本發明屬于植物組織培養和快速繁殖技術領域，具體涉及一種懷集報春苣苔組織培養和快速繁殖方法。
背景技術：
懷集報春苣苔(Primulina huaijiensis Z.L.Ning&J.Wang)，是苦苣苔科報春苣苔屬多年生草本，于2010年發現于廣東省懷集縣一個孤立喀斯特小石灰山洞穴內，2013年正式命名為懷集報春苣苔發表。懷集報春苣苔目前僅有一個野生分布居群，約200株，位于懷集縣一個村莊附近。因其數量稀少，生境極易受到人為干擾破壞，屬珍稀瀕危植物；另外，其花冠上唇裂片具有2膜狀附屬物結構，是目前苦苣苔科植物中唯一具有這一形態特征的物種，該種對于開展報春苣苔屬植物分類學、喀斯特特殊生境植物的起源演化等方面的研究具有重要意義。同時，懷集報春苣苔株型緊湊，葉形優美，葉片肉質并有銀白色脈紋，具有較高的觀賞價值和獨特的耐蔭性，適合作室內盆栽觀賞，極有開發利用前景。
懷集報春苣苔自然條件下不結實，需昆蟲或人工授粉，種子發芽率較低；而扦插繁殖速度慢，繁殖系數低，也會破壞極其珍貴的野生資源。
目前，國內外尚未有懷集報春苣苔的組織培養和種苗繁殖的報道。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種懷集報春苣苔組織培養和快速繁殖方法。
本發明的懷集報春苣苔組織培養和快速繁殖方法，包括以下步驟：
a.外植體的消毒和初代誘導培養：取懷集報春苣苔葉片為外植體，清洗消毒后，將葉片切成0.5～1.0cm×1.0～2.0cm小塊，接種于初代誘導培養基上培養，誘導芽的形成，得到萌發幼芽的愈傷組織；所述的初代誘導培養基為：每升含有6-BA 0.5～1.5mg、NAA 0.05～0.5mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5；
b.芽的誘導和繼代增殖：將萌發幼芽的愈傷組織切割成只帶3～4個芽的小塊，接種于增殖培養基上培養，誘導叢生芽的形成，得到繼代培養苗；所述的增殖培養基為：每升含有6-BA 0.1～0.5mg、NAA 0.05～0.5mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5；
c.壯苗和生根培養：待繼代培養苗長到3～4個葉片時，將繼代培養苗切分出來接種到壯苗培養基上培養壯苗，然后轉入生根培養基上培養，得到生根苗；所述的壯苗培養基為：每升含有活性炭0～2g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5；所述的生根培養基為：每升含有NAA 0.1～0.5mg、活性炭0～2g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為1/2MS培養基，pH為6.5；
d.試管苗移栽：當生根苗長至7-8片葉子時，進行煉苗，然后洗掉生根苗根部培養基，栽入移栽基質中，置于遮陰、濕潤的環境下培養；所述的移栽基質是將泥炭土和珍珠巖按體積比2:1混合均勻得到的；
所述的步驟a、b和c的培養條件均為：溫度25±2℃、光照強度1500lx、光照時間12h/d。
所述的步驟a的清洗消毒，是將葉片用洗潔精漂洗20min，流水沖洗30min，然后在超凈工作臺上用體積分數75％乙醇溶液浸泡30s，質量分數0.1％HgCl2溶液消毒4～5min，用無菌水漂洗5～6次，用無菌濾紙吸干表面水分。
所述的步驟d的煉苗，是把蓋有瓶塞的培養瓶中的生根苗放置于陰棚里培養2-3d，然后打開瓶塞又繼續培養3-4d。
優選，所述的初代誘導培養基為：每升含有6-BA 1.0mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5。
優選，所述的增殖培養基為：每升含有6-BA 0.25mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5。
優選，所述的生根培養基為：每升含有NAA 0.1mg、活性炭2g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為1/2MS培養基，pH為6.5。
所述的MS培養基為國際通用的培養基，其成份和配置方法可參考書籍(譚文澄、戴策剛主編.觀賞植物組織培養技術.北京：中國林業出版社，1991.)，所述的1/2MS是將MS中的大量元素濃度減半，而其他成分濃度不變而形成的培養基。
