專利名稱：熒光dna－寡聚苯撐乙炔水凝膠的合成方法及應(yīng)用的制作方法
熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的合成方法及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于DNA雜化水凝膠的研究技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的合成方法及其在殺菌調(diào)控方面的新用途。
背景技術(shù)：
凝膠態(tài)是一種近似于固態(tài)，其分子之間通過一些非共價作用力形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而把溶劑分子固定在其中形成的。
近年來，脫氧核糖核酸(DNA)水凝膠在藥物釋放、組織工程、成像、醫(yī)療設(shè)備、基因治療、生物傳感方面具有廣泛的應(yīng)用前景，水凝膠具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在水中能夠吸收大量的水分溶脹，并在溶脹后繼續(xù)保持其原有結(jié)構(gòu)而不被溶解。水凝膠類似于生命組織材料，在與血液、體液及人體組織相接觸時，表現(xiàn)出良好的生物相容性。
對于很多能夠與之發(fā)生共軛聚合的電解質(zhì)有很多文獻(xiàn)報道，如有人提出的水溶性共軛寡聚電解質(zhì)，其中有的水溶性共軛寡聚電解質(zhì)具有殺菌效果，并且水溶性好，與細(xì)菌的細(xì)胞膜有很好的親和性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜凝聚、裂解甚至死亡。但是其制備方法復(fù)雜，而且用于殺菌時其殺菌過程都是不可控制的，因此有待設(shè)計可控的釋放殺菌劑的體系。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種合成方法簡單且能將寡聚苯撐乙炔有效包裹的DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的合成方法。
本發(fā)明還提供了上述DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠在調(diào)控殺菌方面的新用途。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是該熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的合成由以下方法制備
將DNA溶于濃度為O. 01mol/L的羥乙基哌嗪乙硫磺酸溶液中至完全溶解，加入乙二醇二縮水甘油醚和寡聚苯撐乙炔溶液，寡聚苯撐乙炔與DNA、乙二醇二縮水甘油醚的質(zhì)量比為1:25 50 :15 30，在超純水中滲析10 30小時，得到DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠。
上述寡聚苯撐乙炔與DNA、乙二醇二縮水甘油醚的質(zhì)量比優(yōu)選為1:30 40 20 28。
上述DNA的分子量是IXlO6 IX 107。
上述羥乙基哌嗪乙硫磺酸溶液的pH為6. 8 8. 2。
上述的熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠在調(diào)控殺菌方面的應(yīng)用，其使用方法如下 在菌類懸浮液中加入DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠和脫氧核糖核酸酶，暗處孵化20分鐘，白光照射30分鐘。在Img DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠中添加10 100U的脫氧核糖核酸酶。
本發(fā)明合成了一種熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠，其采用DNA作水凝膠網(wǎng)狀框架與寡聚苯撐乙炔通過靜電作用合成一種新型的DNA雜化水凝膠，合成方法簡單，條件溫和， 該水凝膠能將寡聚苯撐乙炔有效包裹在DNA的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，阻礙其與細(xì)菌接觸；該水凝膠可 應(yīng)用于調(diào)控殺菌方面，當(dāng)其中加入脫氧核糖核酸酶時，DNA的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，釋放出寡聚苯撐乙炔，游離的寡聚苯撐乙炔可接近細(xì)菌或進(jìn)入細(xì)菌中，在白光照射下產(chǎn)生單線態(tài)氧或活性氧物質(zhì)，進(jìn)而殺死細(xì)菌，利用脫氧核糖核酸酶，實現(xiàn)殺菌的可控性。


圖1為未添加DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的空白培養(yǎng)板細(xì)菌分布照片。圖2為添加了 DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的培養(yǎng)板細(xì)菌分布照片。圖3為添加了 DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠和脫氧核糖核酸酶的培養(yǎng)板細(xì)菌分布照片。圖4為實施例1合成的DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的表面形貌掃描電鏡照片。圖5為DNA的熒光顯微鏡相差圖片。圖6為實施例1合成DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的熒光顯微鏡相差圖片圖7為實施例1合成DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的熒光圖片。圖8為實施例1合成DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠水解的瓊脂糖凝膠電泳照片。
