灰葡萄孢菌分泌型蛋白激發子BcGS1及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種能夠提高植物抗性及防御性的灰葡萄孢菌分泌蛋白激發子及其基因序列和該蛋白及其基因的用途。該蛋白激發子BcGS1，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示?？梢杂糜谔岣咧参锟剐院驼T導植物防御反應。所述植物優選為煙草或番茄。該蛋白激發子可以明顯的提高植物的抗性，濃度低，起效快，作用時間長。BcGS1為提高植物的抗病性提供了新的途徑，因而在農業生產上具有廣闊的應用前景。
【專利說明】灰葡萄孢菌分泌型蛋白激發子BcGSI及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別涉及一種能提高植物抗性和誘導植物防御反應的來自于灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)分泌型蛋白激發子的氨基酸序列及編碼該蛋白質的核苷酸序列極其應用。
【背景技術】
[0002]灰霉病是由灰葡萄孢引發的一種真菌病害，可危害果樹、蔬菜、花卉等200多種植物，尤其在大棚種植的蔬菜上引起果實腐爛，損失比較嚴重。灰葡萄孢菌在分類地位上隸屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、葡萄孢屬真菌。目前對植物病害的防治主要采取化學防治和選育抗病品種。但是它們往往存在著無法摒除的弊端。上世紀隨著生物技術的發展，植物誘導抗性受到關注，激發子作為誘導植物抗性的主要因子，愈發受到關注。因此從該病原菌中尋找出具有新活性，新功能的有效物質已成為國內外科學家關注的熱點。
[0003]灰葡萄孢菌產生的激發子是一種重要的效應分子。它通過識別并作用植物細胞表面或亞細胞組分的受體分子來傳遞病原菌的激發子信號，啟動植物的防衛系統，誘導植物的局部組織產生過敏性細胞壞死,并通過局部細胞信號物質的系統傳遞使植物最終產生系統獲得抗性。
[0004]目前國內外已從灰葡萄孢菌中分離出許多能夠引起植物抗病反應的活性成分。如2001年V.Repka,等從灰葡萄孢菌中分離了一種激發子，該激發子是一種粗制的細胞壁制劑，主要成分是蛋白質和糖，它可以引起植物的氧化爆發和病程相關蛋白的積累，提高苯丙燒途徑相關酶的活性(V.Repka.等，Vitis, 2001，40 (4):205-212) ;2011 年 Mohamed ElOirdi等從灰葡萄孢菌中分離了一種胞外多糖，通過SA信號轉導途徑可以有效地誘導番茄對灰霉病的抗性(Mohamed El Oird1.等，The Plant Cell, 2011，23:2405 - 2421)。
[0005] 申請人:也從灰葡萄孢菌中先后分離了兩種蛋白激發子PebCl和PebC2，它們的分子量分別為36kD和14kD。其中PebCl能顯著促進小麥幼苗生長、提高小麥抗旱性、誘導番茄對灰霉病的系統抗性。PebCl基因全長639bp，編碼212個氨基酸，PebCl處理后的番茄體內苯丙氨酸解氨酶(PAL )、過氧化物酶(POD )和多酚氧化酶(PPO )活性顯著增強(ZhangYunhua等，Microbiological Research,2010, (165),142-151)。
[0006]所有已公開發表的文獻表明，灰葡萄孢菌確實可以產生引起植物的防御反應，提高植物抗性的激發子，其性質和種類各不相同，但蛋白質序列和基因序列報道較少，所以尋找新的蛋白激發子，對揭示灰葡萄孢菌與植物互作機理以及激發子提高植物免疫抗性是非
常重要的。

【發明內容】

[0007]本發明所解決的技術問題是提供一種能夠提高植物抗性及防御性的灰葡萄孢菌分泌蛋白激發子及其基因序列和該蛋白及其基因的用途。
[0008]為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案:[0009]—種灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)分泌型蛋白激發子BcGSl,其氨基酸序列如SEQ IDNO: 2 所示。
