本發明涉及一種組織培養快速繁殖方法，具體涉及一種杜鵑花組織培養快速繁殖方法。

背景技術：

杜鵑花的組織培養快速繁殖過程包括：外植體的選擇、消毒、叢生苗誘導、繼代培養、生根培養及試管苗移栽。一般情況下，杜鵑花的組織培養選擇當年生的幼嫩莖段、莖尖、花蕾或者葉片作為外植體；外植體的消毒劑一般選擇中性洗滌劑、升汞、酒精及NaClO等，各個消毒劑的消毒時間要控制在一個適當的時間才能達到較好的消毒效果。如專利CN201010240170公開了一種大白杜鵑組培快速繁殖方法，采用組織培養技術對種子胚的子葉和胚軸進行愈傷組織誘導繼而形成叢生芽而后分化成完整植株的一種快速繁殖方法。該專利需要生根培養和試管苗移植兩個過程。

現有技術存在以下缺點：

(1)組織培養繁殖所需成本高并且技術要求也高，怎么縮短組織培養繁殖時間從而節省成本，并有效提高組培苗的煉苗馴化成活率成為組培繁殖的關鍵。

(2)花蕾的分化較為困難，周期長；莖尖的取材受到一定時間的限制，一般采用莖節或者葉片作為初代培養的外植體，但是杜鵑花的枝葉上有腺毛，且黏性大，會沾有很多污物和細菌，不易消毒殺菌，但如果消毒劑過量使用又會導致枝葉的枯萎。

(3)升汞時間處理過長容易造成外植體材料的褐變死亡，處理過短消毒不徹底，控制升汞處理的時間成為一個難題。

(4)杜鵑花在幼芽培養中激素的種類及用量不容易控制。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種杜鵑花組織培養快速繁殖方法，該方法簡化了杜鵑花組織培養的步驟，節約了組培成本，提高了瓶外生根率和組培苗的煉苗馴化成活率。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：一種杜鵑花組織培養快速繁殖方法，包括以下步驟：

(1)杜鵑花無菌播種苗獲取：選取杜鵑種子，經赤霉素處理后再用含有吐溫80的酒精浸泡，接著用升汞和次氯酸鈉消毒，再用無菌水沖洗，獲得消毒過的杜鵑種子，將消毒過的杜鵑種子接種到1/2Read培養基上無菌培養，獲得杜鵑花無菌播種苗；

(2)叢生苗誘導：將步驟(1)中獲得的杜鵑花無菌播種苗去根后接種到含有玉米素ZT的Read培養基上進行叢生苗誘導，獲得大量的組培苗；

(3)組培苗瓶外生根：選取栽培基質，剪取步驟(2)中獲得的組培苗的莖部，扦插于栽培基質中進行瓶外生根，并控制濕度、溫度和光照，待組培苗生根后再進行育苗即可。

在上述杜鵑花組織培養快速繁殖方法中：

步驟(1)中赤霉素的濃度為140～160mg/L，更佳為150mg/L，赤霉素處理時間優選為7～9h，更佳為8h。

步驟(1)中酒精的體積百分含量為70～75％，更佳為75％，吐溫80的用量優選為酒精總體積的0.8～1.2％，更佳為1.0％，優選用含有吐溫80的酒精浸泡4～6min，更佳為5min。

步驟(1)中升汞的質量百分含量優選為0.1～0.14％，更佳為0.1％，消毒時間優選為6～8min，更佳為7min，NaClO的質量百分含量優選為8～12％，更佳為10％，消毒時間優選為8～10min，更佳為9min。

步驟(1)中將消毒過的杜鵑種子接種到1/2Read培養基上無菌培養，25～35天后獲得杜鵑花無菌播種苗，更佳為30天后獲得杜鵑花無菌播種苗。

步驟(2)中玉米素ZT(zeatin)的用量優選為1L Read培養基中含有0.8～1.2mg，更佳為1.0mg。

步驟(2)中將步驟(1)中獲得的杜鵑花無菌播種苗去根后接種到含有玉米素ZT的Read培養基上進行叢生苗誘導28～32天后，更佳為30天，獲得大量的組培苗。

步驟(3)中所述的栽培基質為泥炭土和蛭石，二者的體積比為1～2:1；所述泥炭土和蛭石使用前先經18目篩過篩處理和高壓蒸汽滅菌處理，滅菌的溫度為121℃，滅菌時間為1.5～2.5h，更佳為2h。

步驟(3)中剪取步驟(2)中獲得的組培苗的莖部前，所述組培苗先從培養室中移出，并逐漸打開組培瓶的蓋子，使組培苗適應外界光照和溫度條件，并保持空氣濕度為80～85％，經6～8天(更佳為7天)后再剪取組培苗的莖部進行瓶外生根。