具體實施例方式現(xiàn)結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步說明，但是本發(fā)明不僅限于下述的實施方式。 實施例1取原料寡聚苯撐乙炔Ig為例，合成熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的方法是將35g分子量為I X IO6 IXlO7的DNA (Sigma公司)溶于濃度為O. 01mol/L、pH為7的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma公司)溶液中至完全溶解,形成DNA的溶液，向其中加入25g乙二醇二縮水甘油醚(百靈威科技有限公司)，再將Ig寡聚苯撐乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撐乙炔溶液，將寡聚苯撐乙炔溶液與加入上述DNA的溶液中，寡聚苯撐乙炔與DNA、乙二醇二縮水甘油醚的質(zhì)量比為1:35 :25，在超純水中滲析20小時，得到DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠。上述寡聚苯撐乙炔的制備方法，參考ACS物理化學(xué)快報“End-Only”中公開的文獻(xiàn)“功能化寡聚苯乙炔的合成，光物理性質(zhì)及殺菌活性的研究”(FunctionalizedOligo (phenylene ethynylene)s: Synthesis, Photophysical and Biocidal Activity,TheJournal of Physical Chemistry Letters,2010, I (21)，3207-3212.)。實施例2取原料寡聚苯撐乙炔Ig為例，合成熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的方法是將40g分子量為I X IO6 IXlO7的DNA (Sigma公司)溶于濃度為O. 01mol/L、pH為7的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma公司)溶液中至完全溶解,形成DNA的溶液，向其中加入28g乙二醇二縮水甘油醚(百靈威科技有限公司)，再將Ig寡聚苯撐乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撐乙炔溶液，將寡聚苯撐乙炔溶液與加入上述DNA的溶液中，寡聚苯撐乙炔與DNA、乙二醇二縮水甘油醚的質(zhì)量比為1:40 :28，在超純水中滲析20小時，得到DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠。實施例3取原料寡聚苯撐乙炔Ig為例，合成熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的方法是將30g分子量為I X IO6 IXlO7的DNA (Sigma公司)溶于濃度為O. 01mol/L、pH為7的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma公司)溶液中至完全溶解,形成DNA的溶液，向其中加入20g乙二醇二縮水甘油醚(百靈威科技有限公司)，再將Ig寡聚苯撐乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撐乙炔溶液，將寡聚苯撐乙炔溶液與加入上述DNA的溶液中，寡聚苯撐乙炔與DNA、乙二醇二縮水甘油醚的質(zhì)量比為1:30 :20，在超純水中滲析20小時，得到DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠。
實施例4
取原料寡聚苯撐乙炔Ig為例，合成熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的方法是將 25g分子量為I X IO6 IXlO7的DNA (Sigma公司)溶于濃度為O. 01mol/L、pH為7的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma公司)溶液中至完全溶解,形成DNA的溶液，向其中加入15g乙二醇二縮水甘油醚(百靈威科技有限公司)，再將Ig寡聚苯撐乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撐乙炔溶液，將寡聚苯撐乙炔溶液與加入上述DNA的溶液中，寡聚苯撐乙炔與DNA、乙二醇二縮水甘油醚的質(zhì)量比為1:25 :15，在超純水中滲析20小時，得到DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠。
實施例5
取原料寡聚苯撐乙炔Ig為例，合成熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的方法是將 50g分子量為I X IO6 IXlO7的DNA (Sigma公司)溶于濃度為O. 01mol/L、pH為7的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma公司)溶液中至完全溶解,形成DNA的溶液，向其中加入30g乙二醇二縮水甘油醚(百靈威科技有限公司)，再將Ig寡聚苯撐乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撐乙炔溶液，將寡聚苯撐乙炔溶液與加入上述DNA的溶液中，寡聚苯撐乙炔與DNA、乙二醇二縮水甘油醚的質(zhì)量比為1:50 :30，在超純水中滲析20小時，得到DNA-寡聚苯撐乙炔水·凝膠。
實施例6
在上述實施例1 5的熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的合成方法中將分子量為I X IO6 I X IO7的DNA (Sigma公司)溶于濃度為O. 01mol/L、pH為6. 8的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma公司)溶液中至完全溶解，形成DNA的溶液，然后加入乙二醇二縮水甘油醚 (百靈威科技有限公司)，再將寡聚苯撐乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撐乙炔溶液， 將寡聚苯撐乙炔溶液加入上述DNA溶液中，在超純水中滲析10小時，其它的步驟與相應(yīng)實施例相同，得到DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠。
