本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，涉及GINS2基因或蛋白的抑制劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著人類生活習(xí)慣和行為模式的改變，以及農(nóng)工業(yè)發(fā)展過程帶來的環(huán)境污染和人口老齡化等原因，惡性腫瘤成為人類致死的主要疾病。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中心(IARC/WHO)的最新數(shù)據(jù)顯示惡性腫瘤在全球的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，2008年760萬人死于惡性腫瘤，其中64％發(fā)生在發(fā)展中國家。在我國，腫瘤防治面臨的形勢(shì)也極為嚴(yán)峻，最新報(bào)告顯示，在過去30年間，我國惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率均呈明顯上升趨勢(shì)；據(jù)預(yù)測(cè)，在未來20-30年間，我國惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率不斷上升的趨勢(shì)將繼續(xù)維持。因此，對(duì)腫瘤的研究是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的持續(xù)研究熱點(diǎn)之一。惡性腫瘤傳統(tǒng)療法如放療、化療和手術(shù)治療的局限性促使人們尋找新的抗腫瘤方法。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入，人們已意識(shí)到腫瘤是一種基因病，糾正發(fā)生缺陷的基因可為腫瘤的治療提供新的希望。近年來發(fā)展了許多針對(duì)腫瘤的基因治療方法的研究，但迄今為止進(jìn)入臨床應(yīng)用的幾種基因藥物的臨床療效有限，且具有潛在的、長期的、延遲的副作用，因此，尋求治療的新靶點(diǎn)和開發(fā)新的基因治療方法已成為國內(nèi)外腫瘤基因治療的研究方向。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是一門基因阻斷技術(shù)，為一種雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)分子在mRNA水平上阻斷特異基因的表達(dá)或使其沉默的過程，即序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。近年來，RNAi已成為腫瘤基因治療的有效策略。利用RNAi技術(shù)可以抑制原癌基因、突變的抑癌基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、抗凋亡相關(guān)基因等表達(dá)來抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。GINS2是DNA復(fù)制復(fù)合體GINS家族成員之一，位于人染色體16q24上，其mRNA長度為1196bp，編碼相對(duì)分子質(zhì)量為21000的蛋白質(zhì)。GINS是一種復(fù)制解旋酶，在移動(dòng)到復(fù)制叉前打開DNA雙鏈。研究表明，GINS家族成員在癌癥的發(fā)生中起一定作用，如GINS家族成員在侵襲性黑色素瘤中過表達(dá)，也有文獻(xiàn)表明，DNA復(fù)制相關(guān)蛋白在不同細(xì)胞中有不同的作用，如在決定中心體復(fù)制數(shù)量和疾病發(fā)生的不同階段方面，GINS均發(fā)揮了一定功能，特別是與染色體的分離密切相關(guān)。而目前關(guān)于GINS2在腫瘤相關(guān)領(lǐng)域的報(bào)道很少。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供GINS2基因或蛋白的抑制劑的新用途。本發(fā)明提供了GINS2基因或蛋白的抑制劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。作為一種具體實(shí)施方式，所述的抑制劑選自以GINS2蛋白或其轉(zhuǎn)錄本為靶序列、且能夠抑制GINS2蛋白表達(dá)或基因轉(zhuǎn)錄的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反義核酸；或能表達(dá)或形成所述siRNA、dsRNA、miRNA、反義核酸的構(gòu)建物。作為一個(gè)優(yōu)選例，所述的抑制劑選自下列中的一種：a)siRNA，所述siRNA的靶序列如SEQIDNO.1所示；b)shRNA，所述shRNA的編碼序列正義鏈如SEQIDNO.5所示，反義鏈如SEQIDNO.6所示；c)能夠表達(dá)a)所述siRNA或b)所述shRNA的載體；d)包含c)所述載體的病毒。作為本發(fā)明的一種具體實(shí)施方式，所述的腫瘤為人乳頭狀甲狀腺癌。本發(fā)明還提供了一種siRNA分子，所述siRNA的靶序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明還提供了一種shRNA分子，所述shRNA的編碼序列正義鏈如SEQIDNO.5所示，反義鏈如SEQIDNO.6所示。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體能夠表達(dá)所述siRNA分子或所述shRNA分子。本發(fā)明還提供了一種病毒，其包含所述表達(dá)載體。作為本發(fā)明的一種具體實(shí)施方式，所述病毒為慢病毒。