專利名稱：一種抑制山核桃外植體褐化的方法
技術領域：
本發明涉及林木種苗繁殖技術，具體是涉及一種抑制山核桃外植體褐化的方法。
背景技術：
山核桃(Carya cathayensis Sarg)是胡桃科山核桃屬落葉喬木,集中分布于北諱29° 30' 30° 35'，東經118° 45' 119° 25'范圍內的安徽寧國、績溪，浙江臨安、
淳安等區域。山核桃是南方地區重要的木本油料和干果樹種，果實炒熟后色味香美，果仁香脆可口，為大眾所喜愛。經測定其干仁含油率69. 8 74.1 %，蛋白質含量7. 8 9. 6%;包含8種脂肪酸，17種氨基酸，其中人體必須的氨基酸占7種；山核桃果肉中還具有22種礦物質 元素，有極高的營養價值，并且有降低血脂，預防冠心病之功效；長期食用，還對癌癥具有一定的預防效果。目前，山核桃生產上使用的繁殖方法主要采用播種繁殖，其苗期長、質量參差不齊且苗木易退化，嚴重阻礙了生產的發展；山核桃植株受傷后，其體內的PPO活性隨著酚類物質含量的增加而提高，在植株受傷處形成褐色壞死層，嚴重阻礙了山核桃嫁接和扦插繁殖的成活率；在山核桃的組織培養研究中，外植體的褐化問題也是阻礙其組織培養的主要因素之一，抑制山核桃外植體的褐變研究不僅對其組織培養，也對其無性繁殖具有重大意義。

發明內容
為了解決現有技術中存在的技術問題，本發明的目的在于提供一種能夠顯著降低山核桃外植體的褐變率以及提高其誘導率的抑制山核桃外植體褐化的方法。為了達到上述目的，本發明所采用的技術方案如下—種抑制山核桃外植體褐化的方法，其特征在于，于春季選取山核桃帶腋芽莖段作為外植體，對外植體進行消毒處理，再將外植體接種于添加了兒茶素和抗褐化劑的培養基中，接種初期先將組培瓶置于低溫黑暗環境下培養，然后轉入常規培養環境。優選地，所述培養基包括基本培養基和附加成分，基本培養基為WPM基本培養基、DKff基本培養基、MS基本培養基或B5基本培養基。最優選地，所述基本培養基為WPM基本培養基。進一步，附加成分為6-芐基氨基嘌呤4 6mg/L、6-呋喃甲基腺嘌呤O. 5 2. Omg/L、2,4- 二氯苯氧乙酸O. 05 O. 2mg/L、a-萘乙酸O. 04 O. 06mg/L、瓊脂7 8g/L、鹿糖20 30g/L。研究表明，不同種類的基本培養基對于外植體褐化的抑制效果不同，本發明通過對基本培養基基本種類的研究，篩選得到最適合山核桃誘導培養的基本培養基，即WPM基本培養基，接種于此的外植體外植體褐變率最低，且誘導率較高。同時，由于抗氧化劑對山核桃外植體抗褐化具有重要的影響，本發明選擇具有較強的抗氧化作用的茶葉中的兒茶素作為抗氧化劑，抗氧化效果較好。
優選地，所述兒茶素的濃度為2 4g/L。優選地，所述抗褐化劑的濃度為O. 01 3g/L。進一步，所述抗褐化劑為聚乙烯吡咯烷酮、活性碳、硫代硫酸鈉、硝酸銀和維生素C中的一種或多種。優選地，所述抗褐化劑為O. 05 O. lg/L硝酸銀。優選地，所述抗褐化劑為O. 3 O. 5g/L硫代硫酸鈉。優選地，所述抗褐化劑為O. 3 O. 5g/L聚乙烯吡咯烷酮。
本發明抑制山核桃外植體褐化的方法，通過兒茶素配合抗褐化劑對山核桃外植體抗褐化的篩選，結果顯示3g/L兒茶素與O. 05g/L硝酸銀為最佳的抗褐化劑種類及濃度，其抗褐化率約為74. 58%，誘導率約為30. 48%。同時，3g/L兒茶素與O. 3g/L硫代硫酸鈉的組合，其抗褐化效果也較好，其抗褐化率和誘導率分別約為73. 38%和31. 32%。另外，本發明在接種后，先將培養瓶置于低溫黑暗環境下培養，可以較有效控制褐化，其抗褐化率為80. 76%，同時保證芽的誘導率，誘導率為22. 24%。相對于未置于低溫黑暗培養的外植體(抗褐化率為76. 76%，誘導率為23. 42% )具有較顯著的抑制外植體褐化的效果。本發明抑制山核桃外植體褐化的方法，能夠顯著降低山核桃外植體的褐變率以及提高其誘導率，操作簡便，抑制褐化效果較好，為山核桃組織培養以及山核桃無性繁殖提供技術依托。