本發明屬于植物細胞工程技術領域，涉及一種植物的繁殖方法，尤其是一種珠芽類魔芋組織培養快繁方法。
背景技術：
魔芋是天南星科（Araceae）魔芋屬（Amorphophallus）多年生草本植物，是迄今發現的唯一能大量合成葡甘聚糖（konjac glucomannan,KGM）的植物種群，主要分布在亞洲和非洲的熱帶及亞熱帶地區，僅少數亞洲國家有栽培，中國、日本較普遍。它是我國西南地區重要的特色經濟作物，已有兩千多年的栽培和食用歷史，其主要成分葡甘聚糖是優異的純天然膳食纖維，具極高的經濟價值，已在食品、保健品、醫藥、化工、石油、紡織等領域得到廣泛應用，帶動了一大批相關產業的發展，其開發利用已顯現出經濟效益高、社會效益明顯、生態效益好的優勢。隨著市場需求急劇增加，魔芋種植業得到了迅猛發展，現已成為西南山區農民脫貧致富的一條重要途徑。
珠芽類魔芋是一類繁殖方式獨特的野生馴化魔芋種，因其地上植株會產生無性繁殖的“珠芽”小球莖而得名，這樣就顯著增加了珠芽魔芋的繁殖系數，是一種獨特的魔芋種質資源，目前珠芽類魔芋品種：“紅魔芋”在云南德宏州、西雙版納州及附近地區有大量種植。而金魔芋是在云南西雙版納州熱帶雨林中新發現的一個特有珠芽魔芋類品種，其葡甘聚糖含量遠高于花魔芋、白魔芋及其它珠芽類魔芋品種如紅魔芋等，具有很好的加工價值，并高抗魔芋軟腐病和白絹病等魔芋生產中的主要病害，是不可多得的種質資源。
但目前在金魔芋栽培中還是存在用種量大，種球繁殖系數較低，且切塊繁殖易于傳播魔芋病害，種子量少、變異較低的缺點，隨著魔芋產業的發展，十分迫切需要大量的優質魔芋種苗。雖然在實驗室條件下，已經有通過組織培養繁殖珠芽魔芋（指紅魔芋品種）的繁育方法，但尚未有對金魔芋品種組織快繁技術的相關研究。并且，上述方法存在對珠芽魔芋（紅魔芋）快繁需要進行生根、煉苗、移栽等多步程序，并且存在獲得珠芽魔芋種球的周期長，生長慢、不耐儲藏和運輸的問題。
技術實現要素：
本發明的目的在于克服現有技術之不足，而提供一種珠芽類魔芋組織培養快繁方法。
為達到上述目的，本發明的技術方案是：一種關于珠芽魔芋組織培養的繁殖方法，包括無菌苗培養、胚狀體誘導、種球誘導、種球成熟培養步驟：
1)無菌苗培養：將珠芽類魔芋植株的幼嫩葉片、葉柄以及叢生芽常規滅菌后，將葉片切成0.5-1.0cm2，葉柄切成0.8-1cm長，接種到常規滅菌的苗培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，得到脫毒無菌苗；苗培養基組分及配比為：MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA+活性炭0-3.0g/L，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2；
2)胚狀體誘導：將步驟1)獲得的脫毒無菌苗，取葉片切成0.5-1.0cm2，葉柄切成0.8-1.0cm，接到常規滅菌的胚狀體誘導培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，獲得珠芽類魔芋胚狀體；胚狀體誘導培養基組分及配比為：MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.1mg/L IAA+0.1-0.2mg/L ABA+30g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2，或MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2；
3)種球誘導：將未產生新芽之前的珠芽類魔芋胚狀體，轉移至常規滅菌的誘導培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，得到珠芽類魔芋幼小種球；種球誘導培養基的組分及配比為：MS基本培養基+0.1mg/L NAA +3.0g/L活性炭+15g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2；
4)種球成熟培養：將步驟3)得到的珠芽類魔芋幼小種球轉移至常規滅菌的種球成熟培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，當珠芽類魔芋種球上端中間有芽點，直徑大小為5mm以上，種球的外觀顏色略帶褐色時得到成熟分離的珠芽類魔芋種球；種球成熟培養基組分及其配比為：MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.2-1.0mg/LABA或30-50g/L聚乙二醇，蔗糖30-50g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2。
