培養基為MS培養基+3mg ·じ12，4-D+2mg ·じ1NAA+lmg ·じ16_BA+30g ·じ1蔗糖+7g ·じ1瓊脂粉，pH5. 8,聞溫聞壓滅囷；將誘導出的愈傷組織繼代接種到愈傷組織優化與増殖培養基中，經過4個月的篩選，得到黃白色的粉狀胚性愈傷組織；愈傷組織優化與増殖培養基為MS培養基+2mg·じ12，4-D+l. Omg ·じ1NAA+1. Omg ·じ16_BA+30g ·じ1鹿糖+7g ·じ1瓊脂粉，pH 5. 8,高溫高壓滅菌；(3)均一穩定的紅姜花胚性細胞懸浮系的建立將步驟(2)的黃白色粉狀胚性愈傷組織2. 0g，轉入含30mL液體培養基的IOOmL錐形瓶中，置于28± I°C、90 IlOrpm搖床上黑暗培養2個月，在培養的第一個月每周吸棄2/3的培養液，用等體積的新鮮的液體培養基補充，同時用900 μ m孔徑篩網過濾除去不易分散的大顆粒，其后每2周更換一次培養基，再繼續培養ー個月，得到分散、均質的紅姜花胚性細胞懸浮培養系；液體培養基的組成為MS培養基的無機鹽+IOOmg ·じ1麥芽水解物+IOOmg ·じ1谷氨酰胺+230mg ·じ1脯氨酸+0. 15mg ·じ1NAA+1. Omg ·じ12，4_D+B5培養基的維生素+45g ·じ1鹿糖，pH 5. 3,高溫高壓滅菌；繼代I個培養周期后，細胞増殖系數為I. 8 ；(4)紅姜花體細胞胚胎的誘導吸取I. 5mL 10%SCV懸浮培養物接種于體胚誘導培養基中，置于28±1°C黑暗中進行體胚的誘導；培養20d后，得到成熟體胚，體胚發生頻率高達4429個/mL SCV細胞；體胚誘導培養基的組成為SH培養基(Schenk和Hildebrandt，1972)的無機鹽+IOOmg じ1麥芽提取物+IOOmg じ1谷氨酰胺+230mg ·じ1脯氨酸+0. 02mg ·じ1ΝΑΑ+150 μ g ·じ1TDZ+B5培養基的維生素+45g ·じ1蔗糖+7g ·じ1瓊脂粉；(5)紅姜花體胚的萌發及植株再生將步驟(4)誘導出的成熟體胚轉入萌發培養基中，置于28土1°C黑暗培養，體胚萌發率為100%;待植株長到2cm后，將其轉至生根壯苗培養基中，于30 μ mol · Hi-2S-1光強(白色熒光燈)、16L/8D光周期條件下繼續培養ー個月，進ー步發育成健壯的紅姜花小植株；植株轉換率約為100%。體胚萌發培養基為SH培養基(Schenk 和 Hildebrandt, 1972)的無機鹽 +1. Omg · L ^-BA+O. 2mg · L ^AA+MS 培養基的維生素+30g ·じ1蔗糖+7g ·じ1瓊脂粉，pH 5.8,高溫高壓滅菌；(6)幼苗轉移到成苗培養基中，可獲得健壯的再生小植株；所獲得的再生小植株不需要馴化，直接轉移到裝有培養土的花盆，在蔭棚中成活。實施例4建立紅姜花高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，包括如下步驟
(I)姜花品種的選取選用的品種為開花繁密、花艷麗、花期長、可直接用于園林布置和進行花丼育種材料的紅姜花(Hedychium coccineum Buch. -Ham)未成熟花序取自仲十豈農業工程學院番禹試驗基地；(2)愈傷組織的誘導和胚性愈傷組織的優化增殖于6月中旬到7月中旬取紅姜花未成熟的花序小花，用自來水沖洗30min,然后用O. lwt%HgCl2消毒12min,用無菌水沖洗6遍；在超凈工作臺上剝除外部苞片，切取花絲為O. 5cm的條段，接種于愈傷組織誘導培養基上，于28土 1°C黑暗條件下培養4個月，誘導出紅姜花的愈傷組織；愈傷組織誘導培養基為MS 培養基 +3mg ·じ12，4-D+4mg ·じ1NAA+lmg ·じ16_BA+30g ·じ1 蔗糖 +7g ·じ1 瓊脂粉，pH 5. 8,聞溫聞壓滅囷；將誘導出的愈傷組織繼代接種到愈傷組織優化與増殖培養基中，經過2個月的篩選，得到黃白色的粉狀胚性愈傷組織；愈傷組織優化與増殖培養基為MS培養基+