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例1抑制山核桃外植體褐化的方法，包括如下步驟①、消毒處理以春季山核桃優樹當年生帶腋芽莖段作為外植體，用流水沖洗I 2h后，以多菌靈(1000重量倍液)浸泡30min，再置于超凈工作臺，以75%酒精(體積百分比)浸泡90s，無菌水清洗3次，再用O.1 %的升汞(氯化汞)浸泡15min，無菌水清洗3次。②、培養基配制以IL (總的)培養基(pH調至5. 8 6. O)計，培養基中含有兒茶素3g。附加成分為6_節基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine) 5mg、6_呋喃甲基腺嘌呤(Kinetin,激動素)lmg、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenyloxy acetic acid)O.1mg>a-萘乙酸(A-naphthlceticacid) 0. 05mg、瓊月旨 7. 5g、鹿糖 30g。硝酸銀(抗褐化劑)0. 05g。余量為WPM基本培養基(按現有技術配制)。③、接種將消毒好的帶腋芽莖段修剪好接入配置好的培養基中，先置于10°C、黑暗條件下培養48h，隨后再轉至環境溫度為25°C，光照時間為12h .(Γ1，光照強度為12001χ，相對濕度為50 70%的常規培養環境中培養30d。
實施例2和3培養基中，兒茶素依次為2g、4g，其它均同實施I。實施例4附加成分為6_芐基氨基嘌呤4mg、6_呋喃甲基腺嘌呤2. 0mg、2，4_ 二氯苯氧乙酸O. 05mg、a-萘乙酸 O. 04mg、瓊脂 8g、鹿糖 25g。其它同實施例1。實施例5附加成分為6_節基氨基嘌呤6mg、6_呋喃甲基腺嘌呤O. 5mg、2,4_ 二氯苯氧乙酸 O. 2mg、a-萘乙酸 O. 06mg、瓊脂 7g、鹿糖 20g。其它同實施例1。對比實施例1 3依次選擇基本培養基為DKW基本培養基、MS基本培養基和B5基本培養基(均按現有技術配制)，其它均同實施I。對比實施例4 6抗褐化劑依次選擇O. lg、0. 3g和O. 5g硫代硫酸鈉，其它均同實施I。對比實施例7和8抗褐化劑依次選擇O. Olg和O.1g硝酸銀，其它均同實施I。對比實施例9 11抗褐化劑依次選擇O. 02g、0. 05g和O. 08g維生素C，其它均同實施I。對比實施例12 14抗褐化劑依次選擇O. lg、0. 3g和O. 5g聚乙烯吡咯烷酮，其它均同實施I。對比實施例15 17抗褐化劑依次選擇lg、2g和3g活性炭，其它均同實施I。對比實施例18未添加抗褐化劑，其它均同實施I。對比實施例19設計低溫為5°C，黑暗條件下培養ld，再進行常規環境培養30d，其它同實施I。對比實施例20設計低溫為5°C，黑暗條件下培養2d，再進行常規環境培養30d，其它同實施I。對比實施例21設計低溫為5°C，黑暗條件下培養3d，再進行常規環境培養30d，其它同實施I。對比實施例22設計低溫為10°C，黑暗條件下培養ld，再進行常規環境培養30d，其它同實施I。對比實施例23設計低溫為10°C，黑暗條件下培養3d，再進行常規環境培養30d，其它同實施I。對比實施例24設計低溫為15°C，黑暗條件下培養ld，再進行常規環境培養30d，其它同實施I。對比實施例25設計低溫為15°C，黑暗條件下培養2d，再進行常規環境培養30d，其它同實施I。
對比實施例26設計低溫為15°C，黑暗條件下培養3d，再進行常規環境培養30d，其它同實施I。對比實施例27未進行低溫黑暗條件培養，直接進入常規環境培養30d，其它同實施I。對比分析結果如下1、基本培養基對山核桃外植體抗褐化的影響分析實施例1、對比實施例1 3處理后的抗褐化率和誘導率，結果如表I所示。 表I不同基本培養基對山核桃外植體抗褐化的影響
實施例基本培養基誘導率(％)抗褐化率(％)
實施例1WPM基本培養基 35. 3658. 32
對比實施例1 DKW基本培養基 26.4847.66
對比實施例2 MS基本培養基 13. 3431.62