[0010]本發明的蛋白激發子BcGSl可以用于提高植物抗性和誘導植物防御反應。所述植物為雙子葉植物，優選為煙草、番茄、黃瓜。當用于誘導減少煙草花葉病毒對煙草的危害時，所述BcGSl的誘導濃度為20μ g/mL ;當用于誘導番茄或黃瓜提高對灰葡萄孢菌的抗性時，所述BcGSl的誘導濃度為10 μ g/mL。
[0011]一種BcGSl基因，核苷酸序列為下列所述之一:
[0012](I)編碼如SEQ ID NO:2所示蛋白質的多核苷酸序列；
[0013](2)與上述多核苷酸序列根據堿基互補配對原則互補的多核苷酸序列。
[0014]所述的BcGSl基因，其多核苷酸序列優選如SEQ ID NO:1所示。也可以是編碼如SEQ IDN0:2所示蛋白質的氨基酸的密碼子的其他組合形式。所述BcGSl基因可用于轉化表達，表達載體優選pMD18-T simple,重組載體可用大腸桿菌Rossetta (DE3)表達。得到分子量約83KD的融合表達蛋白(His-BcGSl)，可以誘導煙草、番茄等同類植物產生抗性反應，提高抗性能力。減少煙草花葉病毒對煙草的危害，減輕灰葡萄孢菌對番茄的危害。
[0015]本發明所述的蛋白激發子，可以是來自灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的培養液、培養液的上清液或菌體的蛋白質。也可以是通過基因工程手段表達轉化的重組蛋白。具有相同的效果。
[0016]本發明的優點為 ，該蛋白激發子可以明顯的提高植物的抗性，濃度低，起效快，作用時間長。BcGSl為提高植物的抗病性提供了新的途徑，因而在農業生產上具有廣闊的應用前景。
[0017]微生物保藏信息
[0018]編號CGMCC N0.7057，命名Botrytis cinerea，2013年I月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，電話010-64807355。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為蛋白激發子BcGSl肽段的氨基酸序列。
【具體實施方式】
[0020]為進一步說明本發明，結合以下實施例具體說明:
[0021]實施例1灰葡萄孢菌的培養及發酵液制備
[0022]將灰葡萄孢菌(編號CGMCC N0.7057，命名 Botrytis cinerea，2013 年 I 月 9 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會)，接種于PDA【取去皮馬鈴薯200克，切成塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1000毫升，加葡萄糖20克，瓊脂15克，溶化后分裝，121°C滅菌30分鐘】平板，25°C培養I周，挑取菌落邊緣處接種于200mL盛有察式【磷酸二氫鉀0.6g，硝酸鉀0.1g,七水硫酸鎂0.25g，三水磷酸氫二鉀0.125g，硝酸韓0.3g,硼酸Img, —水硫酸猛1.5mg,七水硫酸鋅4mg, 二水鑰酸鈉0.1mg,碘化鉀20 μ g,五水硫酸銅20 μ g,六水氯化鈷20 μ g, FeNa2EDTA8mg,煙酸lmg,批卩多醇Img,泛酸鈣(calciumpanthotenate)lmg,鹽酸硫胺素Img,天冬酰胺Ig,葡萄糖20g,加去離子水至1L】液體培養基的500mL三角瓶中，25°C、180r/min培養6天，得到灰葡萄孢菌的發酵液。
[0023]實施例2粗蛋白激發子的制備和檢測
[0024]取實施例1中所得的發酵液,在4°C、5000rpm條件下離心Ih(或13000rpm, 30min),收集上清液，用0.45mm的濾膜(Whatman)抽濾兩次,直至沒有菌體。加入硫酸銨粉末，使所述上清液中硫酸銨終濃度為80%來沉淀目標蛋白質，4°C透析48h，最后將獲得的胞外總蛋白質溶解到超純水中，蛋白質終濃度為100 μ g/mL。蛋白質含量用BCA? protein assaykit (Thermo Scientific)經GF-M2000型酶標儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司)在波長590nm處測定。
[0025]生物活性的監測:以生長2個月，具有5-7片真葉的煙草為材料，以清水為對照。粗蛋白溶液濃度稀釋到50μ g/mL，利用ImL不帶針頭的注射器，將50uL溶液從葉子背面分別注射進葉片中去。經過24h觀察是否有壞死斑形成。