本發明以懷集報春苣苔肥嫩葉片為外植體，在不定芽的誘導、叢生芽繁殖、壯苗生根和移栽等各階段，選擇適合懷集報春苣苔叢生芽誘導、繁殖、生根、移栽等各培養階段的培養基配方和培養條件，實現懷集報春苣苔種苗的組織培養和快速繁殖，可在較短時間內繁育出大量優質種苗，為滿足該物種的遷地保育與引種回歸研究和資源開發利用提供優質種苗，實現懷集報春苣苔的資源保護和可持續利用。
本發明能成功地進行懷集報春苣苔組織培養和快速繁殖，此發明生產出的懷集報春苣苔種苗具有遺傳穩定性高，出苗快，苗壯，種苗品質好、抗性強、生長良好等特點。本發明方法投入少，產出高等優勢，是利用植物組織細胞的全能性和植物組織培養等生物技術進行喀斯特特殊生境植物優質種苗的快速繁殖，具有操作簡單實惠，切實可行，應用價值高等特點。
具體實施方式
以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
實施例1：
1.外植體的消毒和初代誘導培養：在生長季節剪取懷集報春苣苔肥厚的嫩葉片為外植體，用洗潔精漂洗20min，流水沖洗30min，然后在超凈工作臺上用體積分數75％乙醇溶液浸泡30s，質量分數0.1％HgCl2溶液消毒4min，用無菌水漂洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分后，將葉片切成1.0cm×2.0cm小塊，接種于初代誘導培養基上培養，培養溫度25±2℃，光照強度1500lx，光照時間12h/d。培養30d左右切塊周圍開始長愈傷組織并有少許芽萌發。繼續培養38d左右愈傷組織上萌發很多幼芽。消毒成功率85％。所述的初代誘導培養基為：每升含有6-BA 0.5mg、NAA 0.05mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5。
2.芽的誘導和繼代增殖：將大量萌發幼芽的愈傷組織切割成只帶3～4個芽的小塊，接種于增殖培養基上培養，能促使叢生芽的形成，培養溫度25±2℃，光照強度1500lx，光照時間12h/d。繼代周期為35d，增殖系數為3.8，由此得到繼代培養苗。所述的增殖培養基為：每升含有6-BA 0.1mg、NAA 0.05mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5。
3.壯苗和生根培養：待繼代培養苗長到3～4個葉片時，將幼苗切分出來接種到壯苗培養基上培養40d，然后轉入生根培養基上培養30d；培養溫度25±2℃，光照強度1500lx，光照時間12h/d。幼苗生長健壯，產生大量根，生根率高達97％，由此得到生根苗。所述的壯苗培養基為：每升含有活性炭2.0g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5。所述的生根培養基為：每升含有NAA 0.1mg、活性炭2.0g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為1/2MS培養基，pH為6.5。
4.試管苗移栽：當生根苗長至7-8片葉子時，把蓋有瓶塞的培養瓶中的生根苗放置于陰棚里2-3d，然后打開瓶塞又繼續放3-4d后，用鑷子把生根苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，栽入泥炭土:珍珠巖＝2：1(v/v)的基質中，注意澆水、遮蔭、保溫和保濕，成活率可達92％。
實施例2：
1.外植體的消毒和初代誘導培養：在生長季節剪取懷集報春苣苔肥厚的嫩葉片為外植體，用洗潔精漂洗20min，流水沖洗30min，然后在超凈工作臺上用體積分數75％乙醇溶液浸泡30s，質量分數0.1％HgCl2溶液消毒5min，用無菌水漂洗6次，用無菌濾紙吸干表面水分后，將葉片切成0.5cm×1.0cm小塊，接種于初代誘導培養基上培養，培養溫度25±2℃，光照強度1500lx，光照時間12h/d。培養19d左右切塊周圍開始長愈傷組織并有少許芽萌發。繼續培養27d左右愈傷組織上萌發大量幼芽。消毒成功率85％。所述的初代誘導培養基為：每升含有6-BA 1.0mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5。
2.芽的誘導和繼代增殖：將大量萌發幼芽的愈傷組織切割成只帶3～4個芽的小塊，接種于增殖培養基上培養，能促使叢生芽的形成，培養溫度25±2℃，光照強度1500lx，光照時間12h/d。繼代周期為35d，增殖系數為6，由此得到繼代培養苗。所述的增殖培養基為：每升含有6-BA 0.25mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5。