采用上述技術方案時，1.本發明的珠芽類魔芋人工種球培養至成熟僅需65-85天，生命力與抗逆性強，含水量降至65-78％時即耐貯藏，不需要經過特殊馴化就能直接用于播種，適合工廠規模化常年生產。
2.本發明的珠芽類魔芋人工種球單粒直徑更大，發育更成熟，萌發率高達95％。
3.本發明的珠芽類魔芋有性繁殖系數高、繁殖周期短、品質不易退化、組培苗移栽程序簡單、離體塊莖不易感病、易萌發，為工廠化快速生產珠芽類魔芋種球提供了實用技術。
進一步改進，所述滅菌是在121-126℃下濕熱蒸汽滅菌30min。蒸汽滅菌能夠有效提高培養過程中的成活率和萌發率，有助于培養繁殖。
進一步改進，將成熟分離的珠芽類魔芋種球直接播種于基質上，所述基質為泥炭與珍珠巖按重量比2:1的比例配置，置于半陰生長環境條件，溫度18～30℃，萌發成苗率達95％。
進一步改進，所述4)球成熟培養中，將培養基固定包裹在可降解的塑料袋中。通過包裹在塑料袋中，能夠鎖住營養物質，有助于培養。并且可降解的塑料袋提供一個相對封閉的環境，比較受到環境的影響。再者可降解的塑料袋降解能夠自然進行，無需進行特殊的處理。
進一步改進，所述培養基放置在搖床上振蕩培養。進行振蕩培養能夠模擬繁殖的環境，并且有助于整體的效果提升。
在MS基本培養基中，同時添加6-BA和PIC。加6-BA，PIC和水解酪蛋白，不需添加香其它復雜有機物，且不需光照節省了能源。之后將原培養基轉到光下，原球莖就能發育生苗。
以MS基本培養基為基礎，添加2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）3mg/L，6-芐基腺嘌呤（6-BA）2mg/L。
本發明通過組培技術，改變外植體的誘導發育、生長途徑，通過添加相應的生長調節物質，引導生長發育途徑由器官發生途徑轉向胚狀體發生途徑，直接通過離體培養獲得大量成熟的珠芽魔芋（包括金魔芋和其它珠芽類魔芋品種，如紅魔芋）種球，用于播種進一步生長膨大，來收獲并提高珠芽魔芋產量。
具體實施方式
實施例1：
一種關于珠芽魔芋組織培養的繁殖方法，包括無菌苗培養、胚狀體誘導、種球誘導、種球成熟培養步驟：
1)無菌苗培養：將珠芽類魔芋植株的幼嫩葉片、葉柄以及叢生芽常規滅菌后，將葉片切成0.5-1.0cm2，葉柄切成0.8-1cm長，接種到常規滅菌的苗培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，得到脫毒無菌苗；苗培養基組分及配比為：MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA+活性炭0-3.0g/L，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2；
2)胚狀體誘導：將步驟1)獲得的脫毒無菌苗，取葉片切成0.5-1.0cm2，葉柄切成0.8-1.0cm，接到常規滅菌的胚狀體誘導培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，獲得珠芽類魔芋胚狀體；胚狀體誘導培養基組分及配比為：MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.1mg/L IAA+0.1-0.2mg/L ABA+30g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2，或MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2；
3)種球誘導：將未產生新芽之前的珠芽類魔芋胚狀體，轉移至常規滅菌的誘導培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，得到珠芽類魔芋幼小種球；種球誘導培養基的組分及配比為：MS基本培養基+0.1mg/L NAA +3.0g/L活性炭+15g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2；
4)種球成熟培養：將步驟3)得到的珠芽類魔芋幼小種球轉移至常規滅菌的種球成熟培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，當珠芽類魔芋種球上端中間有芽點，直徑大小為5mm以上，種球的外觀顏色略帶褐色時得到成熟分離的珠芽類魔芋種球；種球成熟培養基組分及其配比為：MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.2-1.0mg/LABA或30-50g/L聚乙二醇，蔗糖30-50g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2。在球成熟培養中，將培養基固定包裹在可降解的塑料袋中。通過包裹在塑料袋中，能夠鎖住營養物質，有助于培養。并且可降解的塑料袋提供一個相對封閉的環境，比較受到環境的影響。再者可降解的塑料袋降解能夠自然進行，無需進行特殊的處理。
