一種雜交蘭花多倍體的誘導(dǎo)方法
【專利摘要】本發(fā)明具體涉及雜交蘭花多倍體誘導(dǎo)方法，屬于多倍體育種【技術(shù)領(lǐng)域】，以大花蕙蘭‘愛神’（ Cymbidium LuckyGloria'Aguri'）與虎雪蘭[ Cymbidiumhybridium ×( Cymbidiumtracyanum varhuanghua× Cymbidiummastersii ）]的雜交種萌發(fā)形成的無菌圓球莖作試材，利用秋水仙素對(duì)F1代圓球莖進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)，再將誘導(dǎo)后的圓球莖分化成芽和叢芽增殖培養(yǎng)，把鑒定為多倍體的植株經(jīng)生根培養(yǎng)后，獲得多倍體植株組培苗。本發(fā)明采用圓球莖結(jié)合秋水仙素浸泡法獲得的雜交蘭花多倍體植株，具有倍性特征顯著，采用圓球莖作為誘導(dǎo)材料縮短了多倍體雜交蘭植株培育的周期，且方法簡(jiǎn)單易于掌握。
【專利說明】一種雜交蘭花多倍體的誘導(dǎo)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體涉及雜交蘭花多倍體誘導(dǎo)方法，屬于多倍體育種【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]蘭花是一種姿態(tài)優(yōu)美，芳香馥郁的珍貴花卉，屬中國(guó)傳統(tǒng)十大名花之一。大花蕙蘭作為重要的商品盆花和切花之一，目前倍受人們青睞，大花蕙蘭常見品種‘愛神’{Cymbidium Lucky Gloria ’ Aguri’)為多年生草本植物,每株有花葶1_5支,花葶斜生,稍彎曲，從葉叢基本向外抽出，長(zhǎng)35-80cm ;著花5-10朵，花大，艷麗紅色，花期11月至翌年3 月，花期較長(zhǎng)；<虎雪蘭，[Cymbidium hybridiumY, {Cymbidium tracyanumvarhuanghua'XCymbidium Hiastersii1i是沉香虎頭蘭黃色素花與大雪蘭雜交培育出的,遺傳性狀穩(wěn)定，花期10-12月，長(zhǎng)達(dá)40-60 d。目前由于品種和栽培技術(shù)較落后，國(guó)產(chǎn)(包括臺(tái)灣進(jìn)口)蘭的質(zhì)量與日本、韓國(guó)有明顯差距，這種狀況已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足我國(guó)人民群眾對(duì)蘭花各性狀要求。特別是切花蘭市場(chǎng)，大部分切花蘭主要依靠進(jìn)口，與我國(guó)豐富的蘭花資源背道而弛，這就迫切需要充分利用我國(guó)優(yōu)異蘭花資源，培育出具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新品種，促進(jìn)蘭花產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，并為我國(guó)蘭花走向世界奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
[0003]多倍體植株莖桿粗壯，生長(zhǎng)堅(jiān)實(shí)，耐倒伏，葉片增厚增寬，綠色加深，光合作用增強(qiáng)，增加新的紋飾特征、花朵比較大且緊湊，花期長(zhǎng)而遲。這些特征大大提高了花卉的產(chǎn)量與質(zhì)量，增加了花卉的觀賞價(jià)值和商品價(jià)值，所以多倍體育種在花卉上有廣泛的應(yīng)用。在自然條件下，由于外界環(huán)境的變化和遺傳結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，植物本身會(huì)發(fā)生自發(fā)突變，然而這類突變發(fā)生的頻率極低，并因植物種類和基因的不同而存在差異。自然界中植株變異率極低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能夠滿足蘭花育種工作的需要，化學(xué)誘變育種是目前一種迅速發(fā)展的作物育種技術(shù)，具有使用方便，特異性較強(qiáng)和誘變后代較易穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。