本發(fā)明還提供了一種抗腫瘤藥物，其包含所述siRNA分子、所述shRNA分子、所述表達(dá)載體和/或所述病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還提供了檢測(cè)人GINS2基因或蛋白表達(dá)水平的試劑在制備乳頭狀甲狀腺癌診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：1、本發(fā)明設(shè)計(jì)了針對(duì)人GINS2基因的小分子干擾RNA(siRNA)序列，RNA干擾載體和RNA干擾慢病毒，進(jìn)一步檢測(cè)了GINS2基因的沉默效率、GINS2-siRNA慢病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力和凋亡水平的影響，結(jié)果表明：(1)采用RNAi方法下調(diào)人GINS2基因的表達(dá)后可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長并促進(jìn)其凋亡，這一研究成果表明GINS2基因可促進(jìn)腫瘤生長，是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，通過RNAi方式沉默GINS2基因的表達(dá)可作為抑制腫瘤發(fā)展的有效手段；(2)本發(fā)明的siRNA序列能夠顯著地特異性沉默人腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源GINS2基因的表達(dá)(沉默效率高達(dá)80.6％)，顯著優(yōu)于常規(guī)方法所得的其他眾多siRNA序列，表達(dá)該siRNA序列的慢病毒能夠高效地抑制人腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)人腫瘤細(xì)胞的凋亡，因此本發(fā)明的siRNA序列、shRNA序列以及它們的構(gòu)建體和病毒可用于制備高效的抗腫瘤藥物。2、本發(fā)明證實(shí)人GINS2基因在乳頭狀甲狀腺癌腫瘤組織和瘤旁組織表達(dá)差異顯著，因此可作為乳頭狀甲狀腺癌的診斷標(biāo)志物。附圖說明圖1.GV115載體圖譜。圖2.載體線性化后目的片段的瓊脂糖凝膠電泳圖片。泳道1：1kbMarker：從上至下依次為10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3.5kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp；泳道2：AgeI和EcoRI雙酶切線性化后的載體質(zhì)粒；泳道3：沒有酶切的載體質(zhì)粒。圖3.RNA干擾載體構(gòu)建及陽性克隆鑒定示意圖。圖4.RNA干擾載體陽性克隆鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖片。泳道1：陰性對(duì)照(ddH2O)，排除系統(tǒng)中外源核酸污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果；泳道2：自連對(duì)照(空載體自連對(duì)照組)；泳道3：250bpMarker：從上至下依次為5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道4-8：單克隆psc45562-1,2,3,4,5。圖5.GINS2-RNAi慢病毒侵染人乳頭狀甲狀腺癌K1細(xì)胞3天后，GINS2mRNA表達(dá)水平顯著降低。圖6.GINS2-RNAi慢病毒侵染人乳頭狀甲狀腺癌K1細(xì)胞5天后，引起細(xì)胞增殖抑制。經(jīng)shRNA慢病毒感染，細(xì)胞鋪于96孔板。Celigo連續(xù)檢測(cè)5天，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組K1細(xì)胞的增殖速率受到顯著抑制。提示GINS2基因與K1細(xì)胞的增殖能力顯著相關(guān)。圖7和圖8.FACS檢測(cè)GINS2基因消減對(duì)人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞周期的影響。shRNA慢病毒感染后第3天傳代，第5天檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組處于G1期的細(xì)胞顯著減增多，實(shí)驗(yàn)組處于S期的細(xì)胞顯著減少，處于G2/M期的細(xì)胞減少，提示GINS2基因與K1細(xì)胞的凋亡顯著相關(guān)。圖9和圖10.FACS檢測(cè)GINS2基因消減對(duì)凋亡的影響。shRNA慢病毒感染第3天傳代，第5天檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組發(fā)生凋亡的K1細(xì)胞顯著增加，提示GINS2基因與K1細(xì)胞的凋亡顯著相關(guān)。圖11.人GINS2基因在乳頭狀甲狀腺癌患者腫瘤組織和瘤旁組織的差異表達(dá)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件。實(shí)施例1：針對(duì)人GINS2基因RNAi慢病毒的制備技術(shù)路線為：從Genbank中調(diào)取人GINS2基因序列；預(yù)測(cè)siRNA位點(diǎn)；合成針對(duì)GINS2基因的有效siRNA序列，兩端含酶切位點(diǎn)粘端的雙鏈DNAOligo；慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNAOligo連接，構(gòu)建表達(dá)GINS2基因的siRNA序列的RNAi質(zhì)粒；將RNAi質(zhì)粒和慢病毒包裝需要的輔助載體共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞，產(chǎn)生種族慢病毒顆粒，即可制得高效沉默GINS2基因的慢病毒。1、RNA干擾靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及雙鏈DNAoligo制備(1)設(shè)計(jì)合成針對(duì)人GINS2基因的有效的siRNA靶點(diǎn)從Genbank調(diào)取GINS2(NM_016095)基因信息；設(shè)計(jì)針對(duì)GINS2基因的有效的siRNA靶點(diǎn)。表1為針對(duì)GINS2基因的有效siRNA靶點(diǎn)序列。表1靶向人GINS2基因的有效siRNA靶點(diǎn)序列(2)DNAoligo序列合成根據(jù)已選靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)shRNA干擾序列，并在兩端添加合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)以完成載體構(gòu)建。