滅菌是在121-126℃下濕熱蒸汽滅菌30min。蒸汽滅菌能夠有效提高培養過程中的成活率和萌發率，有助于培養繁殖。
將成熟分離的珠芽類魔芋種球直接播種于基質上，所述基質為泥炭與珍珠巖按重量比2:1的比例配置，置于半陰生長環境條件，溫度18～30℃，萌發成苗率達95％。
1.本發明的珠芽類魔芋人工種球培養至成熟僅需65-85天，生命力與抗逆性強，含水量降至65-78％時即耐貯藏，不需要經過特殊馴化就能直接用于播種，適合工廠規模化常年生產。
2.本發明的珠芽類魔芋人工種球單粒直徑更大，發育更成熟，萌發率高達95％。
3.本發明的珠芽類魔芋有性繁殖系數高、繁殖周期短、品質不易退化、組培苗移栽程序簡單、離體塊莖不易感病、易萌發，為工廠化快速生產珠芽類魔芋種球提供了實用技術。
培養基放置在搖床上振蕩培養。進行振蕩培養能夠模擬繁殖的環境，并且有助于整體的效果提升。
實施例2：
一種關于珠芽魔芋組織培養的繁殖方法，包括無菌苗培養、胚狀體誘導、種球誘導、種球成熟培養步驟：
1)無菌苗培養：將珠芽類魔芋植株的幼嫩葉片、葉柄以及叢生芽常規滅菌后，將葉片切成0.5-1.0cm2，葉柄切成0.8-1cm長，接種到常規滅菌的苗培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，得到脫毒無菌苗；苗培養基組分及配比為：MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA+活性炭0-3.0g/L，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2；
2)胚狀體誘導：將步驟1)獲得的脫毒無菌苗，取葉片切成0.5-1.0cm2，葉柄切成0.8-1.0cm，接到常規滅菌的胚狀體誘導培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，獲得珠芽類魔芋胚狀體；胚狀體誘導培養基組分及配比為：MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.1mg/L IAA+0.1-0.2mg/L ABA+30g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2，或MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2；
3)種球誘導：將未產生新芽之前的珠芽類魔芋胚狀體，轉移至常規滅菌的誘導培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，得到珠芽類魔芋幼小種球；種球誘導培養基的組分及配比為：MS基本培養基+0.1mg/L NAA +3.0g/L活性炭+15g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2；
4)種球成熟培養：將步驟3)得到的珠芽類魔芋幼小種球轉移至常規滅菌的種球成熟培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，當珠芽類魔芋種球上端中間有芽點，直徑大小為5mm以上，種球的外觀顏色略帶褐色時得到成熟分離的珠芽類魔芋種球；種球成熟培養基組分及其配比為：MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.2-1.0mg/LABA或30-50g/L聚乙二醇，蔗糖30-50g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2。在球成熟培養中，將培養基固定包裹在可降解的塑料袋中。通過包裹在塑料袋中，能夠鎖住營養物質，有助于培養。并且可降解的塑料袋提供一個相對封閉的環境，比較受到環境的影響。再者可降解的塑料袋降解能夠自然進行，無需進行特殊的處理。
滅菌是在121-126℃下濕熱蒸汽滅菌30min。蒸汽滅菌能夠有效提高培養過程中的成活率和萌發率，有助于培養繁殖。
將成熟分離的珠芽類魔芋種球直接播種于基質上，所述基質為泥炭與珍珠巖按重量比2:1的比例配置，置于半陰生長環境條件，溫度18～30℃，萌發成苗率達95％。
在MS基本培養基中，同時添加6-BA和PIC。加6-BA，PIC和水解酪蛋白，不需添加香其它復雜有機物，且不需光照節省了能源。之后將原培養基轉到光下，原球莖就能發育生苗。
1.本發明的珠芽類魔芋人工種球培養至成熟僅需65-85天，生命力與抗逆性強，含水量降至65-78％時即耐貯藏，不需要經過特殊馴化就能直接用于播種，適合工廠規模化常年生產。