3.壯苗和生根培養：待繼代培養苗長到3～4個葉片時，將幼苗切分出來接種到壯苗培養基上培養40d，然后轉入生根培養基上培養30d；培養溫度25±2℃，光照強度1500lx，光照時間12h/d。幼苗生長健壯，產生大量根，生根率達94％，由此得到生根苗。所述的壯苗培養基為：每升含有活性炭2.0g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5。所述的生根培養基為：每升含有NAA 0.5mg、活性炭2.0g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為1/2MS培養基，pH為6.5。
4.試管苗移栽：當生根苗長至7-8片葉子時，把蓋有瓶塞的培養瓶中的生根苗放置于陰棚里2-3d，然后打開瓶塞又繼續放3-4d后，用鑷子把生根苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，栽入泥炭土:珍珠巖＝2：1(v/v)的基質中，注意澆水、遮蔭、保溫和保濕，成活率可達92％。
實施例3：
1.外植體的消毒和初代誘導培養：在生長季節剪取懷集報春苣苔肥厚的嫩葉片為外植體，用洗潔精漂洗20min，流水沖洗30min，然后在超凈工作臺上用體積分數75％乙醇溶液浸泡30s，質量分數0.1％HgCl2溶液消毒4min，用無菌水漂洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分后，將葉片切成1.0cm×2.0cm小塊，接種于初代誘導培養基上培養，培養溫度25±2℃，光照強度1500lx，光照時間12h/d。培養22d左右切塊周圍開始長愈傷組織并有少許芽萌發。繼續培養30d左右愈傷組織上萌發很多細小幼芽。消毒成功率85％。所述的初代誘導培養基：每升含有6-BA 1.5mg、NAA 0.5mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5。
2.芽的誘導和繼代增殖：將大量萌發幼芽的愈傷組織切割成只帶3～4個芽的小塊，接種于增殖培養基上培養，能促使叢生芽的形成，培養溫度25±2℃，光照強度1500lx，光照時間12h/d。繼代周期為35d,增殖系數為3.1，由此得到繼代培養苗。所述的增殖培養基：每升含有6-BA 0.5mg、NAA 0.5mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5。
3.壯苗和生根培養：待繼代培養苗長到3～4個葉片時，將幼苗切分出來接種到壯苗培養基上培養40d，然后轉入生根培養基上培養30d；培養溫度25±2℃，光照強度1500lx，光照時間12h/d。幼苗生長弱小，產生大量根，生根率達91％，由此得到生根苗。所述的壯苗培養基為：每升含有蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5。所述的生根培養基為：每升含有NAA 0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為1/2MS培養基，pH為6.5。
4.試管苗移栽：當生根苗長至7-8片葉子時，把蓋有瓶塞的培養瓶中的生根苗放置于陰棚里2-3d，然后打開瓶塞又繼續放3-4d后，用鑷子把生根苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，栽入泥炭土:珍珠巖＝2：1(v/v)的基質中，注意澆水、遮蔭、保溫和保濕，成活率可達92％。
以上的三個實施例均能實現較好的懷集報春苣苔組織培養和快速繁殖效果。通過以上三個實施例可以得出，懷集報春苣苔外植體最適的初代誘導培養基為：每升含有6-BA 1.0mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5；最適的增殖培養基為：每升含有6-BA 0.25mg、NAA 0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為MS培養基，pH為6.5；最適的生根培養基為：每升含有NAA 0.1mg、活性炭2g、蔗糖30g、瓊脂6g，余量為1/2MS培養基，pH為6.5；其中活性炭對于壯苗和生根起到很大作用。