[0026]結果:注射粗蛋白激發子的葉片，注射部位4h后出現水潰斑，6h后注射處葉片呈透明狀，12h后可見典型的過敏反應，有壞死斑形成。對照并無任何反應，和正常葉片一樣。
[0027]實施例3蛋白激發子的分離純化及生物活性測定
[0028]使用AKTA explore 10 (GE Healthcare)蛋白質純化儀對所得的總蛋白質進行進一步純化。實施例2中所述粗蛋白經冷凍干燥后，溶于20mM HEPES(PH7.0)緩沖液。樣品通過 HiTrapTMDEAE FF 陰離子交換柱(GE Healthcare)，用 NaCl 進行梯度洗脫(5%，20%，30%，50%，100)，應用的蛋白濃度為50 μ g/mL，結果表明，穿透峰中的蛋白質可以強烈的引起煙草的過敏反應，經12%變性聚丙 烯酰胺凝膠電泳檢測為單一條帶，說明蛋白質純度高。該蛋白質表觀分子量為80kD (pi = 4.72)，將此蛋白激發子命名為BcGSl (Protein Elicitor ofBotrytiscinerea)。用實例 2 同樣方法測試對不同濃度 BcGSl (I μ g/mL, 5 μ g/mL, 10 μ g/mL, 20 μ g/mL, 50 μ g/mL)進行檢測,20 μ g/mL能夠引起典型過敏性反應,最低能引起過敏反應的蛋白濃度為10 μ g/mL。
[0029]結果:分離純化的BcGSl可以使煙草形成過敏反應的壞死斑。
[0030]H2O2 沉積
[0031]葉片處理方法如實例2，BcGSl濃度為20 μ g/mL,時間為24h。取處理的葉片用蒸懼水洗凈后將其置于2mL管中，取適量DAB (3，3’_Diaminbenzidine) (Sigma)染液(lmg.mL-l,pH3.8),用NaOH調pH值至5.8，分別加入預處理的植物組織，室溫避光保存8小時。隨后去除各管中染液，加入95%乙醇，沸水浴數分鐘，去除各管液體，再加入無水乙醇并沸水浴直至葉片綠色完全脫去為止，再次吸出各管液體，將去浸泡在70%甘油中，趕出細胞間氣泡顯微鏡觀察。
[0032]結果:在BcGSl處理的葉片部位有明顯的褐色沉積物質出現，并且處理部位的氣孔上的保衛細胞也出現紅褐色沉淀。
[0033]實施例4蛋白激發子BcGSl肽段序列的獲得
[0034]純化的BcGSl蛋白質經雙向電泳檢測，切取蛋白質單點分別經IOng/ μ I測序級修飾膜蛋白質酶(Sequencing Grade Modified Trypsin,Promega)3CTC、ρΗ7.5 酶解 30min ~lh，ES1-MS/MS為英國Micromass公司的Q-T0F2正交加速電噴霧串聯質譜儀。配備納升噴霧源。所有測定均在正離子方式下進行。質譜儀用Glu-fib的串聯質譜碎片校正，質量準確度小于0.1Da。霧化氣為氮氣，碰撞氣體為氬氣。源溫80°C，錐孔電壓50V。TOF加速電壓9.lkV。MCP檢測器電壓為2150V。毛細管電壓800V。獲得該蛋白質的多個肽段序列，這些序列和NCBI中gil54316440所編碼的氨基酸序列相匹配(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/protein/gi%7C154316440)o如圖1所示，圖1中用下劃線表示的為一致的肽段序列。
[0035]實施例5蛋白質激發子BcGSl編碼基因的克隆
[0036]根據質譜測序結果和密碼子的簡并性設計4對引物，經篩選驗證最終選定引物:
[0037]BcGSl-正向 5’-ATGGCTTCTTCTCTGCTTTCCTC-3(如 SEQ ID NO:3 所示)和 BcGSl-反向 5’ -TTACCAGCTACCACTAACAGTAGCAGT-3 (如 SEQ ID NO:4 所示)，并以灰葡萄孢菌株抽提的mRNA為模板，選用HiFi反轉錄聚合酶進行PT-PCR (94° C3min ；94° C30s，55° C30s，72° C2min，35cycles ;72° ClOmin ;4。C α)，擴增出 2019bp 的 DNA片段，其中包括 2019bp的完整開放閱讀框，將其命名為BcGSl基因，該基因的序列如SEQ ID N0:1所示。
[0038]實施例6BcGSl基因的原核表達和純化
[0039]( I)表達載體的構建