除此之外，在正鏈3’端添加TTTTT終止信號(hào)，而反鏈5’端添加終止信號(hào)互補(bǔ)序列。合成單鏈DNAoligo。表2兩端含AgeI和EcoRI酶切位點(diǎn)粘端的單DNAOligo＊CCGG：AgeI酶切位點(diǎn)；AATTC：EcoRI酶切位點(diǎn)；G：EcoRI酶切位點(diǎn)互補(bǔ)序列。(3)雙鏈DNAoligo制備將合成的單鏈DNAoligo干粉溶解于退火緩沖液中(終濃度20μM)，90℃水浴15min。自然冷卻至室溫后，形成帶粘性末端的雙鏈，其序列為：正鏈：5’-CCGGGCGATTAACCTGAAACAAAGACTCGAGTCTTTGTTTCAGGTTAATCGCTTTTTG-3’(SEQIDNO.5)；反鏈：5’-AATTCAAAAATCTTTGTTTCAGGTTAATCGCCTCGAGGCGATTAACCTGAAACAAAGAAATTCAAAAA-3’(SEQIDNO.6)。(4)線性化載體制備按照NEB說明書配制50μl反應(yīng)體系，使用AgeI和EcoRI雙酶切GV115載體(購于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，載體圖譜見圖1)使其線性化。反應(yīng)體系如下：37℃(最適溫度)反應(yīng)1h，之后切膠回收目的片段。目的片段的瓊脂糖凝膠電泳圖片見圖2。2、RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建(1)連接按照FermentasT4DNALigase說明書配制20μl反應(yīng)體系，將雙鏈DNAoligo與線性化的載體相連。反應(yīng)體系如下：于16℃反應(yīng)1-3h，連接產(chǎn)物命名為psc45562，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。(2)轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，詳細(xì)操作步驟如下：1)將10μl連接產(chǎn)物psc45562加入到100μl大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min。2)42℃熱激90sec，冰浴2min。3)加入500μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，200rpm于37℃搖床震蕩培養(yǎng)1hr。4)取150μl菌液均勻涂抹在含有Amp的LB固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。(3)陽性克隆的PCR鑒定①RNA干擾載體構(gòu)建及陽性克隆鑒定示意圖RNA干擾載體構(gòu)建及陽性克隆鑒定示意圖參見圖3。②引物鑒定引物序列如下：③PCR擴(kuò)增用無菌槍頭挑取單個(gè)菌落為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，22次循環(huán)；72℃5min。PCR反應(yīng)體系如下：④瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)束后，取5μl產(chǎn)物，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶。瓊脂糖凝膠電泳圖片見圖4。連接入shRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為：342bp；沒有連接入shRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為：307bp。由此判斷psc24135-1,2,4,5為陽性克隆，保存鑒定結(jié)果正確的克隆。(4)陽性克隆測(cè)序結(jié)果分析以鑒定引物-F進(jìn)行陽性克隆測(cè)序，挑選測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)序列完全一致的克隆用于下一步實(shí)驗(yàn)。測(cè)序結(jié)果如SEQIDNO.9所示，其中第198-256bp為shRNA干擾序列插入片段，AgeI酶切位點(diǎn)被破壞。3、質(zhì)粒抽提將測(cè)序正確的菌液轉(zhuǎn)接于150ml含Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床震蕩培養(yǎng)過夜。按照EndoFreeMaxiPlasmidKit說明書提取質(zhì)粒，質(zhì)檢合格的質(zhì)粒進(jìn)入下游流程。質(zhì)粒抽提的詳細(xì)操作步驟如下：1)8000rpm離心4min收集菌體；2)加入7mlP1，震蕩混勻；3)加入7mlP3，顛倒混勻6～8次，靜置5min；4)加入7mlP4，顛倒混勻6～8次，冰浴10min；5)9000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到過濾器CS中，過濾后加入10ml異丙醇混勻；6)向吸附柱中加入2.5ml的平衡液BL，8000rpm離心2min，倒掉收集管中的廢液，將柱子放回備用；7)將上清分兩次倒入吸附柱中，8000rpm離心2min，棄廢液；8)向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(已加入無水乙醇)，相同轉(zhuǎn)速離心2min，棄廢液，重復(fù)該步驟一次；10)向吸附柱中加入3ml無水乙醇，8000rpm離心2min，棄廢液；11)9500rpm空甩5min，除去殘留的漂洗液；將吸附柱轉(zhuǎn)移至一新的白管中，在柱中心滴加800μl洗脫緩沖液TB(先預(yù)熱)，室溫放置5min，然后9500rpm離心2min；12)將管中的洗脫液轉(zhuǎn)移到一干凈的1.5mlEP管中，-20℃保存；13)取樣電泳，使用分光光度計(jì)(Thermo_Nanodrop2000)測(cè)定質(zhì)粒濃度，質(zhì)檢；14)將質(zhì)檢合格的質(zhì)粒進(jìn)行病毒包裝。