[0004]化學(xué)誘變育種是利用化學(xué)誘變劑誘變產(chǎn)生多倍體的方法。此方式是目前應(yīng)用最廣泛，操作簡(jiǎn)單易行，突變頻率高，專一性強(qiáng)，適用范圍廣的方法。秋水仙素是目前主要采用的誘變劑。誘導(dǎo)材料通常選取種子、頂芽、側(cè)芽以及組織培養(yǎng)中的愈傷組織、圓球莖、不定芽等分裂旺盛的器官或組織，用秋水仙素處理誘導(dǎo)效果與作用時(shí)間和使用的濃度及溫度、處理的植物種類和器官等因素有關(guān)，一般常用的處理濃度在0.01%-0.2%，處理溫度一般在17-20。。。
[0005]化學(xué)誘變多倍體較常用的誘導(dǎo)方法有滴液法、浸泡法、混培法、注射法等。在實(shí)際工作中運(yùn)用最簡(jiǎn)便有效的方式之一是:浸泡法，先將培養(yǎng)材料在化學(xué)試劑中浸泡處理之后，在轉(zhuǎn)入預(yù)先制作好的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法。二就是混培法，將培養(yǎng)材料與含化學(xué)試劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時(shí)間之后，誘導(dǎo)加倍后再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)的方式。但對(duì)于秋水仙素的濃度，針對(duì)不同材料有不同的實(shí)用范圍。因秋水仙堿類的化學(xué)藥品相對(duì)來說會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，時(shí)間過長(zhǎng)、濃度過高會(huì)抑制材料生長(zhǎng)，甚至引起毒害，處理濃度太低、時(shí)間過短起不到作用。誘導(dǎo)方法也因培養(yǎng)材料而異。鄭君強(qiáng)等用秋水仙堿誘導(dǎo)四季桔的研究結(jié)果表明浸泡法效果較好；而段英姿等用秋水仙堿誘導(dǎo)菘藍(lán)多倍體時(shí)發(fā)現(xiàn)秋水仙堿加入培養(yǎng)基中更有助于多倍體的形成。
[0006]多倍體誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致植物嵌合體、二倍體和多倍體植株共同存在的現(xiàn)象。而嵌合體現(xiàn)象的存在可能會(huì)導(dǎo)致多倍體誘導(dǎo)育種失去原有的意義，然而突變細(xì)胞和非突變細(xì)胞的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)力則是能否形成嵌合體的重要原因。組織培養(yǎng)與秋水仙素誘導(dǎo)相結(jié)合培育植物多倍體的技術(shù)是在傳統(tǒng)的化學(xué)誘導(dǎo)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，并伴隨植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展而日趨成熟。其優(yōu)點(diǎn)一是減少嵌合體的發(fā)生。培育植株多倍體的傳統(tǒng)誘導(dǎo)法是以植物生長(zhǎng)點(diǎn)、側(cè)芽或種子等為誘導(dǎo)對(duì)象，由多細(xì)胞構(gòu)成的芽發(fā)育成植株，因細(xì)胞分裂不同步，容易形成嵌合體，難于獲得同質(zhì)的多倍體，誘導(dǎo)率也較低。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過對(duì)材料進(jìn)行組織培養(yǎng)后再作誘導(dǎo)處理，能誘導(dǎo)加倍的多倍體單細(xì)胞分化出不定芽，并發(fā)育成單株，形成同質(zhì)多倍體，提高誘導(dǎo)率，有效排除嵌合體的干擾，并且縮短多倍體培育時(shí)間。二是試驗(yàn)條件易控制。此種技術(shù)是在室內(nèi)進(jìn)行，室內(nèi)試驗(yàn)條件易控制，且易于重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，提高工作效率。