[0040]設計蛋白激發子基因BcGSl的特異性引物，引入帶有酶切保護堿基的酶切位點，正向引物:5’ -GAATTCATGGCTTCTTCTCTGCTTTCCTC-3>，(下劃線為 EcoR I 的酶切序列)，反向引物:5，-GCGGCCGCTTACCAGCTACCACTAACAGTAGCAGT-3，.(下劃線為 NotI 的酶切序列)，擴增全長 BcGSl 基因(94。C3min ;94。C30s，55° C30s，72° C2min，35cycles ;72。ClOmin ；
4。C°0。先將BcGSl基因目的片段克隆到pMD18-T simple載體，經EcoR I和Not I酶切后，將BcGSl片段克隆到pET_28a(+)載體(Novagen)的Eco RI/Not I位點，熱激轉化到大腸桿菌TranslO (Transgene)，挑取陽性克隆,搖菌并提取質粒,酶切并測序驗證。
[0041](2)誘導表達
[0042]將步驟(1)中所獲得表達載體用熱激發轉化到大腸桿菌R0SSetta(DE3)中。質粒提取及轉化表達宿主菌株的方法同(I )，驗證正確后，進行表達。將驗證正確的重組表達菌株過夜活化，同時取pET28a空質粒的菌株作為對照。分別取ImL過夜培養液加入到含有100 μ g/mLKan的IOOmL LB液體培養基中(1%接種量),37°C，200r/min振蕩培養2~3h培養至OD600為0.6~0.8。加入誘導劑IPTG (終濃度為0.lmmol/L),22.5°C,220r/min繼續振蕩培養24h，誘導表達目的蛋白。高速離心，收集菌體加入緩沖液。經超聲破碎菌體后，40C高速離心，收集上清。取20 μ L上清液，加入5 μ L5 X SDS上樣緩沖液(變性)重懸菌體，沸水浴中加熱lOmin，13000r/min離心10min，取上清進行SDS-PAGE檢測，考馬斯亮蘭R250染色，觀察表達情況。
[0043]結果:經過SDS-PAGE檢測，獲得一個分子量約83KD的融合表達蛋白(His-BcGSl )，與預測分子量大小一致。
[0044](3)重組蛋白的純化
[0045]利用AKTA explorer ΙΟ蛋白純化儀進行重組蛋白的純化。選用Hitrapchelating Column柱進行親和層析,先用清洗緩沖液平衡親和柱；取步驟(2)離心后的重組蛋白液5mL進樣，流速為lmL/min，淋洗至基線后，洗脫緩沖液進行洗脫；收集的各洗脫峰，在大量體積的Tris-HCL緩沖液(PH7.4)中4°C透析過夜，隨后進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮蘭染色檢測蛋白的純度。
[0046]生物活性測定:采用實施例2中方法測定重組蛋白激發子對煙草的活性。
[0047]結果:獲得純化的約83KD的融合表達蛋白(His-BcGSl重組蛋白)[0048]實施例7重組蛋白(His-BcGSl)在煙草上引起的防御反應
[0049](I)重組蛋白(His-BcGSl)在煙草上引起的HR反應
[0050]用ImL不帶針頭的注射器，將約50uL，50 μ g/mL融合表達蛋白(His-BcGSl)，從葉子背面注入不同的煙草葉片中。以相同濃度的pET-28a(+)空質粒表達蛋白(緩沖液為20MmTris-HCL, pH7.4)作為對照，24h后觀察葉片上的反應。
[0051]如實例3中的方法，觀察重組蛋白誘導H2O2在處理葉片上的積累。
[0052]結果:重組蛋白(His-BcGSl)能夠引起煙草葉片產生HR反應；His_BcGSl使處理葉片產生H2O2積累，形成紅褐色沉淀，與天然純化的BcGSl引起的癥狀基本一致。
[0053](2)重組蛋白(His-BcGSl)提高抗性相關基因轉錄水平
[0054]采用半定量RT-PCR方法，對煙草抗性相關基因轉錄水平進行分析。取所需的樣品液氮研磨成粉，按50-100mg/mL加入Trizol,室溫5min靜置，12000rpm離心5min,棄沉淀；按200uL氯仿/mL Trizol,震蕩混勻15min放置，4°C, 12000rpm離心15min,吸取上層,加入0.5mL異丙醇/mL Trizol，混勻，_20°C靜置20min ;離心，75%乙醇漂洗，離心去除乙醇，5-10min晾干。加入DEPC處理水，測RNA濃度，調成相同濃度。