4-D+O. 25mg じ1ΝΑΑ+0. 25mg じ16_BA+30g じ1 鹿糖 +7g じ1 瓊脂粉,pH 5. 8,高溫高壓滅菌；(3)均一穩定的紅姜花胚性細胞懸浮系的建立將步驟(2)的黃白色粉狀胚性愈傷組織I. Og轉入含30mL液體培養基的IOOmL錐形瓶中，置于28土 1°C、90 IlOrpm搖床上黑暗培養2個月，在培養的第一個月每周吸棄2/3的培養液，用等體積的新鮮的液體培養基補充，同時用900 μ m孔徑篩網過濾除去不易分散的大顆粒，其后每2周更換一次培養基，再繼續培養ー個月，得到分散、均質的紅姜花胚性細胞懸浮培養系；液體培養基的組成為MS培養基的無機鹽+IOOmg ·じ1麥芽水解物+IOOmg ·じ1谷氨酰胺+230mg ·じ1脯氨酸+0.02mg じ1ΝΑΑ+0. 75mg じ12，4_D+B5培養基的維生素+45g じ1鹿糖，pH 5. 3,高溫高壓滅菌；繼代I個培養周期后，細胞細胞增殖系數為2. 4 ；(4)紅姜花體細胞胚胎的誘導吸取2. OmL 10%SCV懸浮培養物接種于體胚誘導培養基中，置于28±1°C黑暗中進行體胚的誘導；培養20d后，得到成熟體胚，體胚發生頻率高達3391個/mL SCV細胞；體胚誘導培養基的組成為SH培養基(Schenk和Hildebrandt，1972)的無機鹽+IOOmg じ1麥芽提取物+IOOmg じ1谷氨酰胺+230mg ·じ1脯氨酸+0. 15mg ·じ1ΝΑΑ+200 μ g ·じ1TDZ+B5培養基的維生素+45g ·じ1蔗糖+7g ·じ1瓊脂粉；(5)紅姜花體胚的萌發及植株再生將步驟(4)誘導出的成熟體胚轉入萌發培養基中，置于28土1°C黑暗培養，體胚萌發率為100%;待植株長到2cm后，將其轉至生根壯苗培養基中，于30 μ mol · Hi-2S-1光強(白色熒光燈)、16L/8D光周期條件下繼續培養ー個月，進ー步發育成健壯的紅姜花小植株；植株轉換率 約為100%。體胚萌發培養基為SH培養基(Schenk 和 Hildebrandt, 1972)的無機鹽 +0. 5mg · L ^-BA+O. 2mg · L ^AA+MS 培養基的維生素+30g ·じ1蔗糖+7g ·じ1瓊脂粉，pH 5.8,高溫高壓滅菌；(6)幼苗轉移到成苗培養基中，可獲得健壯的再生小植株；所獲得的再生小植株不需要馴化，直接轉移到裝有培養土的花盆，在蔭棚中成活。實施例5建立紅姜花高效體細胞胚胎發生再生植株的方法，包括如下步驟(I)姜花品種的選取選用的品種為開花繁密、花艷麗、花期長、可直接用于園林布置和進行花丼育種材料的紅姜花(Hedychium coccineum Buch.-Ham),未成熟花序取自仲愷農業工程學院番禹試驗基地；(2)愈傷組織的誘導和胚性愈傷組織的優化增殖于6月中旬到7月中旬取紅姜花未成熟的花序小花，用自來水沖洗30min,然后用O. lwt%HgCl2消毒12min,用無菌水沖洗6遍；在超凈工作臺上剝除外部苞片，切取花藥為O. 5cm的條段，接種于愈傷組織誘導培養基上，于28土 1°C黑暗條件下培養4個月，誘導出紅姜花的愈傷組織；愈傷組織誘導培養基為MS 培養基 +4mg ·じ12，4-D+3mg ·じ1NAA+lmg ·じ16_BA+30g ·じ1 蔗糖 +7g ·じ1 瓊脂粉，pH 5. 8,聞溫聞壓滅囷；將誘導出的愈傷組織繼代接種到愈傷組織優化與増殖培養基中，經過2個月的篩選，得到黃白色的粉狀胚性愈傷組織；愈傷組織優化與増殖培養基為MS培養基+lmg·じ12，4-D+O. 5mg ·じ1 NAA+lmg ·じ16_BA+30g ·じ1鹿糖+7g ·じ1瓊脂粉，pH 5. 