[0007]一般認(rèn)為影響蘭花多倍體誘導(dǎo)成功率的因素包括植物本身的生理特性、誘導(dǎo)材料的選擇、誘導(dǎo)方法的選擇、實(shí)際操作過程中引起的誤差等。研究表明植株上任一生物學(xué)部分均可作為處理材料，只要秋水仙素濃度和處理時(shí)間適宜，結(jié)合相應(yīng)的培養(yǎng)基均可獲得變異的多倍體。目前以叢芽為誘導(dǎo)材料，已在齒瓣石斛、石斛、野生黃蟬蘭和碧玉蘭等獲得了多倍體植株。以蘭花圓球莖和根狀莖為材料進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)在國(guó)外內(nèi)已有些研究報(bào)道。Hsien等用秋水仙素處理五唇蘭/w/7cA6?r_ri?a)的圓球莖(直徑為1^1.2mm),獲得了再生植株中46%四倍體。Kim等用秋水仙素處理寒蘭根狀莖，獲得了誘導(dǎo)率分別為4.5%、5.2%、6.7% (2n=66^80)的多倍體材料。國(guó)內(nèi)在春蘭、鐵皮石斛和二倍體大花蕙蘭品種“紅寶石”等少數(shù)幾個(gè)品種上開展研究，培育出了四倍體植株。但由于圓球莖和根狀莖是蘭屬植物種子萌發(fā)的中間繁殖體，經(jīng)過分化培養(yǎng)才能形成芽體，采用圓球莖或根狀莖作為誘導(dǎo)材料，可以使多倍體誘導(dǎo)和芽的分化同時(shí)發(fā)生，大大縮短了獲得多倍體植株的育種時(shí)間。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的在于提供一種雜交蘭花多倍體的植株的制備方法，利用該方法獲得具有四倍體特征的雜交蘭植株。
[0009]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種蘭花雜交多倍體的植株的培育方法，所述方法包括:
(O將蘭花雜交種萌發(fā)形成的無菌圓球莖浸泡在0.1%_6%濃度的秋水仙素溶液中，分別處理24h-72h后用無菌水沖洗4-5次，濾干水分，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件:pH為
5.8-6.0、溫度(25±2) °C、光照 12 h/d，光照強(qiáng)度 1800_25001x ；
(2)根據(jù)多倍體植株與二倍體植株呈現(xiàn)出的較明顯的特征為莖粗壯，枝少、葉少、葉片寬而厚、葉色深等特點(diǎn)，對(duì)變異植株進(jìn)行初步篩選，將初步篩選出來的變異植株轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基上進(jìn)行芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上；
(3)選取二倍體植株和經(jīng)三次繼代后穩(wěn)定擴(kuò)繁的變異植株，通過形態(tài)學(xué)、氣孔和染色體鑒定為多倍體的植株轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基中，鑒定方法、培養(yǎng)條件同上。
[0010]步驟(I)所述蘭花雜交種萌發(fā)形成的無菌圓球莖制備的消毒方法為:取大花蕙蘭‘愛神’與虎雪蘭發(fā)育成熟但尚未裂開的自交蒴果，用75%的酒精擦干凈，在超凈超凈工作臺(tái)上用75%的酒精消毒3?6min，無菌水清洗2次，然后放入0.2%的升汞中消毒10?15min,無菌水沖洗4次，剖開果皮，取出種子。
[0011]步驟(I)所述雜交種萌發(fā)形成的無菌圓球莖制備的培養(yǎng)方法:剖開消毒后自交蒴果果皮，取出種子，然后將種子撒播到種子無菌萌發(fā)的培養(yǎng)基中。種子無菌萌發(fā)的培養(yǎng)基包含 1/2MS基本培養(yǎng)基、0.5-2.5 mg/L6-BA、0.1-1.0 mg/LNAA、30mg/L蔗糖和 6.0-7.0g.Γ1 瓊月旨。培養(yǎng)條件:溫度25?30°C，采用暗培養(yǎng)。種子萌發(fā)形成的中間繁殖體即為雜交蘭無菌圓球莖。