4、慢病毒包裝人胚腎細(xì)胞293T，慢病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞，生長培養(yǎng)基為DMEM(含10％FBS)，貼壁細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細(xì)胞。大腸桿菌菌株DH5α，用于擴(kuò)增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。以Qiagen公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取RNAi質(zhì)粒，慢病毒包裝系統(tǒng)中三種質(zhì)粒DNA(GV載體質(zhì)粒、pHelper1.0載體質(zhì)粒、pHelper2.0載體質(zhì)粒)，配制成100ng/μl儲(chǔ)存液。轉(zhuǎn)染前24h，用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長期的293T細(xì)胞，以含10％血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度約5×106細(xì)胞/15ml，重新接種于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h待細(xì)胞密度達(dá)70％～80％時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2h更換為無血清培養(yǎng)基；向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(GV載體質(zhì)粒20μg、pHelper1.0載體質(zhì)粒15μg、pHelper2.0載體質(zhì)粒10μg)，把相應(yīng)體積的轉(zhuǎn)染試劑混合均勻，調(diào)整總體積為1ml，在室溫下溫育15min；混合液緩慢滴加至293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，混勻，于37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)6h后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，加入10ml的PBS液清洗一次，輕柔晃動(dòng)培養(yǎng)皿以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物后倒棄；緩慢加入含10％血清的細(xì)胞培養(yǎng)基20ml，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48-72h。慢病毒濃縮與純化：根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，收集轉(zhuǎn)染后48h(轉(zhuǎn)染即可計(jì)為0h)的293T細(xì)胞上清液；于4℃、4000g離心10min，除去細(xì)胞碎片；以0.45μm濾器過濾上清液于40ml超速離心管中；分別配平樣品，將帶有病毒上清液的超速離心管逐一放入至Beckman超速離心機(jī)內(nèi)，設(shè)置離心參數(shù)為25000rpm，離心時(shí)間為2h，離心溫度控制在4℃；離心結(jié)束后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒保存液(可用PBS或細(xì)胞培養(yǎng)基替代)，輕輕反復(fù)吹打重懸；經(jīng)充分溶解后，高速離心10000rpm、5min后，取上清分裝。實(shí)施例2：RT-PCR檢測(cè)GINS2基因的沉默效率將處于對(duì)數(shù)生長期的人乳頭狀甲狀腺癌K1細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約為5×104/ml)，接種于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到約30％。加入適量的實(shí)施例1制備的病毒，培養(yǎng)6小時(shí)后更換培養(yǎng)基，待侵染時(shí)間達(dá)到3天后，收集細(xì)胞。RNA抽提及cDNA合成：①收取樣品，Trizol裂解：收集細(xì)胞，2000rpm離心5min，去上清，細(xì)胞沉淀中加入1mLTrizol，充分混勻后室溫靜置5min，然后轉(zhuǎn)移至新的1.5mLEP管中。②每管加入200μL氯仿，用手上下顛倒EP管15s，室溫靜置10min。③4℃、12800rpm，離心15min。④吸取上層液體移至新的1.5mLEP管，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻后4℃靜置10min。⑤4℃、12800rpm離心12min后，棄上清。⑥加入1mL、75％乙醇(用DEPC水新鮮配制)，洗滌沉淀。⑦4℃、11800rpm離心5min，棄去大部分上清。⑧4℃、11800rpm再次離心5min，棄去上清，室溫干燥。⑨待RNA沉淀基本透明時(shí)，加入RNase-free水(加入體積視RNA沉淀量而定)至完全溶解，Nanodrop2000/2000C分光光度計(jì)分析測(cè)定所抽提RNA的濃度及質(zhì)量。⑩將RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系在42℃水浴反應(yīng)1h，然后在70℃水浴10min使RT酶失活，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：試劑每管加入量5×RTbuffer5μl10mMdNTPs2μlRnasin(40U/μL)0.4μlM-MLV-RTase(200U/μl)1μlRNase-FreeH2O5.6μlRT-PCR：采用Agilent公司的MX3000p型的RealtimePCR進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。GINS2基因的引物如下：上游引物5’-CCCGAAGGCAGACGAAATCC-3’(SEQIDNO.10)，下游引物5’-TGAGGAAAGTCCCGCTGGTG-3’(SEQIDNO.11)。