[0055]第一鏈cDNA 的合成，米用 TransGen 公司的 TransScript Two-Step RT-PCR Kit。取 500ng 總 RNA,按照試劑盒說明書，用 TransScript RT/RI Enzyme Mix,以 AnchoredOligo (dT)18為引物，42°C孵育30min，85°C加熱5min使酶失活。取IuL反轉錄產物做PCR, β-actin為內標基因，以抗性相關基因特異引物做PCR(PRl_a基因F:5' -TGGATGCCCATAACACAGC-3' R:5/ -AAT CGCCACTTCCCTCAG-3' ;PRl_b 基因 F:5' -GATGTGGGTTGATGAGAAGC-3/ R:5/ -CTCCAATTACCAGGTGGATC-3' ;NPR1 基因 F:5' -ACATCAGCGGAAGCAGTAG-3' R:5'-GTCGGCGAAGTAGTCAAAC-3'，分別如SEQ ID NO:5_10所示)觀察抗性相關基因的表達情況。
[0056]結果:經過半定量RT-PCR結果可見His-BcGSl在處理煙草葉片后24小時，可以誘導抗性相關基因的轉錄表達。
[0057]實例8重組蛋白(His-BcGSl)增強雙子葉植物抗病性
[0058](I)誘導減少TMV對煙草的危害
[0059]通過預實驗可知20 μ g/mL融合表達蛋白對煙草抗TMV有較佳效果。將50 μ L、純化后的His-BcGSl (20 μ g/mL)溶液通過無針頭的注射器，從背面注入煙草葉片中。以Tris-HCL緩沖液作對照，每處理10株，重復3次。TMV的接種方法為:取新鮮TMV病葉加
0.01mol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)研磨成勻漿，病汁液濃度為每克病葉加15mL磷酸緩沖液。確定最佳接種時間。
[0060]分別于重組蛋白處理后1、3、5和7d，在處理葉的上一位葉摩擦接種TMV。于接種后3天，調查枯斑數量，計算枯斑抑制率。
[0061 ] 抑制率(%)=[(壞死斑個數/直徑-處理組壞死斑個數/直徑)/壞死斑個數/直徑]X 100
[0062]結果如下表。[0063]
【權利要求】
1.一種灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)分泌型蛋白激發子BcGSl,其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.權利要求1所述的蛋白激發子BcGSl在提高植物抗性和誘導植物防御反應中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于:所述植物為雙子葉植物，優選為煙草、番爺、和黃瓜。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:當用于誘導減少煙草花葉病毒對煙草的危害時，所述BcGSl的誘導濃度為20μ g/mL ;當用于提高番茄、黃瓜對灰葡萄孢菌的抗性時，所述BcGSl的誘導濃度為IOy g/mL。
5.一種BcGSl基因，其特征在于:其核苷酸序列為下列所述之一: (1)編碼如SEQID N0:2所示蛋白質的多核苷酸序列； (2)與上述多核苷酸序列根據堿基互補配對原則互補的多核苷酸序列。
6.根據權利要求5所述的BcGSl基因，其特征在于:其多核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
7.一種含有權利要求5或6所述基因的載體。
8.根據權利要求7所述的載體,其特征在于:所述載體為在pMD18-Tsimple中插入BcGSl基因的重組載體。
9.一種遺傳工程的宿主細胞，其特征在于:含有權利要求7或8所述的載體。
10.根據權利要求9所述遺傳工程的宿主細胞，其特征在于:所述宿主細胞為含有權利要求7所述重組載體的大腸桿菌Rossetta (DE3)。
【文檔編號】A01P3/00GK103923194SQ201310016741
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2013年1月16日 優先權日:2013年1月16日
【發明者】邱德文, 楊秀芬, 張云華, 曾洪梅, 郭立華, 袁京京 申請人:中國農業科學院植物保護研究所, 北京綠色農華植保科技有限責任公司