[0012]步驟(I)所述的經(jīng)秋水仙素浸泡過的無菌圓球莖轉(zhuǎn)入最佳配方的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的最佳配方篩選方法如下:將獲得的雜交蘭無菌圓球莖接種到含有不同濃度細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，從6-BA、NAA、KT、添加物四個(gè)因素研究對(duì)雜交蘭無菌圓球莖增殖的影響。6-BA 濃度為 0.5-2.0mg/L、NAA 濃度為 0.1-1.5mg/L、KT 濃度為 0.1-1.5mg/L，添加物種類分別為香蕉+花寶4號(hào)、香蕉和花寶4號(hào)。每個(gè)處理5瓶(每瓶10個(gè)圓球莖)，60d后觀察苗體生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA+0.lmg/LKT+0.3%花寶4號(hào)+活性炭0.5g/L誘導(dǎo)增殖效果最佳，平均增殖率達(dá)342%。并且在增殖過程中，圓球莖已經(jīng)開始分化為芽。1/2MS指溶液中所含的大量和微量元素為MS的一半，其他不變。
[0013]步驟(2)所述的多倍體的鑒定方法如下:取植株幼嫩根尖Icm根尖放入玻璃瓶中，加入0.004M 8-輕基喹啉于18°C下預(yù)處理9h ;將預(yù)處理材料洗漆后轉(zhuǎn)入Carony’ s液(乙醇:乙酸=3:1)中，置冰箱內(nèi)固定3h。取出固定好的材料，洗滌3-4次后放入Imol/L的HCl酸解20-30min。用蒸餾水清洗3_5次解離過的材料(如果清洗不干凈染色效果較差，會(huì)影響壓片效果)，置于載玻片上，切取根冠末端1_，用改良后的卡寶品紅溶液染色4_6min，用刀片把染色的根尖搗爛，蓋上蓋玻片，用鉛筆的橡皮頭輕敲蓋玻片，使細(xì)胞均勻分散。并用濾紙把蓋玻片周圍多余的染色劑吸干。將做好的切片放于電子顯微鏡下觀察染色體分散情況，然后選擇染色體形態(tài)、分散較好的片子，進(jìn)行拍照。鏡檢觀察2n=4x=80，而二倍體雜交蘭2n=2x=40，故可確定獲得的植株為四倍體植株。
[0014]按照本發(fā)明方法得到的雜交蘭四倍體幼苗，與二倍體雜交蘭相比，株高、葉寬、葉厚和莖粗明顯比二倍體雜交蘭粗大；20倍鏡下，單個(gè)氣孔二倍體長(zhǎng)徑均值為27.5 μ m、短徑為21.4 μ m、長(zhǎng)徑X短徑為588.2 μ m2，四倍體長(zhǎng)徑均值為32.4 μ m、短徑為25.2 μ m、長(zhǎng)徑X短徑為817.6 μ m2。
[0015]作為優(yōu)選，步驟(I)所述的秋水仙素濃度最佳為3%，處理時(shí)間為72小時(shí)。對(duì)于特定品種的大花蕙蘭與虎雪蘭雜交品種，在該條件下誘變率高達(dá)40%。
[0016]本發(fā)明獲得的雜交蘭多倍體組培苗經(jīng)3-4次繼代轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，植株性狀穩(wěn)定性好，與誘導(dǎo)當(dāng)代相似。
[0017]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明利用雜交蘭種子萌發(fā)的無菌圓球莖作為材料獲得的雜交蘭多倍體植株，具有顯著的多倍體特征；采用圓球莖作為誘導(dǎo)材料縮短了多倍體雜交蘭植株培育的周期，可獲得穩(wěn)定高效發(fā)生的多倍體，且制備方法簡(jiǎn)單，為今后蘭花復(fù)合育種進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)，本發(fā)明獲得的雜交蘭多倍體具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
[0018]通過本試驗(yàn)結(jié)果看出，利用浸泡法對(duì)大花蕙蘭和虎雪蘭雜交種進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)效果比混培法效果好，浸泡法誘導(dǎo)率高于混培法。試驗(yàn)所得大部分變異植株均由浸泡法所得，原因可能是因?yàn)榻莘▽?duì)組織的作用較為直接。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為染色體計(jì)數(shù)結(jié)果，a為二倍體雜交蘭，b為四倍體雜交蘭(即本發(fā)明制備的多倍體植株)，XlOO倍鏡下體細(xì)胞中期染色體；
圖2為生根苗植株，左邊為二倍體雜交蘭植株，右邊為本發(fā)明所制備的四倍體雜交蘭植株；