2.本發明的珠芽類魔芋人工種球單粒直徑更大，發育更成熟，萌發率高達95％。
3.本發明的珠芽類魔芋有性繁殖系數高、繁殖周期短、品質不易退化、組培苗移栽程序簡單、離體塊莖不易感病、易萌發，為工廠化快速生產珠芽類魔芋種球提供了實用技術。
培養基放置在搖床上振蕩培養。進行振蕩培養能夠模擬繁殖的環境，并且有助于整體的效果提升。
實施例3：
一種關于珠芽魔芋組織培養的繁殖方法，包括無菌苗培養、胚狀體誘導、種球誘導、種球成熟培養步驟：
1)無菌苗培養：將珠芽類魔芋植株的幼嫩葉片、葉柄以及叢生芽常規滅菌后，將葉片切成0.5-1.0cm2，葉柄切成0.8-1cm長，接種到常規滅菌的苗培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，得到脫毒無菌苗；苗培養基組分及配比為：MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA+活性炭0-3.0g/L，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2；
2)胚狀體誘導：將步驟1)獲得的脫毒無菌苗，取葉片切成0.5-1.0cm2，葉柄切成0.8-1.0cm，接到常規滅菌的胚狀體誘導培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，獲得珠芽類魔芋胚狀體；胚狀體誘導培養基組分及配比為：MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.1mg/L IAA+0.1-0.2mg/L ABA+30g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2，或MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2；
3)種球誘導：將未產生新芽之前的珠芽類魔芋胚狀體，轉移至常規滅菌的誘導培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，得到珠芽類魔芋幼小種球；種球誘導培養基的組分及配比為：MS基本培養基+0.1mg/L NAA +3.0g/L活性炭+15g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2；
4)種球成熟培養：將步驟3)得到的珠芽類魔芋幼小種球轉移至常規滅菌的種球成熟培養基上，在2000lux光下培養，11h/d，培養溫度28±1℃，當珠芽類魔芋種球上端中間有芽點，直徑大小為5mm以上，種球的外觀顏色略帶褐色時得到成熟分離的珠芽類魔芋種球；種球成熟培養基組分及其配比為：MS基本培養基+0.2mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA +0.2-1.0mg/LABA或30-50g/L聚乙二醇，蔗糖30-50g/L，瓊脂6-8g/L，調pH至5.8-6.2。在球成熟培養中，將培養基固定包裹在可降解的塑料袋中。通過包裹在塑料袋中，能夠鎖住營養物質，有助于培養。并且可降解的塑料袋提供一個相對封閉的環境，比較受到環境的影響。再者可降解的塑料袋降解能夠自然進行，無需進行特殊的處理。
滅菌是在121-126℃下濕熱蒸汽滅菌30min。蒸汽滅菌能夠有效提高培養過程中的成活率和萌發率，有助于培養繁殖。
將成熟分離的珠芽類魔芋種球直接播種于基質上，所述基質為泥炭與珍珠巖按重量比2:1的比例配置，置于半陰生長環境條件，溫度18～30℃，萌發成苗率達95％。
以MS基本培養基為基礎，添加2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）3mg/L，6-芐基腺嘌呤（6-BA）2mg/L。
1.本發明的珠芽類魔芋人工種球培養至成熟僅需65-85天，生命力與抗逆性強，含水量降至65-78％時即耐貯藏，不需要經過特殊馴化就能直接用于播種，適合工廠規模化常年生產。
2.本發明的珠芽類魔芋人工種球單粒直徑更大，發育更成熟，萌發率高達95％。
3.本發明的珠芽類魔芋有性繁殖系數高、繁殖周期短、品質不易退化、組培苗移栽程序簡單、離體塊莖不易感病、易萌發，為工廠化快速生產珠芽類魔芋種球提供了實用技術。
培養基放置在搖床上振蕩培養。進行振蕩培養能夠模擬繁殖的環境，并且有助于整體的效果提升。
以上所述的僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本領域的技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以作出若干變形和改進，這些也應該視為本發明的保護范圍，這些都不會影響本發明實施的效果和專利的實用性。本發明所省略描述的技術、形狀、構造部分均為公知技術。