一種鑒定咖啡種質資源的方法
【專利摘要】本發明涉及生物信息【技術領域】，公開了一種鑒定咖啡種質資源的方法。該方法將標準咖啡品種DNA用SEQ?ID?NO:1-10所示序列引物進行PCR擴增，根據擴增產物的凝膠電泳結果以咖啡品種編號和條帶存在位點編號為橫、縱坐標，在每一橫、縱坐標交結處記錄標準咖啡品種條帶的檢測結果，得到標準咖啡品種的RAPD指紋圖譜；將待測咖啡品種DNA用同樣引物PCR擴增，擴增產物按上述方法構建待測咖啡品種的RAPD指紋圖譜，并與標準咖啡品種的RAPD指紋圖譜比對判斷。本發明應用RAPD分子標記技術從遺傳本質上對咖啡種質資源進行了準確鑒定，解決了咖啡種質鑒定困難的問題，且簡單、易操作，檢測迅速。
【專利說明】一種鑒定咖啡種質資源的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物信息【技術領域】，具體的說是涉及一種鑒定咖啡種質資源的方法。【背景技術】
[0002]咖啡與可可、茶并列世界三大飲料作物，其產量、消費量、經濟價值均占首位，是繼石油之后，世界排名第二的原料型產品。國內主產區在云南和海南，種植面積已達50余萬畝，計劃到“十二五”末發展到100萬~150萬畝。以往咖啡的分類主要是依靠形態學的方法，然而由于大多數形態性狀受環境等因數影響大，很難進行種質鑒定和良種選育的要求。DNA分子標記技術是一種快速高效的遺傳分析方法，已經廣泛地應用于植物的遺傳研究，分子標記輔助育種已經在水稻、小麥和棉花等重要經濟作物的研究和生產中得到應用，并取得明顯的經濟效益。
[0003]DNA分子標記能反映生物個體或種群基因組中某種差異特征的DNA片段，可以從根本上揭示植物內在的基因差異，近年來已經廣泛應用到作物品種鑒定和種質資源分類等研究領域。目前，應用較多的是SSR、RAPD, RFLP和AFLP等分子標記。
[0004]其中，隨機擴增多態性DNA (Random AmLplified Polymorphic DNA,RAPD)技術作為現代分子生物學研究的重要手段之一，具有樣品用量少、檢測效率高、操作簡便、費用低等特點?，F已在種質資源鑒定、遺傳多樣性、分子標記育種等研究方面被廣泛應用。但是在建造咖啡DNA指紋圖譜、并利用RAPD分子標記技術進行咖啡種質資源鑒定的方法尚未見報道。

【發明內容】

[0005]有鑒于此，本發明的目的在于提供一種鑒定咖啡種質資源的方法，使該方法能夠利用RAPD分子標記技術準確、簡便的鑒定咖啡種質資源。
`[0006]為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案:
[0007]一種鑒定咖啡種質資源的方法，包括以下步驟:
[0008]步驟1、選取標準咖啡品種中的一種或兩種以上，分別進行DNA提取，然后采用SEQID NO: 1-10所示序列中的一條或兩條以上的RAH)引物進行PCR擴增，所得擴增產物進行凝膠電泳檢測，根據凝膠電泳圖結果以標準咖啡品種編號和所有標準咖啡品種的條帶存在位點編號為橫、縱坐標，在每一個橫、縱坐標交結處記錄標準咖啡品種條帶的檢測結果，將有擴增條帶的標記為有條帶，無擴增條帶的標記為無條帶，得到標準咖啡品種的RAPD指紋圖譜；
[0009]步驟2、提取待測咖啡品種的DNA，采用步驟I相同的RAPD弓丨物進行PCR擴增，將所得到的擴增產物進行凝膠電泳檢測，根據凝膠電泳圖結果以待測咖啡品種編號和步驟I所述所有標準咖啡品種的條帶存在位點編號為橫、縱坐標，在每一個橫、縱坐標交結處記錄待測咖啡品種條帶的檢測結果，將有擴增條帶的標記為有條帶，無擴增條帶的標記為無條帶，得到待測咖啡品種的RAPD指紋圖譜，然后與所述標準咖啡品種的RAPD指紋圖譜進行比對判斷。
[0010]其中，本發明對PCR擴增的反應體系及擴增程序進行了優化，避免了試驗過程人為產生的誤差，使結果更為穩定和可靠。
[0011]作為優選方案，本發明所述PCR擴增體系為:反應總體積為20 μ L，其中Mg2+濃度為1.5mmol/L、dNTP濃度為0.3mmo/L、引物濃度為0.4 μ mol/L、咖啡品種的DNA用量為20ng、Taq DNA 聚合酶用量為 1.0U、2 μ L10XPCR buffer?