8,高溫高壓滅菌；(3)均一穩定的紅姜花胚性細胞懸浮系的建立將步驟(2)的黃白色粉狀胚性愈傷組織I. 5g轉入含30mL液體培養基的IOOmL錐形瓶中，置于28±1°C、90 IlOrpm搖床上黑暗培養2個月，在培養的第一個月每周吸棄2/3的培養液，用等體積的新鮮的液體培養基補充，同時用900 μ m孔徑篩網過濾除去不易分散的大顆粒，其后每2周更換一次培養基，繼續培養ー個月，得到分散、均質的紅姜花胚性細胞懸浮培養系；液體培養基的組成為MS培養基的無機鹽+IOOmg ·じ1麥芽水解物+IOOmg ·じ1谷氨酰胺+230mg ·じ1脯氨酸+0. 02mg ·じ1NAA+lmg ·じ12，4_D+B5培養基的維生素+45g じ1蔗糖，pH 5. 3，高溫高壓滅菌；繼代I個培養周期后，細胞増殖系數為I. 6 ；(4)紅姜花體細胞胚胎的誘導吸取I. OmL 10%SCV的懸浮培養物接種于體胚誘導培養基中，置于28±1°C黑暗中進行體胚的誘導；培養20d后，得到成熟體胚，體胚發生頻率高達2889個/mL SCV細胞；體胚誘導培養基的組成為SH培養基(Schenk和Hildebrandt，1972)的無機鹽+IOOmg じ1麥芽提取物+IOOmg じ1谷氨酰胺+230mg ·じ1脯氨酸+0. Img ·じ1ΝΑΑ+250 μ g ·じ1TDZ+B5培養基的維生素+45g ·じ1蔗糖+7g ·じ1瓊脂粉，高溫高壓滅菌；(5)紅姜花體胚的萌發及植株再生將步驟(4)誘導出的成熟體胚轉入萌發培養基中，置于28土 1°C黑暗培養，體胚萌發率為85% ;待植株長到2cm后，將其轉至生根壯苗培養基中，于30 μ mol · πΓΥ1光強(白色熒光燈)、16L/8D光周期條件下繼續培養ー個月，進ー步發育成健壯的紅姜花小植株；植株轉換率約為100%。體胚萌發培養基為SH培養基(Schenk 和 Hildebrandt, 1972)的無機鹽 +2. Omg · L ^-BA+O. 2mg · L ^AA+MS 培養基的維生素+30g ·じ1蔗糖+7g ·じ1瓊脂粉，pH 5.8,高溫高壓滅菌；(6)幼苗轉移到成苗培養基中，可獲得健壯的再生小植株；所獲得的再生小植株不需要馴化，直接轉移到裝有培養土的花盆，在蔭棚中成活。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。·
權利要求
1.一種通過紅姜花體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)愈傷組織的誘導和胚性愈傷組織的優化增殖以紅姜花未成熟的花絲和/或花藥為外植體，接種于愈傷組織誘導培養基上誘導培養出愈傷組織；將誘導出的愈傷組織繼代培養在愈傷組織優化與增殖培養基上，得到黃白色粉狀的胚性愈傷組織； (2)均一穩定的胚性細胞懸浮培養系的建立將步驟(I)的黃白色粉狀的胚性愈傷組織O. 5 2. Og轉入液體培養基中，置于90 IlOrpm搖床上懸浮培養I 2個月，得到分散、均質的胚性細胞懸浮培養系； (3)體細胞胚胎的誘導取步驟(2)得到的胚性細胞懸浮培養系，調整細胞密度為10%SCV懸浮培養物，取O. 5 2. OmL 10%SCV懸浮培養物接種于體胚誘導培養基中，置于28±1°C黑暗中進行體細胞胚胎誘導，得到成熟體細胞胚胎； (4)體細胞胚胎的萌發及其植株再生將步驟(3)誘導出的成熟體細胞胚胎轉入體胚萌發培養基中，置于28土 1°C黑暗培養，待葉鞘抽出后，將其轉至生根壯苗培養基中繼續培養，進一步發育成健壯的紅姜花再生小植株； 所述的愈傷組織誘導培養基的組成為=MS培養基+ (2 4) mg · 1^2，4-D+ (2 4)mg · L^1NAA+Img · L_16-BA+30g · L—1 鹿糖 +7g · L—1 瓊脂粉，pH 5. 