步驟(3)中剪取步驟(2)中獲得的組培苗，洗去培養基，并去掉組培苗莖段下部的葉片，扦插于栽培基質中進行瓶外生根，用透明的塑料薄膜覆蓋保持濕度和溫度，并遮蔭培養，14～16天(更佳為15天)后去掉薄膜，保持濕度為80～85％，待組培苗生根后移植到育苗盤上育苗即可。

本發明具有以下優點：

(1)本發明方法取代了傳統上的生根培養和試管苗移植兩個過程，只需進行瓶外生根過程，簡化了杜鵑花組織培養的步驟，節約了組培成本，同時，本發明的瓶外生根率可達90％，并進一步大大提高了組培苗的煉苗馴化成活率；

(2)本發明方法以種子為材料獲得無菌播種苗，以無菌苗為外植體，組培材料不僅容易獲取，而且容易消毒；

(3)本發明方法采用升汞和NaClO消毒，不僅保障種子污染率低，又保障了種子的萌發率；

(4)本發明方法中組培苗(叢生苗)誘導培養基選擇Read基本培養基，并添加激素ZT，可使叢生苗密而壯；

(5)本發明方法中瓶外栽培基質(生根基質)用18目的篩子過篩，以便利于根系附著，這大大提高了組培苗瓶外生根率；

(6)本發明方法也可適用于杜鵑花雜交種子試管發芽中，提高杜鵑花新品種育苗。

附圖說明

圖1是采用實施例1中杜鵑花組織培養快速繁殖方法培育獲得的杜鵑花無菌播種苗；

圖2是采用實施例1中杜鵑花組織培養快速繁殖方法培育獲得的杜鵑花組培苗(瓶外生根)。

具體實施方式

實施例1

本實施例提供的杜鵑花組織培養快速繁殖方法，包括以下步驟：

(1)獲得杜鵑花無菌播種苗，將杜鵑種子用150mg/L的赤霉素處理8個小時后用75％(體積百分含量)的酒精(每100mL酒精中添加1mL已滅菌的吐溫80)浸泡5min，之后在超凈工作臺上用0.1％(質量百分含量)的升汞消毒7min，再用10％(質量百分含量)的NaClO消毒9min，最后用無菌水沖洗4～5遍，用已滅菌的鑷子將消過毒的杜鵑種子接種到不含任何激素的1/2Read培養基上無菌培養大約30天后獲得無菌苗，如圖1所示；

(2)獲得大量的無菌叢生苗，將上述無菌播種苗去根后接種到Read+ZT1.0mg/L培養基上進行叢生苗誘導，玉米素ZT的用量為1L Read培養基中含有0.8～1.2mg，1個月后獲得大量的無菌組培苗；

(3)組培苗的瓶外生根，從培養室里移出組培苗使得組培苗適應外界光照條件及溫度一段時間，7天之后將培養瓶的蓋子松開并每天逐漸打開，保持培養苗的空氣濕度為85％，經過7天之后開始移栽進行組培苗瓶外生根，將進口泥炭和蛭石用18目的篩子過篩作為栽培基質，泥炭土與蛭石按體積1∶1混合后并在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌2小時后待用，作為無菌苗瓶外生根的培養基質，剪取叢生苗，洗去培養基，并去掉莖段下部的葉片，扦插于培養基質中，用透明的塑料薄膜覆蓋保持濕度和溫度，并適當的遮蔭培養。15天后去掉薄膜，并每天霧噴保持一定的濕度(保持濕度為80～85％，)，待組培苗生根后可移植到育苗盤上育苗。

步驟(2)中Read培養基成分含量如表1所示。

表1Read培養基成分含量

步驟(1)中的1/2Read培養基，其大量元素為Read培養基大量元素的一半，其他成分與Read培養基含量相同。

培養獲得的組培苗如圖2所示，從圖2中可以看出組培苗的瓶外生根效果好，因此使用本發明中的瓶外生根方法不僅縮短了組培繁殖的時間，還大大提高了組培苗瓶外生根率和煉苗成活率。

實施例2

本實施例提供的杜鵑花組織培養快速繁殖方法，包括以下步驟：

(1)杜鵑花無菌播種苗獲取：選取杜鵑種子，經赤霉素處理后再用含有吐溫80的酒精浸泡，接著用升汞和次氯酸鈉消毒，再用無菌水沖洗，獲得消毒過的杜鵑種子，將消毒過的杜鵑種子接種到1/2Read培養基上無菌培養，獲得杜鵑花無菌播種苗；

