一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法
【專利摘要】一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法，本發(fā)明要解決現(xiàn)有毛果楊組培苗作為外植體誘導(dǎo)不定芽成功率低、愈傷組織誘導(dǎo)不定芽周期長的問題，該方法是在組織培養(yǎng)幼苗的培養(yǎng)基中添加0～5μM組蛋白去乙酰化酶抑制劑溶液，誘導(dǎo)毛果楊根尖再生出不定芽的方法。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）方法簡便有效，不需要復(fù)雜的組培體系和培養(yǎng)條件，只需要在普通的楊樹組培培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的組蛋白去乙?；敢种苿┤芤?，就能有效誘導(dǎo)不定芽的再生；（2）周期較短，一般經(jīng)30天左右即可誘導(dǎo)出不定芽。
【專利說明】一種組蛋白去乙?；敢种苿┱T導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用組蛋白去乙?；敢种苿┱T導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]表觀遺傳調(diào)控主要包括DNA甲基化和組蛋白修飾，組蛋白修飾又包括組蛋白乙?；?、磷酸化和糖基化等。組蛋白乙?；接山M蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(histoneacetyl transferase, HAT)所介導(dǎo)的組蛋白乙?；徒M蛋白去乙?；?histonedeacetylases, HDACs)所介導(dǎo)的組蛋白去乙酰化共同調(diào)節(jié),缺一不可,二者共同作用保證細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；教幱趧?dòng)態(tài)平衡。組蛋白乙酰化影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，基因的轉(zhuǎn)錄，以及多種生命活動(dòng)。HDAC催化組蛋白上的賴氨酸(lysine)所結(jié)合的乙酰基團(tuán)的去除，乙酰基團(tuán)去除后染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得緊密，不利于轉(zhuǎn)錄因子以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與DNA的結(jié)合。因此，HDAC一般與基因抑制或基因沉默有關(guān)。根據(jù)與酵母HDAC (RPD3、HDA1和SIR2)序列的同源性比較，植物HDAC可分為3個(gè)亞家族:RPD3/HDA1、HD2和SIR2。其中，RPD3/HDA1和HD2類型的組蛋白去乙?；富钚阅軌虮籋DAC特異性的抑制劑如trichostatinA (TSA)或butynate(NaB)所抑制，而SIR2類型的組蛋白去乙?；竸t不能被這些抑制劑所抑制。HDACs調(diào)節(jié)植物多種生命活動(dòng)包括生長、 發(fā)育和脅迫反應(yīng)等。當(dāng)HDAC的酶活性被其特異的抑制劑如TSA或NaB抑制后，植物會(huì)出現(xiàn)多種表型上的改變。例如，擬南芥HDA18對(duì)根表皮細(xì)胞分化過程中模式形成具有重要的調(diào)節(jié)作用，TSA處理引起根毛細(xì)胞在非根毛形成部位的出現(xiàn)和發(fā)育。HDAC抑制劑TSA和NaB能夠抑制豌豆根表皮細(xì)胞的有絲分裂，NaB能夠抑制水稻根的生長。上述這些研究表明HDAC在植物根發(fā)育的多個(gè)過程中發(fā)揮非常重要的調(diào)控作用。
[0003]毛果楊是一種再生很困難的楊樹。目前，以毛果楊組培幼苗的葉片和莖段作為外植體，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分、激素種類和濃度以及培養(yǎng)條件均很難誘導(dǎo)不定芽，仍沒有一個(gè)成熟的組培體系；而采用溫室成熟苗(4-6個(gè)月齡)的莖段能夠誘導(dǎo)出愈傷組織，再通過愈傷組織誘導(dǎo)出不定芽，但這種方法周期長(3-6個(gè)月)，涉及復(fù)雜的組織培養(yǎng)體系。因此，急需一種新的方法來提高毛果楊不定芽的再生率和縮短得到再生植株的時(shí)間。目前，木本植物組織培養(yǎng)體系的研究主要集中在培養(yǎng)基種類、鹽濃度、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、碳水化合物、光照和溫度等方面，而表觀遺傳調(diào)控對(duì)木本植物再生和發(fā)育的影響很少有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了解決目前毛果楊幼嫩葉片、莖段作為外植體不定芽誘導(dǎo)率低和采用愈傷組織誘導(dǎo)不定芽費(fèi)時(shí)長的問題。而提供一種組蛋白去乙?；敢种苿┱T導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法。
[0005]本發(fā)明的一種組蛋白去乙?；敢种苿┱T導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法是按照以下步驟進(jìn)行的:一、取毛果楊含腋芽的莖段在WPM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，至長出幼苗；二、將步驟一的毛果楊幼苗在WPM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至長出不定根；三、將步驟二長出不定根的幼苗放入含O~5 μ M組蛋白去乙酰化酶抑制劑的水溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，至不定芽誘導(dǎo)再生，即完成組蛋白去乙?；敢种苿┱T導(dǎo)毛果楊不定芽再生。
[0006]本發(fā)明包含以下有益效果:
[0007]目前，有關(guān)植物HDAC的研究主要涉及根的生長速率、根表皮細(xì)胞模式形成、側(cè)根形成等方面，而有關(guān)HDAC酶活性抑制后能誘導(dǎo)根再生出不定芽的研究結(jié)果未見報(bào)道。本發(fā)明以毛果楊組培苗的根為外植體，通過TSA處理誘導(dǎo)外植體直接分化出不定芽，省略了愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)過程，簡化了組織培養(yǎng)體系，縮短不定芽誘導(dǎo)周期，一般經(jīng)30天左右即可完成不定芽的誘導(dǎo)過程，再生頻率較高(再生芽簇/根數(shù)目=37%)，是快速獲得再生植株的一個(gè)有效方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為實(shí)施例在加入5 μ MTSA處理下不定芽的誘導(dǎo)再生圖片；