實施例7
在上述實施例1 5的熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的合成方法中將分子量為I X IO6 I X IO7的DNA (Sigma公司)溶于濃度為O. 01mol/L、pH為8. 2的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma公司)溶液中至完全溶解，形成DNA的溶液，然后加入乙二醇二縮水甘油醚 (百靈威科技有限公司)，再將寡聚苯撐乙炔溶于水中至完全溶解，形成寡聚苯撐乙炔溶液， 將寡聚苯撐乙炔溶液加入上述DNA溶液中，在超純水中滲析30小時，其它的步驟與相應(yīng)實施例相同，得到DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠。
上述實施例1 7的方法所合成的熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠(下述簡稱 DNA - 0ΡΕ)應(yīng)用于調(diào)控殺菌體系中，現(xiàn)以大腸桿菌為例，其具體的使用方法如下
步驟1:挑取大腸桿菌的單克隆菌落置于5mL含50μ g/mL卡那霉素(Kana)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床振蕩培養(yǎng)過夜(約12h)，得到活化的菌液，取活化菌液離心，0. 9%NaCl溶液洗細(xì)菌三次，0. 9%NaCl溶液懸浮細(xì)菌，稀釋至0D600nm=l. 0。步驟2 :取三組100 μ L細(xì)菌懸浮液，第一組中加入400 μ L0. 9%NaCl溶液，室溫暗處孵育20min，然后用白光照射樣品30分鐘(90mW/cm2)，作為空白實驗；第二組中加入400 μ L0. 9%NaCl溶液和濃度為2. 5mg/mL的實施例1的DNA - OPE水凝膠溶液40 μ L，室溫暗處孵育20min，然后用白光照射樣品30分鐘(90mW/cm2)，作為對比實驗；第三組中加入400 μ L0. 9%NaCl溶液和濃度為2. 5mg/mL實施例1的DNA -OPE水凝膠溶液40 μ L與IOU的脫氧核糖核酸酶(DNase),室溫暗處孵育20min,然后用白光照射樣品30分鐘(90mW/cm2)；步驟3 :將上述三組的菌液連續(xù)稀釋6X 104倍，分別取100μL的大腸桿菌(E. coli)菌液涂布于固體LB培養(yǎng)板上，37°C孵育12 14h，瓊脂糖固體培養(yǎng)基的直徑為
90mm，計數(shù)培養(yǎng)板上形成的細(xì)菌克隆數(shù)，計算公式為
權(quán)利要求
1.一種熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的合成方法，其特征在于由以下方法制備 將DNA溶于濃度為O. Olmol/L的羥乙基哌嗪乙硫磺酸溶液中至完全溶解，加入乙二醇二縮水甘油醚和寡聚苯撐乙炔溶液，寡聚苯撐乙炔與DNA、乙二醇二縮水甘油醚的質(zhì)量比為I 25 50 :15 30，在超純水中滲析10 30小時，得到DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的合成方法，其特征在于將DNA溶于濃度為O. 01mol/L的羥乙基哌嗪乙硫磺酸溶液中至完全溶解，加入乙二醇二縮水甘油醚和寡聚苯撐乙炔溶液，寡聚苯撐乙炔與DNA、乙二醇二縮水甘油醚的質(zhì)量比為1:30 40:20 28。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的合成方法，其特征在于所述DNA的分子量是I X IO6 I X IO7。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠的合成方法，其特征在于所述羥乙基哌嗪乙硫磺酸溶液的pH為6. 8 8. 2。
5.權(quán)利要求1 4任一項所述的熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠在調(diào)控殺菌方面的應(yīng)用，其使用方法如下在菌類懸浮液中加入DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠和脫氧核糖核酸酶，暗處孵化20分鐘，白光照射30分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于在ImgDNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠中添加10 100U的脫氧核糖核酸酶。
全文摘要
本發(fā)明合成了一種熒光DNA-寡聚苯撐乙炔水凝膠，其采用DNA作水凝膠網(wǎng)狀框架與寡聚苯撐乙炔通過靜電作用合成一種新型的DNA雜化水凝膠，合成方法簡單，條件溫和，該水凝膠能將寡聚苯撐乙炔有效包裹在DNA的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，阻礙其與細(xì)菌接觸；該水凝膠可應(yīng)用于調(diào)控殺菌方面，當(dāng)其中加入脫氧核糖核酸酶時，DNA的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，釋放出寡聚苯撐乙炔，游離的寡聚苯撐乙炔可接近細(xì)菌或進(jìn)入細(xì)菌中，在白光照射下產(chǎn)生單線態(tài)氧或活性氧物質(zhì)，進(jìn)而殺死細(xì)菌，利用脫氧核糖核酸酶，實現(xiàn)可控性的殺菌。
文檔編號A01N25/26GK103053517SQ20131002029
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者唐艷麗, 曹阿麗, 劉越 申請人:陜西師范大學(xué)