對比實施例3 B5基本培養基 6 6824. 78通過表I可知，四種基本培養基對于山核桃外植體抗褐化影響效果由大到小的順序為WPM、DKW、MS、B5 ;誘導效果由大到小的順序為WPM、MS、DKW、B5。其中WPM效果最佳，抗褐化率最高，為58. 32%，誘導率為35. 36% ;其次為DKW基本培養基，其抗褐化率為47. 66%，誘導率為13. 34% ;B5基本培養基效果最差，不僅抗褐化率最低(24. 78% )，其誘導率也最低，僅為6.68%。在日常觀察中發現，接種后最快15d外植體即出現愈傷組織，其中WPM、MS基本培養基的愈傷組織較好，均為黃綠色的松散結構；而接種于^基本培養基上的外植體生出的愈傷組織量少，顏色為黃褐色，質地較硬。褐變反應最早出現在接種后4d，其過程一部分表現為最初外植體基部向培養基釋放褐色物質，隨后整個外植體顏色變黑，另一部分則是外植體不釋放褐色物質，但是整個植株逐漸變黑。結合抗褐化效果及誘導效果綜合來看，WPM基本培養基為最適山核桃組織培養的基本培養基。2、抗褐化劑對山核桃外植體抗褐化的影響分析實施例1、對比實施例4 18處理后的抗褐化率和誘導率，結果如表2所示。表2不同基本培養基對山核桃外植體抗褐化的影響
實施例抗褐化劑濃度(g/L)~抗褐化率(％) 誘導率(％)
對比實施例4硫代硫酸納 ΓΤ 59.6235.65
對比實施例5硫代硫酸納0573.3831. 32
對比實施例6硫代硫酸納 Γδ 73.5222. 3權利要求
1.一種抑制山核桃外植體褐化的方法，其特征在于，于春季選取山核桃帶腋芽莖段作為外植體，對外植體進行消毒處理，再將外植體接種于添加了兒茶素和抗褐化劑的培養基中，接種初期先將組培瓶置于低溫黑暗環境下培養，然后轉入常規培養環境。
2.根據權利要求1所述的一種抑制山核桃外植體褐化的方法，其特征在于，所述培養基包括基本培養基和附加成分，基本培養基為WPM基本培養基、DKff基本培養基、MS基本培養基或B5基本培養基。
3.根據權利要求2所述的一種抑制山核桃外植體褐化的方法，其特征在于，所述基本培養基為WPM基本培養基。
4.根據權利要求2所述的一種抑制山核桃外植體褐化的方法，其特征在于，所述附加成分為6-節基氨基嘌呤4 6 mg/L、6-呋喃甲基腺嘌呤O. 5 2. O mg/L、2, 4-二氯苯氧乙酸O. 05 O. 2 mg/L、a_萘乙酸O. 04 O. 06 mg/L、瓊脂7 8 g/L、鹿糖20 30 g/ L0
5.根據權利要求1所述的一種抑制山核桃外植體褐化的方法，其特征在于，所述兒茶素的濃度為2 4 g/L ο
6.根據權利要求1所述的一種抑制山核桃外植體褐化的方法，其特征在于，所述抗褐化劑的濃度為0.01 3 g/L。
7.根據權利要求1 6任一項所述的一種抑制山核桃外植體褐化的方法，其特征在于，所述抗褐化劑為聚乙烯吡咯烷酮、活性碳、硫代硫酸鈉、硝酸銀和維生素C中的一種或多種。
8.根據權利要求7所述的一種抑制山核桃外植體褐化的方法，其特征在于，所述抗褐化劑為O. 05 O.1 g/L硝酸銀。
9.根據權利要求7所述的一種抑制山核桃外植體褐化的方法，其特征在于，所述抗褐化劑為O. 3 O. 5 g/L硫代硫酸鈉。
10.根據權利要求7所述的一種抑制山核桃外植體褐化的方法，其特征在于，所述抗褐化劑為O. 3 O. 5 g/L聚乙烯吡咯烷酮。
全文摘要
本發明涉及林木種苗繁殖技術，具體是涉及一種抑制山核桃外植體褐化的方法。于春季選取山核桃帶腋芽莖段作為外植體，對外植體進行消毒處理，再將外植體接種于添加了兒茶素和抗褐化劑的培養基中，接種初期先將組培瓶置于低溫黑暗環境下培養，然后轉入常規培養環境。本發明抑制山核桃外植體褐化的方法，能夠顯著降低山核桃外植體的褐變率以及提高其誘導率，操作簡便，抑制褐化效果較好，為山核桃組織培養以及山核桃無性繁殖提供技術依托。
文檔編號A01H4/00GK103004602SQ20121057422
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月26日 優先權日2012年12月26日
發明者孟艷瓊, 孫婧, 詹權勝, 吳志輝, 龔廣斌, 程祥, 黃勃, 王剛, 閆士鳳, 程耀輝 申請人:安徽農業大學, 安徽詹氏食品有限公司, 寧國市林業局