8,高溫高壓滅菌； 所述的愈傷組織優化與增殖培養基的組成為MS培養基+(O. 25 l)mg · L 1NAA+ (O. 25 l)mg · L ^-BA+SOg · L 1 鹿糖 +7g · L 1 瓊脂粉，pH 5. 8，高溫高壓滅菌； 所述的液體培養基的組成為MS培養基的無機鹽+IOOmg · Γ1麥芽水解物+IOOmg · Γ1谷氛酸胺 +230mg · L 1 腦氛酸 + (O. 02 O. 25) mg · L 1NAA+ (O. 5 I) mg · L 4，4_D+B5 培養基的維生素+45g · Γ1蔗糖，pH 5. 3，高溫高壓滅菌。
2.根據權利要求I所述的一種通過紅姜花體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法，其特征在于 所述的體胚誘導培養基的組成為SH培養基的無機鹽+IOOmg 麥芽提取物+IOOmg · L 1 谷氛酸胺 +230mg · L 1 腦氛酸 + (O. 02 O. 25) mg · L 1NAA+ (50 250)μ g · L^TDZ+B5培養基的維生素+45g · L-1蔗糖+7g · L-1瓊脂粉，pH 5. 8，高溫高壓滅菌； 所述的體胚萌發培養基的組成為SH培養基的無機鹽+ (O. 25 2. O)mg · L-VBA+O. 2mg · L^NAA+MS 培養基的維生素 +30g · L-1 蔗糖 +7g · L-1 瓊脂粉，pH 5. 8，高溫高壓滅菌； 所述的生根壯苗培養基的組成為1/2MS培養基+30g噸―1蔗糖+0. 1 丨％活性炭+7g -Γ1瓊脂粉，pH 5. 8,聞溫聞壓滅囷。
3.根據權利要求I所述的一種通過紅姜花體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法，其特征在于 所述的愈傷組織誘導培養基的組成為MS培養基+4mg -1^2, 4-D+4mg -L^NM+lmg *^6-BA+30g · L-1蔗糖+7g · L-1瓊脂粉，pH 5. 8，高溫高壓滅菌； 所述的愈傷組織優化與增殖培養基的組成為MS培養基+Img -1^2, 4-D+O. 25mg -L^1NAA+0. 25mg · L_16-BA+30g · L—1 鹿糖 +7g · L—1 瓊脂粉，pH 5. 8,高溫高壓滅菌； 所述的液體培養基的組成為MS培養基的無機鹽+IOOmg · Γ1麥芽水解物+IOOmg · Γ1谷氨酰胺 +230mg · L-1 脯氨酸 +0. 02mg · L^1NAA+Img · 1^2, 4_D+B5 培養基的維生素 +45g · L-1鹿糖，pH 5. 3,高溫高壓滅菌。
4.根據權利要求2所述的一種通過紅姜花體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法，其特征在于 所述的體胚誘導培養基的組成為SH培養基的無機鹽+IOOmg 麥芽提取物+IOOmg · L-1 谷氨酰胺 +230mg · L-1 脯氨酸 +0. 25mg · L^1NAA+150 μ g · L_1TDZ+B5 培養基的維生素+45g · Γ1蔗糖+7g · Γ1瓊脂粉，pH 5.8,高溫高壓滅菌； 所述的體胚萌發培養基的組成為SH培養基的無機鹽+1. Omg · L—VBA+O. 2mg · L^NAA+MS 培養基的維生素 +30g · L-1 蔗糖 +7g · L-1 瓊脂粉，pH5. 8，聞溫聞壓滅囷。