圖3為得到的雜交蘭多倍體幼苗的氣孔大小結(jié)果，a為二倍體雜交蘭植株，b為本發(fā)明所制備的四倍體雜交蘭植株；X20倍鏡下單個(gè)視野中的氣孔大小。

【具體實(shí)施方式】
[0020]以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0021]實(shí)施例1:
1)取大花蕙蘭‘愛神’iCymbidium Lucky Gloria ’ Aguri’)與虎雪蘭hybridiumY, {Cymbidium tracyanumvarhuanghua X Cymbi di um mas ter si i ) ] ^ W但尚未裂開的自交蒴果，用75%的酒精擦干凈，在超凈超凈工作臺(tái)上用75%的酒精消毒3?6min,無菌水清洗2次,然后放入0.2%的升萊中消毒10?15min,無菌水沖洗4次,剖開果皮，取出種子；
2)將種子撒播到1/2MS 基本培養(yǎng)基、0.5-2.5 mg/L6_BA、0.1-1.0 mg/LNAA、30mg/L 蔗糖和6.0-7.0g.Γ1瓊脂的培養(yǎng)基中，放入溫度25?30°C培養(yǎng)室中進(jìn)行暗培養(yǎng)；
3)將雜交種萌發(fā)形成的無菌圓球莖浸泡在3%濃度的秋水仙素溶液中，處理72h，用無菌水沖洗 4-5 次，濾干水分，轉(zhuǎn)入 1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.lmg/LKT+0.3% 花寶 4號(hào)+活性炭0.5g/L培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件:pH為5.8-6.0、溫度(25±2) °C、光照12 h/d,光照強(qiáng)度1800-25001x。
[0022]4)根據(jù)多倍體植株與二倍體植株呈現(xiàn)出的葉形、葉色、株型、株色、生長(zhǎng)勢(shì)上的差別，對(duì)變異植株進(jìn)行初步篩選。將初步篩選出來的變異植株轉(zhuǎn)入1/2MS +1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA +0.lmg/L ΚΤ+0.3%花寶4號(hào)+活性炭0.5g/L培養(yǎng)基上進(jìn)行芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。
[0023]5)選取二倍體植株和經(jīng)三次繼代后穩(wěn)定擴(kuò)繁的變異植株，通過形態(tài)學(xué)、氣孔和染色體鑒定多倍體植株，多倍體鑒定的具體步驟為:
早上8:30-9:00時(shí)，取組培苗植株新長(zhǎng)出3-5天的幼嫩根尖，將取出的大小為Icm根尖放入玻璃瓶中，加入0.004M 8-羥基喹啉于18°C下預(yù)處理9h。將預(yù)處理材料洗滌后轉(zhuǎn)入Carony’s液(乙醇:乙酸=3:1)中，置冰箱內(nèi)固定3h。取出固定好的材料，洗滌3_4次后放入lmol/L的HCl酸解20_30min。用蒸餾水清洗3_5次解離過的材料，置于載玻片上，切取根冠末端1mm，用改良后的卡寶品紅溶液染色4-6min，用刀片把染色的根尖搗爛，蓋上蓋玻片，用鉛筆的橡皮頭輕敲蓋玻片，使細(xì)胞均勻分散。并用濾紙把蓋玻片周圍多余的染色劑吸干。將做好的切片放于電子顯微鏡下觀察染色體分散情況，然后選擇染色體形態(tài)、分散較好的片子，進(jìn)行拍照。鏡檢觀察2n=4x=80，二倍體雜交蘭2n=2x=40，故可確定獲得的植株為四倍體植株。
[0024]將四倍體植株轉(zhuǎn)接到1/2MS+1.0mg/L6-BA+l.5mg/LNAA+l.0mg/LIBA+ 活性炭0.5g/L生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上。
[0025]實(shí)施例2:
具體步驟如實(shí)施例1所述，不同的是步驟3中的秋水仙素處理時(shí)采用將秋水仙素溶液直接加的培養(yǎng)基中，濃度為3%，處理時(shí)間為14d，變異率為26.7%。
[0026]以上實(shí)施例僅為本發(fā)明的部分實(shí)施方式，本發(fā)明不限于上述的實(shí)施例，步驟3中秋水仙素的濃度及處理時(shí)間可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，本領(lǐng)域技術(shù)人員能從該