[0012]其中，若引物不止一條，則每條引物的濃度均為0.4μ mol/L。
[0013]作為優選方案，所述PCR擴增程序為:
[0014]94。〇預變性311^11;
[0015]94°C變性 lmin、38°C復性 lmin45s、72°C延伸 2min，循環 30 次；
[0016]72°〇延伸711^11，41:保存。
[0017]本發明所述凝膠優選為瓊脂糖凝膠電泳，所述瓊脂糖凝膠電泳進一步優選采用膠濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠。
[0018]作為優選方案，所述標準咖啡品種為印度大粒種、石壟坡、查理小果、查理中果、查理大果、卡蒂姆CIFC7963、CAHM0R P88、CCC24、巴西、卡蒂姆、鐵畢卡、矮卡、喀麥隆、巴布亞新幾內亞小粒種、P3、26號、熱研2號、27號、24號、熱研I號、24-10號、興28、興29、興30、興31、興32、興33和/或興34。
[0019]此外，本發明提供了一套簡單有效的`提取咖啡高質量DNA的方法作為優選方案，如下:
[0020]步驟A、取咖啡半成熟新鮮葉片0.15~0.3g，剪碎后在液氮中研磨成細粉，立即依次加入0.1gPVP粉混勻、Iml氯仿混勻、2ml Extraction buffer、40 μ I終濃度2%的β -巰基乙醇劇烈搖動，混勻；
[0021]步驟B、將混勻后的糊狀物于EP管中離心，只保留沉淀，每管沉淀物加入600 μ Ilysis buffer、12 μ I終濃度2%的β -巰基乙醇，劇烈搖動混勻后65°C下溫育0.5h ；
[0022]步驟C、向管中添加等體積的體積比酚:氯仿:異戊醇為25:24:1的處理液，充分混勻，形成乳狀液后離心，上層水相轉移到一個新的EP管中，加入1/10水相體積的3M乙酸鈉以及水相等體積冷的乙醇，離心棄液相，用70%的乙醇洗滌沉淀物2次，干燥后溶于100 μ ITE中；
[0023]步驟D、加入5 μ I濃度lmg/ml的RNase溶液，37°C水浴30min消解RNA，獲得提取后的DNA，4°C備用。
[0024]本發明選取28種標準咖啡品種為咖啡種質資源材料(見表1)，采用100條RAPD引物分別擴增上述標準咖啡種質資源的DNA，根據上述RAPD引物在28個咖啡種質中PCR擴增譜帶的特異性、多態性以及帶型的易區分程度進行篩選，篩選出在不同咖啡種質間能夠擴增出多態性豐富、帶型清晰而且能夠穩定重復的特征譜帶的RAPD引物；然后，在篩選出的這些引物中選擇能夠擴增出上述咖啡種質間多態性信息含量最高，能夠準確區分所有咖啡種質的引物，并經過優化改造得到如SEQ ID NO: 1-10所示序列的RAPD引物，經RAPDistance軟件檢驗無重合。
[0025]由于實際情況限制，本發明不能窮舉咖啡品種驗證上述引物是否能夠區分所有品種,但是本發明SEQ ID NO: 1-10所示序列的RAPD引物中的任何一條經檢測均可以區分本發明所采用的28個咖啡品種且得到的特征譜帶各不相同，即使所選用的咖啡品種遠遠超出本發明所選28種且使用一條本發明引物不足以區分，那么隨著使用本發明所述引物的數量的增加完全可以區分咖啡品種的，故本發明所述方法可根據實際情況選擇引物的條數。
[0026]表1標準咖啡種質資源表
[0027]
【權利要求】
1.一種鑒定咖啡種質資源的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1、選取標準咖啡品種中的一種或兩種以上，分別進行DNA提取，然后采用SEQ IDNO: 1-10所示序列中的一條或兩條以上的RAH)引物進行PCR擴增，所得擴增產物進行凝膠電泳檢測，根據凝膠電泳圖結果以標準咖啡品種編號和所有標準咖啡品種的條帶存在位點編號為橫、縱坐標，在每一個橫、縱坐標交結處記錄標準咖啡品種條帶的檢測結果，將有擴增條帶的標記為有條帶，無擴增條帶的標記為無條帶，得到標準咖啡品種的RAPD指紋圖譜； 步驟2、提取待測咖啡品種的DNA，采用步驟I相同的RAPD引物進行PCR擴增，將所得到的擴增產物進行凝膠電泳檢測，根據凝膠電泳圖結果以待測咖啡品種編號和步驟I所述所有標準咖啡品種的條帶存在位點編號為橫、縱坐標，在每一個橫、縱坐標交結處記錄待測咖啡品種條帶的檢測結果，將有擴增條帶的標記為有條帶，無擴增條帶的標記為無條帶，得到待測咖啡品種的RAPD指紋圖譜，然后與所述標準咖啡品種的RAPD指紋圖譜進行比對判斷。