5.根據權利要求I所述的一種通過紅姜花體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法，其特征在于步驟(I)中 所述的紅姜花為6月中旬到7月中旬的紅姜花未成熟的花序小花； 所述的花序小花采用以下方法進行前處理取紅姜花未成熟的花序小花，用自來水沖洗30min，然后用O. lwt%HgCl2消毒8 12min，用無菌水沖洗4 6遍；剝除外部苞片，切取花藥和/或花絲備用。
6.根據權利要求I所述的一種通過紅姜花體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法，其特征在于步驟(I)中 所述的誘導培養為于28±1°C黑暗條件下培養4個月；所述的繼代培養的時間為2 4個月。
7.根據權利要求I所述的一種通過紅姜花體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法，其特征在于步驟(2)中 所述的液體培養基的體積為30mL ;所述的懸浮培養的溫度為28±1°C ； 所述的懸浮培養I 2個月采用以下方法進行在培養的第一個月每周吸棄2/3的培養液，用等體積的新鮮的液體培養基補充，同時用900 μ m孔徑篩網過濾除去不易分散的大顆粒，其后每2周更換一次培養基，再繼代一個月后，得到分散、均質的紅姜花胚性細胞懸浮培養系。
8.根據權利要求I所述的一種通過紅姜花體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法，其特征在于步驟(3)中 所述的10%SCV懸浮培養物按下述方法制備得到吸取步驟(2)得到的胚性細胞懸浮培養系于IOmL刻度管中，靜置，直到獲得細胞沉淀lmL，棄上清液，將所得的細胞沉淀用不含瓊脂粉的體胚誘導培養基稀釋至總體積10mL，得10%SCV懸浮培養物，此時細胞體積含量為總體積的10% ； 所述的紅姜花細胞接種量為O. 5 2. OmL 10%SCV懸浮培養物。
9.根據權利要求I所述的一種通過紅姜花體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法，其特征在于步驟(3)中 所述的體胚誘導培養基采用以下方法進行配制將TDZ配制成100 μ g ml/1母液,過濾滅菌后添加到PH 5. 8、經高溫高壓滅菌后降至45°C的含有其余培養基成分的培養基中，混合均勻，得到體胚誘導培養基；所述的體細胞胚胎誘導的時間為20天。
10.根據權利要求I所述的一種通過紅姜花體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法，其特征在于步驟(4)中所述的繼續培養為30μπιΟ1 -Hi-2S-1光強、16L/8D光條件下繼續培養一個月。
全文摘要
本發明公開了一種通過紅姜花體細胞胚胎發生途徑高效再生植株的方法。該方法以紅姜花未成熟的花絲和花藥為外植體進行愈傷組織的誘導，經過優化、篩選、繼代培養獲得高質量的胚性愈傷組織，將胚性愈傷組織進行懸浮培養，建立紅姜花的胚性細胞懸浮培養系。利用胚性細胞懸浮培養物進行體胚誘導可獲得大量體胚，采用SH無機鹽、150μg·L-1TDZ時可獲得最佳效果，其體胚發生頻率可達到4429個/mL SCV；所獲得的體胚在體胚萌發培養基上可萌發出帶有芽、根的幼苗，當以SH為基本培養基、6-BA為0.5～1.0mg·L-1時，體胚的萌發頻率可達100%。本發明為紅姜花的離體快速繁殖和生物技術育種奠定基礎，有利于大規模的推廣應用，具有較好的應用前景。
文檔編號A01H4/00GK102845309SQ20121037669
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者肖望, 涂紅艷, 鄧崇會, 陳愛葵 申請人:廣東第二師范學院