【發(fā)明內(nèi)容】
中直接導(dǎo)出的所有變形，均因落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種蘭花雜交多倍體的植株的培育方法，所述方法包括: (O將蘭花雜交種萌發(fā)形成的無菌圓球莖浸泡在0.1%_6%濃度的秋水仙素溶液中，分別處理24h-72h后用無菌水沖洗4-5次，濾干水分，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中；培養(yǎng)條件:pH為5.8-6.0、溫度(25±2) °C、光照 12 h/d，光照強(qiáng)度 1800_25001x ； (2)根據(jù)多倍體植株與二倍體植株呈現(xiàn)出的較明顯的特征為莖粗壯，枝少、葉少、葉片寬而厚、葉色深等特點(diǎn)，對(duì)變異植株進(jìn)行初步篩選，將初步篩選出來的變異植株轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基上進(jìn)行芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上； (3)選取二倍體植株和經(jīng)三次繼代后穩(wěn)定擴(kuò)繁的變異植株，通過形態(tài)學(xué)、氣孔和染色體鑒定為多倍體的植株轉(zhuǎn)接于培養(yǎng)基中，鑒定方法、培養(yǎng)條件同上。
2.如權(quán)利要求1所述的一種蘭花雜交多倍體的植株的培育方法，其特征在于步驟(I)所述蘭花雜交種萌發(fā)形成的無菌圓球莖制備的消毒方法為:取大花蕙蘭‘愛神’與虎雪蘭發(fā)育成熟但尚未裂開的自交蒴果，用75%的酒精擦干凈，在超凈超凈工作臺(tái)上用75%的酒精消毒3?6min,無菌水清洗2次,然后放入0.2%的升萊中消毒10?15min,無菌水沖洗4次，剖開果皮，取出種子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種蘭花雜交多倍體的植株的培育方法，其特征在于步驟(I)所述雜交種萌發(fā)形成的無菌圓球莖制備的培養(yǎng)方法:剖開消毒后自交蒴果果皮，取出種子，然后將種子撒播到種子無菌萌發(fā)的培養(yǎng)基中；種子無菌萌發(fā)的培養(yǎng)基包含1/2MS基本培養(yǎng)基、0.5-2.5 mg/L6-BA、0.1-1.0 mg/LNAA、30mg/L 蔗糖和 6.0-7.0g.Γ1 瓊脂；培養(yǎng)條件:溫度25?30°C，采用暗培養(yǎng)；種子萌發(fā)形成的中間繁殖體即為雜交蘭無菌圓球莖。
4.如權(quán)利要求1或3所述的一種蘭花雜交多倍體的植株的培育方法，其特征在于步驟(I)所述的經(jīng)秋水仙素浸泡過的無菌圓球莖轉(zhuǎn)入最佳配方的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的最佳配方篩選方法如下:將獲得的雜交蘭無菌圓球莖接種到含有不同濃度細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，從6-BA、NAA、KT、添加物四個(gè)因素研究對(duì)雜交蘭無菌圓球莖增殖的影響；6_BA濃度為0.5-2.0mg/L、NAA濃度為0.1-1.5mg/L、KT濃度為0.1-1.5mg/L，添加物種類分別為香蕉+花寶4號(hào)、香蕉和花寶4號(hào)；每個(gè)處理5瓶，每瓶10個(gè)圓球莖，60d后觀察苗體生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)增殖情況。
5.如權(quán)利要求1所述的一種蘭花雜交多倍體的植株的培育方法，其特征在于步驟(I)所述的秋水仙素濃度最佳為3%，處理時(shí)間為72小時(shí)。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104273029SQ201410450488
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】王玉英, 李枝林, 李光宏, 孟英, 李志敏, 王亞沉 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)