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述標準咖啡品種為印度大粒種、石壟坡、查理小果、查理中果、查理大果、卡蒂姆CIFC7963、CATIMORP88, CCC24、巴西、卡蒂姆、鐵畢卡、矮卡、嘻麥隆、巴布亞新幾內亞小粒種、P3、26號、熱研2號、27號、24號、熱研I號、24-10號、興28、興29、興30、興31、興32、興33和/或興34。
3.根據權利 要求1所述方法，其特征在于，所述PCR擴增體系為: 反應總體積為20 μ L，其中Mg2+濃度為1.5mmol/L、dNTP濃度為0.3mmo/L、引物濃度為0.4ymol/L、咖啡品種的DNA用量為20ng、Taq DNA聚合酶用量為1.0U、2y L10XPCRbuffer。
4.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述PCR擴增程序為: 94°C預變性3min ； 94°C變性 lmin、38°C復性 lmin45s、72°C延伸 2min，循環 30 次； 72°C 延伸 7min，4°C 保存。
5.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述標記為有條帶為標記為I。
6.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述標記為無條帶為標記為O。
7.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述凝膠電泳為瓊脂糖凝膠電泳。
8.根據權利要求7所述方法，其特征在于，所述瓊脂糖凝膠電泳采用膠濃度為1.5%瓊脂糖凝膠。
9.根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述DNA提取方法如下: 步驟A、取咖啡半成熟新鮮葉片0.15~0.3g，剪碎后在液氮中研磨成細粉，立即依次加入0.1gPVP粉混勻、Iml氯仿混勻、2ml Extraction buffer、40 μ I終濃度2%的β-巰基乙醇劇烈搖動，混勻； 步驟B、將混勻后的糊狀物于EP管中離心，只保留沉淀，每管沉淀物加入600 μ I lysisbuffer、12 μ I終濃度2%的β -巰基乙醇，劇烈搖動混勻后65°C下溫育0.5h ； 步驟C、向管中添加等體積的體積比酚:氯仿:異戊醇為25:24:1的處理液，充分混勻，形成乳狀液后離心，上層水相轉移到一個新的EP管中，加入1/10水相體積的3M乙酸鈉以及水相等體積冷的乙醇，離心棄液相，用70%的乙醇洗滌沉淀物2次，干燥后溶于100 μ I TE中； 步驟D、加入5 μ I濃度lmg/ml的RNase溶液，37°C水浴30min消解RNA，獲得提取后的DNA，4°C 備 用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103740840SQ201410031317
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月22日 優先權日:2014年1月22日
【發明者】黃麗芳, 閆林, 董云萍, 王曉陽, 陳鵬, 顧文亮, 譚樂和, 龍宇宙 申請人:中國熱帶農業科學院香料飲料研究所