以管家基因GAPDH為內(nèi)參，引物序列如下：上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’(SEQIDNO.12)，下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’(SEQIDNO.13)。反應(yīng)體系如下：試劑每管加入量SYBRpremixextaq10.0μL上游引物(2.5μM)0.5μL下游引物(2.5μM)0.5μLcDNA1.0μLRNase-FreeH2O8.0μL設(shè)定程序?yàn)閮刹椒≧eal-timePCR：預(yù)變性95℃，30s，之后每一步變性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值。PCR結(jié)束后，95℃變性1min，然后冷卻至55℃，使DNA雙鏈充分結(jié)合。從55℃開始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s，同時(shí)讀取吸光值，制作熔解曲線。采用2-ΔΔCt分析法計(jì)算侵染GINS2mRNA的表達(dá)豐度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人乳頭狀甲狀腺癌K1細(xì)胞中GINS2mRNA的表達(dá)水平顯著下降，具體下調(diào)了80.6％(圖5)。實(shí)施例3：檢測(cè)侵染GINS2-siRNA慢病毒的腫瘤細(xì)胞的增殖能力將處于對(duì)數(shù)生長期的人乳頭狀甲狀腺癌K1細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約為5×104/ml)，接種于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到約30％。加入適量的實(shí)施例1制備的病毒，培養(yǎng)6小時(shí)后更換培養(yǎng)基，待侵染時(shí)間達(dá)到5天后，收集細(xì)胞。完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液(2×104/ml)，以細(xì)胞密度約為2000個(gè)/孔接種于96孔板。每組3個(gè)復(fù)孔，每孔100μl。鋪好板后，置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從鋪板后第二天開始，每天用Celigo檢測(cè)讀板一次，連續(xù)檢測(cè)讀板3-5天；通過調(diào)整analysissettings的輸入?yún)?shù)，準(zhǔn)確地計(jì)算出每次掃描孔板中的帶綠色熒光的細(xì)胞的數(shù)量；對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖，繪出5天的細(xì)胞增殖曲線。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)值和時(shí)間點(diǎn)，繪制基于細(xì)胞計(jì)數(shù)值的細(xì)胞生長曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慢病毒侵染組腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)5天后，增殖速度顯著減緩，遠(yuǎn)低于對(duì)照組腫瘤細(xì)胞的增殖速度，人乳頭狀甲狀腺癌K1細(xì)胞的活力細(xì)胞數(shù)目相對(duì)對(duì)照組下調(diào)了77.5％(圖6)。實(shí)施例4：檢測(cè)侵染GINS2-siRNA慢病毒的腫瘤細(xì)胞凋亡水平待各實(shí)驗(yàn)組6孔板細(xì)胞生長至覆蓋率約為70％時(shí)，干擾組用GINS2-siRNA誘導(dǎo)凋亡；胰酶消化，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，與上清細(xì)胞收集于同一5mL離心管中，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔(為保證上機(jī)細(xì)胞數(shù)足夠，細(xì)胞數(shù)目≥5×105/處理)；1300rmp離心5min，棄上清，4℃預(yù)冷的D-Hanks(pH＝7.2～7.4)洗滌細(xì)胞沉淀；1×bindingbuffer洗滌細(xì)胞沉淀一次，1300rmp、3min離心，收集細(xì)胞；200μL1×bindingbuffer重懸細(xì)胞沉淀；加入10μLAnnexinV-APC染色，室溫避光10-15min；根據(jù)細(xì)胞量，補(bǔ)加400-800μL1×bindingbuffer，上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果表明，GINS2-siRNA干擾組腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，如圖所示，在人乳頭狀甲狀腺癌K1細(xì)胞(圖7、圖8、圖9、圖10)中，圖7和圖8提示沉默GINS2表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組處于G1期的細(xì)胞顯著增多，實(shí)驗(yàn)組處于S期的細(xì)胞顯著減少，處于G2/M期的細(xì)胞減少，提示GINS2基因與K1細(xì)胞的凋亡顯著相關(guān)。圖9和圖10提示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組。表明下調(diào)GINS2表達(dá)水平可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。實(shí)施例5：靶向人GINS2基因的有效siRNA序列的篩選針對(duì)人GINS2基因設(shè)計(jì)siRNA序列，除實(shí)施例1中SEQIDNO.1所示序列外，設(shè)計(jì)的其他siRNA靶序列選擇示例如下：表3靶向人GINS2基因的siRNA靶序列按照實(shí)施例1-4所述的方法構(gòu)建慢病毒載體，檢測(cè)對(duì)GINS2基因的沉默效率以及對(duì)人乳頭狀甲狀腺癌K1細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果見表4。表4siRNA序列的沉默效率、對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)施例1中siRNA序列對(duì)人GINS2基因的沉默效率和對(duì)人乳頭狀甲狀腺癌K1細(xì)胞的增殖下調(diào)能力以及凋亡促進(jìn)能力顯著優(yōu)于其他siRNA序列，其可用于制備高效的抗腫瘤藥物。實(shí)施例6：檢測(cè)人GINS2基因在腫瘤組織和瘤旁組織的差異表達(dá)取59例乳頭狀甲狀腺癌患者腫瘤組織和瘤旁組織標(biāo)本，其中男性17例，女性42例，年齡中位數(shù)為42歲(15～81歲)。分別檢測(cè)腫瘤組織和瘤旁組織GINS2mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)化，結(jié)果顯示腫瘤組織GINS2mRNA的表達(dá)量顯著高于瘤旁組織(P<0.05)，如圖11所示。腫瘤組織GNIS2mRNA相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)為156.26(P25～P75為99.81～220.26)，瘤旁組織GNIS2mRNA相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)為66.80(P25～P75為48.45～100.76)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>上海市第七人民醫(yī)院<120>GINS2基因或蛋白的抑制劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用<130>/<160>15<170>PatentInversion3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1gattaacctgaaacaaaga19<210>2<211>10<212>DNA<213>人工序列<400>2aattcaaaaa10<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3gcgattaacctgaaacaaaga21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4tctttgtttcaggttaatcgc21<210>5<211>58<212>DNA<213>人工序列<400>5ccgggcgattaacctgaaacaaagactcgagtctttgtttcaggttaatcgctttttg58<210>6<211>68<212>DNA<213>人工序列<400>6aattcaaaaatctttgtttcaggttaatcgcctcgaggcgattaacctgaaacaaagaaa60ttcaaaaa68<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7cctatttcccatgattccttcata24<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8gtaatacggttatccacgcg20<210>9<211>853<212>DNA<213>人工序列<400>9tgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatac60gtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaat120ggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatctt180gtggaaaggacgaaacaccgggcgattaacctgaaacaaagactcgagtctttgtttcag240gttaatcgcttttttgaattctcgacctcgagacaaatggcagtattcatccacgaattc300ggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagt360aatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataactta420cggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatga480cgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatt540tacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgcccccta600ttgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatggg660actttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggt720tttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctcc780accccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaat840gtcgtaacaactc853<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>10cccgaaggcagacgaaatcc20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>11tgaggaaagtcccgctggtg20<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>12tgacttcaacagcgacaccca21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>13caccctgttgctgtagccaaa21<210>14<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>14caccgctggcgattaacct19<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>15caccggatcatgaacgaa18當(dāng)前第1頁1 2 3