(2)叢生苗誘導：將步驟(1)中獲得的杜鵑花無菌播種苗去根后接種到含有玉米素ZT的Read培養基上進行叢生苗誘導，獲得大量的組培苗；

(3)組培苗瓶外生根：選取栽培基質，剪取步驟(2)中獲得的組培苗的莖部，扦插于栽培基質中進行瓶外生根，并控制濕度、溫度和光照，待組培苗生根后再進行育苗即可。

步驟(1)中赤霉素的濃度為140mg/L，赤霉素處理時間為9h。

步驟(1)中酒精的體積百分含量為70％，吐溫80的用量為酒精總體積的0.8％，用含有吐溫80的酒精浸泡6min。

步驟(1)中升汞的質量百分含量為0.12％，消毒時間為8min，NaClO的質量百分含量為8％，消毒時間為10min。

步驟(1)中將消毒過的杜鵑種子接種到1/2Read培養基上無菌培養，35天后獲得杜鵑花無菌播種苗。

步驟(2)中玉米素ZT的用量為1L Read培養基中含有0.8mg。

步驟(2)中將步驟(1)中獲得的杜鵑花無菌播種苗去根后接種到含有玉米素ZT的Read培養基上進行叢生苗誘導28天后，獲得大量的組培苗。

步驟(3)中所述的栽培基質為泥炭土和蛭石，二者的體積比為1.5：1，泥炭土和蛭石使用前先經18目篩過篩處理和高壓蒸汽滅菌處理，滅菌的溫度為121℃，滅菌時間為1.5h。

步驟(3)中剪取步驟(2)中獲得的組培苗的莖部前，所述組培苗先從培養室中移出，并逐漸打開組培瓶的蓋子，使組培苗適應外界光照和溫度條件，并保持空氣濕度為80％，經8天后再剪取組培苗的莖部進行瓶外生根。

步驟(3)中剪取步驟(2)中獲得的組培苗，洗去培養基，并去掉組培苗莖段下部的葉片，扦插于栽培基質中進行瓶外生根，用透明的塑料薄膜覆蓋保持濕度和溫度，并遮蔭培養，14天后去掉薄膜，保持濕度為85％，待組培苗生根后移植到育苗盤上育苗即可。

實施例3

本實施例提供的杜鵑花組織培養快速繁殖方法，包括以下步驟：

(1)杜鵑花無菌播種苗獲取：選取杜鵑種子，經赤霉素處理后再用含有吐溫80的酒精浸泡，接著用升汞和次氯酸鈉消毒，再用無菌水沖洗，獲得消毒過的杜鵑種子，將消毒過的杜鵑種子接種到1/2Read培養基上無菌培養，獲得杜鵑花無菌播種苗；

(2)叢生苗誘導：將步驟(1)中獲得的杜鵑花無菌播種苗去根后接種到含有玉米素ZT的Read培養基上進行叢生苗誘導，獲得大量的組培苗；

(3)組培苗瓶外生根：選取栽培基質，剪取步驟(2)中獲得的組培苗的莖部，扦插于栽培基質中進行瓶外生根，并控制濕度、溫度和光照，待組培苗生根后再進行育苗即可。

步驟(1)中赤霉素的濃度為160mg/L，赤霉素處理時間為7h。

步驟(1)中酒精的體積百分含量為72％，吐溫80的用量為酒精總體積的1.2％，用含有吐溫80的酒精浸泡4min。

步驟(1)中升汞的質量百分含量為0.14％，消毒時間為6min，NaClO的質量百分含量為12％，消毒時間為8min。

步驟(1)中將消毒過的杜鵑種子接種到1/2Read培養基上無菌培養，25天后獲得杜鵑花無菌播種苗。

步驟(2)中玉米素ZT的用量為1L Read培養基中含有1.2mg。

步驟(2)中將步驟(1)中獲得的杜鵑花無菌播種苗去根后接種到含有玉米素ZT的Read培養基上進行叢生苗誘導32天后，獲得大量的組培苗。

步驟(3)中所述的栽培基質為泥炭土和蛭石，二者的體積比為2：1，泥炭土和蛭石使用前先經18目篩過篩處理和高壓蒸汽滅菌處理，滅菌的溫度為121℃，滅菌時間為2.5h。

步驟(3)中剪取步驟(2)中獲得的組培苗的莖部前，所述組培苗先從培養室中移出，并逐漸打開組培瓶的蓋子，使組培苗適應外界光照和溫度條件，并保持空氣濕度為82％，經6天后再剪取組培苗的莖部進行瓶外生根。

步驟(3)中剪取步驟(2)中獲得的組培苗，洗去培養基，并去掉組培苗莖段下部的葉片，扦插于栽培基質中進行瓶外生根，用透明的塑料薄膜覆蓋保持濕度和溫度，并遮蔭培養，16天后去掉薄膜，保持濕度為82％，待組培苗生根后移植到育苗盤上育苗即可。

雖然本發明已以實施例公開如上，但其并非用以限定本發明的保護范圍，任何熟悉該技術的技術人員，在不脫離本發明的構思和范圍內所作的更改與潤飾，均應屬于本發明的保護范圍。