[0009]圖2為實(shí)施例在加入I μ MTSA處理下不定芽的誘導(dǎo)再生圖片；
[0010]圖3為實(shí)施例在加入O μ MTSA處理下不定芽的誘導(dǎo)再生圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0011]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式的一種組蛋白去乙?；敢种苿┱T導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法是按照以下步驟進(jìn)行的:一、取毛果楊含腋芽的莖段在WPM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，至長出幼苗；二、將步驟一的毛果楊幼苗在WPM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至長出不定根；三、將步驟二長出不定根的幼苗放入含O~5 μ M組蛋白去乙酰化酶抑制劑的水溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，至不定芽誘導(dǎo)再生，即完成組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導(dǎo)毛果楊不定芽再生。
[0012]本實(shí)施方 式包含以下有益效果:
[0013]目前，有關(guān)植物HDAC的研究主要涉及根的生長速率、根表皮細(xì)胞模式形成、側(cè)根形成等方面，而有關(guān)HDAC酶活性抑制后能誘導(dǎo)根再生出不定芽的研究結(jié)果未見報(bào)道。本發(fā)明以毛果楊組培苗的根為外植體，通過TSA處理誘導(dǎo)外植體直接分化出不定芽，省略了愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)過程，簡化了組織培養(yǎng)體系，縮短不定芽誘導(dǎo)周期，一般經(jīng)30天左右即可完成不定芽的誘導(dǎo)過程，再生頻率較高，是快速獲得再生植株的一個(gè)有效方法。
[0014]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一不同的是:步驟一中所述的誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)的誘導(dǎo)條件為:在溫度為23~25°C、光照時(shí)間為16小時(shí)/天的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)至長出幼苗的苗高為2~3cm。其它與【具體實(shí)施方式】一相同。
[0015]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一或二不同的是:步驟二中所述的培養(yǎng)條件為:在溫度為23~25°C、光照時(shí)間為16小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)至長出不定根長度為0.5~1.5cm。其它與【具體實(shí)施方式】一或二相同。
[0016]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至三之一不同的是:步驟三中所述的不定芽誘導(dǎo)再生的條件為:在溫度為20~25°C，光照時(shí)間為16小時(shí)/天的條件下誘導(dǎo)出不定芽。其它與【具體實(shí)施方式】一至三之一相同。
[0017]【具體實(shí)施方式】五:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至四之一不同的是:步驟三中所述的WPM培養(yǎng)基中加入組蛋白去乙?；敢种苿?TSA)水溶液，組蛋白去乙?；敢种苿?TSA)的濃度為I~5μΜ。其它與【具體實(shí)施方式】一至四之一相同。[0018]【具體實(shí)施方式】六:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至五之一不同的是:步驟三中所述的WPM培養(yǎng)基中加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑(TSA)水溶液，組蛋白去乙?；敢种苿?TSA)的濃度為2~5μΜ。其它與【具體實(shí)施方式】一至五之一相同。
[0019]【具體實(shí)施方式】七:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至六之一不同的是:步驟三中所述的WPM培養(yǎng)基中加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑(TSA)水溶液，組蛋白去乙?；敢种苿?TSA)的濃度為3~5μΜ。其它與【具體實(shí)施方式】一至六之一相同。
[0020]【具體實(shí)施方式】八:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至七之一不同的是:步驟三中所述的WPM培養(yǎng)基中加入組蛋白去乙?；敢种苿?TSA)水溶液，組蛋白去乙?；敢种苿?TSA)的濃度為4~5μΜ。其它與【具體實(shí)施方式】一至七之一相同。
[0021]【具體實(shí)施方式】九:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】一至八之一不同的是:所述的WPM培養(yǎng)基均含有質(zhì)量百分含量為2%的蔗糖、濃度為0.lmg/L的IBA和質(zhì)量百分含量為0.6%的瓊脂；所述的WPM培養(yǎng)基pH=5.8。其它與【具體實(shí)施方式】一至八之一相同。
[0022]本實(shí)施方式所述的WPM培養(yǎng)基為市售產(chǎn)品。
[0023]通過以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果:
[0024]本實(shí)施例的一種組蛋白去乙?；敢种苿┱T導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法是按照以下步驟進(jìn)行的:一、取毛果楊組培苗去除葉片，用解剖刀切成小的莖段，每個(gè)莖段含一個(gè)腋芽，直立放在WPM培養(yǎng)基上，在溫度為23~25°C、光照時(shí)間為16小時(shí)/天的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)至長出幼苗的苗高為2~3cm ;二、將步驟一的毛果楊幼苗，用解剖刀將毛果楊幼苗從莖段上切下，直立放入WPM培養(yǎng)基中，在溫度為23~25°C、光照時(shí)間為16小時(shí)/天的條件下誘導(dǎo)生根，至長出Icm不定根；三、將步驟二長出不定根的幼苗分別放入含O μ M，I μ M和5 μ M組蛋白 去乙?；敢种苿┑乃芤?，在溫度為20~25°C、光照時(shí)間為16小時(shí)/天的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，至不定芽誘導(dǎo)再生，即完成組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導(dǎo)毛果楊不定芽再生。
[0025]本實(shí)施例所述的WPM培養(yǎng)基均含有質(zhì)量百分含量為2%的蔗糖、濃度為0.lmg/L的IBA和質(zhì)量百分含量為0.6%的瓊脂；所述的WPM培養(yǎng)基pH=5.8 ;所述的WPM培養(yǎng)基為市售
女口
廣叩ο
[0026]通過對(duì)本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，得到以下結(jié)論:
[0027]組蛋白去乙?；敢种苿?TSA)濃度為5μ M時(shí)能有效誘導(dǎo)不定芽的再生(如圖1所示)，每個(gè)主根在加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑(TSA)兩周后根尖重新生出幼嫩的新根，在加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑(TSA)四周后，在舊根的根尖處再生出幼芽和發(fā)育成幼苗。不加TSA或TSA濃度為I μΜ時(shí)，均不能有效誘導(dǎo)芽的再生(如圖2和圖3所示)。
【權(quán)利要求】
1.一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于它是按照以下步驟進(jìn)行的: 一、取毛果楊含腋芽的莖段在WPM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，至長出幼苗；二、將步驟一的毛果楊幼苗在WPM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至長出不定根；三、將步驟二長出不定根的幼苗放入含O~5 μ M組蛋白去乙酰化酶抑制劑的水溶液，繼續(xù)培養(yǎng)，至不定芽誘導(dǎo)再生，即完成組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導(dǎo)毛果楊不定芽再生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于步驟一中所述的誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)的誘導(dǎo)條件為:在溫度為23~25°C、光照時(shí)間為16小時(shí)/天的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)至長出幼苗的苗高為2~3cm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組蛋白去乙?；敢种苿┱T導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于步驟二中所述的培養(yǎng)條件為:在溫度為23~25°C、光照時(shí)間為16小時(shí)/天的條件下培養(yǎng)至長出不定根長度為0.5~1.5cm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于步驟三中所述的不定芽誘導(dǎo)再生的條件為:在溫度為20~25°C，光照時(shí)間為16小時(shí)/天的條件下誘導(dǎo)出不定芽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組蛋白去乙?；敢种苿┱T導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于步驟三中所述的WPM培養(yǎng)基中加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑水溶液，組蛋白去乙酰化酶抑制劑的濃度為I~5 μ M。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 所述的一種組蛋白去乙?；敢种苿┱T導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于步驟三中所述的WPM培養(yǎng)基中加入組蛋白去乙?；敢种苿┧芤?，組蛋白去乙酰化酶抑制劑的濃度為2~5 μ Μ。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組蛋白去乙?；敢种苿┱T導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于步驟三中所述的WPM培養(yǎng)基中加入組蛋白去乙?；敢种苿┧芤?，組蛋白去乙?；敢种苿┑臐舛葹?~5 μ Μ。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組蛋白去乙?；敢种苿┱T導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于步驟三中所述的WPM培養(yǎng)基中加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑水溶液，組蛋白去乙?；敢种苿┑臐舛葹?~5 μ Μ。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組蛋白去乙?；敢种苿┱T導(dǎo)毛果楊不定芽再生的方法，其特征在于所述的WPM培養(yǎng)基均含有質(zhì)量百分含量為2%的蔗糖、濃度為0.lmg/L的IBA和質(zhì)量百分含量為0.6%的瓊脂；所述的WPM培養(yǎng)基pH=5.8。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103461123SQ201310416635
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】馬旭俊, 李淑娟, 楊傳平 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué)