本發明涉及植物組織培養技術領域，具體而言，本發明涉及一種亨利兜蘭組織培養快速繁殖的方法、一種適于亨利兜蘭組織培養快速繁殖的培養基體系以及一種確定亨利兜蘭果莢最佳采集期的方法。

背景技術：

兜蘭屬(Paphiopedilum)是蘭科觀賞價值最高的屬之一，是繼蝴蝶蘭、大花蕙蘭、文心蘭之后的一個新興蘭花。近年來在各類花展中，兜蘭屬花卉頻繁出現并多次獲得大獎。兜蘭在花卉市場上作為高檔盆花也為越來越多的人所喜愛。兜蘭原生種主要分布于西南和南部的熱帶與亞熱帶地區，以云南、廣西和貴州分布最多。

亨利兜蘭(Paphiopedilum henryanum)原產我國廣西、貴州等地，葉片翠綠，花可愛秀美，觀賞價值高。由于近年來日益惡劣的生態環境、自身特殊的生物學特性以及人們的過度性采挖，野生亨利兜蘭已經難覓蹤跡。據發明人2012年-2016年間多次進行的野外考察，僅在云南文山和越南交界的地方見到原始居群。因此應加強亨利兜蘭的保護工作，尤其要開展亨利兜蘭的繁殖技術研究，以利益促保護，減少野外采挖破壞。

由于傳統的分株等方法繁殖系數低，費時費力，種子發育不全且沒有胚乳，蘭花多采用組培快繁的方法進行繁殖。兜蘭的組織培養技術難度極大(王代谷等，“貴州兜蘭屬植物的現狀及展望”,《安徽農業科學》,2009,37(6):2469-2470)，是蘭科中最難的屬之一。楊燕萍等以亨利兜蘭的側芽為材料進行誘導和離體快繁實驗，莖尖誘導培養基以Heller+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5g/L活性炭，在繼代培養中，試管苗在培養基1/2MS+0.2mg/L 6-BA+2mg/L NAA+10％椰子汁+2g/L活性炭中叢生芽增殖為佳，增殖倍數為3.50，增殖系數有待提高(楊燕萍等，“亨利兜蘭莖尖誘導與離體快繁試驗”，《農業科技通訊》，2011，53-55)。曾宋君等(曾宋君等，“兜蘭無菌播種和組織培養研究進展”,《園藝學報》,2007,34(3):793-796)以人工授粉后300天的兜蘭種子進行無菌播種實驗，發現播種于VW+1mg/L NAA+100ml/L椰子汁+1g/L活性炭培養基，萌發快，萌發率最高約50％。但是隨后停止生長并有大量原球莖死亡，需轉至另一種培養基繼代培養，文中未提到增殖倍數。Lee等從亨利兜蘭授粉后60天開始取果莢，每隔30天取一次，一直到270天，發現授粉150天的果莢種子萌發率最高，達40％左右(YI Lee,“Asymbiotic Seed Germination of Six Paphiopedilum Species in Relation to the Time of Seed Collection and Seed Pretreatment”,Acta Horticulturae,2007,755(755):381-386)。可見，目前亨利兜蘭的組培快繁殖技術還不是很成熟。

因此，為了保護亨利兜蘭的野生資源同時滿足消費者的需求，有必要提供一種亨利兜蘭的快速繁殖體系，以縮短其培養周期、提高種苗成活率和幼苗質量、降低成本，從而滿足市場對這一觀賞花卉不斷增長的需求。

技術實現要素：

為了解決上述問題和克服現有技術中的缺陷，本發明提供了一種亨利兜蘭組織培養快速繁殖的方法、一種適于亨利兜蘭組織培養快速繁殖的培養基體系以及提供了亨利兜蘭果莢的最佳采集期。

本發明的第一方面提供了一種亨利兜蘭組織培養快速繁殖的方法，包括以下步驟：

(1)自交授粉：選擇花大色艷的亨利兜蘭進行異花授粉；

(2)果莢采摘：在亨利兜蘭自交后270-390天左右采集果莢；

(3)無菌播種：以采集的果莢為外植體進行消毒，切開果莢將種子接種在萌發培養基中，暗培養大約4周開始有原球莖萌發，大約8周有芽長出，然后轉為光照周期為12h培養；

(4)增殖繼代培養：將步驟(3)中產生的幼苗接種到增殖培養基中，每4周繼代一次，增值率達3倍；

(5)生根壯苗培養：將步驟(4)中增殖培養大約8周的、生長健壯的2cm左右的幼苗轉接到生根壯苗培養基中進行培養；

(6)生根苗移栽：在步驟(5)中的幼苗培養大約4周后，將根系生長良好的植株轉移到自然光下煉苗，然后將其移栽至基質中進行培養。

在一個實施方式中，在本發明的方法中使用的所述萌發培養基為1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠；或者所述萌發培養基為1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠。

在一個實施方式中，在本發明的方法中使用的所述增殖培養基為1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+100ml/L椰乳+1.5g/L活性炭20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠。

在一個實施方式中，在本發明的方法中使用的所述生根壯苗培養基為1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠。

在一個優選的實施方式中，在亨利兜蘭自交后第260天左右、第270天左右、第300天左右、第330天左右、第360天左右、第390天左右或上述任意時間點之間的任意時間點采集果莢。例如，可以在亨利兜蘭自交后第260天左右、第270天左右、第280天左右、第290天左右、第300天左右、第310天左右、第320天左右、第330天左右、第340天左右、第350天左右、第360天左右、第370天左右、第380天左右、第390天左右或上述任意時間點之間的任意時間點采集果莢。優選地，在亨利兜蘭自交后第270-330天左右、第330-360天左右或第360-390天左右采摘果莢，更優選地在亨利兜蘭自交后第270-300天左右、第300-330天左右或第330-360天左右采摘果莢，甚至更優選地在亨利兜蘭自交后第330-330天左右采摘果莢。優選地，在亨利兜蘭自交后第270天左右、第300天左右或第330天左右采摘果莢。

在一個實施方式中，在本發明的方法中，培養室培養的溫度為24±2℃，光照強度為1000-15001x，光照周期為12h；黑暗培養溫度為24±2℃。

本發明的第二方面提供了一種用于亨利兜蘭組織培養快速繁殖的萌發培養基，所述萌發培養基為1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠。

本發明的第三方面提供了一種用于亨利兜蘭組織培養快速繁殖的培養基體系，其包含萌發培養基、增殖培養基和生根壯苗培養基，其中所述萌發培養基為1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠或者所述萌發培養基為1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠。

在一個實施方式中，本發明的培養基體系中的所述增殖培養基為1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+100ml/L椰乳+1.5g/L活性炭20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠。

在一個優選的實施方式中，本發明的培養基體系中的所述生根壯苗培養基為1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠。

在一個優選的實施方式中，本發明的培養基體系是下面表1所示的培養基體系，表1列出了本發明培養基體系中的各種培養基的成分及其用量。

表1.亨利兜蘭的離體培養基體系

注：表1中的生根壯苗培養基，既可作為一般生根壯苗培養基，也是本發明所指的可用來做長期繼代的培養基。

定義

為了便于對本發明的理解，對上述各個方面中所用的培養基、培養基中所用到的植物激素進行定義。

本發明所使用的MS基本培養基是根據Murashige T.等(Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant,1962,15:473-497)配制的，其成分及各成分含量如下表2所示。1/2MS為MS基本培養基中大量元素減半，其他元素用量不變；1/5MS為MS基本培養基中大量元素減至五分之一，其他元素用量不變。

本文中培養基中的成分“NAA”是指萘乙酸。

本文中所述的“6-BA”是指6-芐氨基嘌呤。

表2.MS培養基各成分及含量

本發明的有益技術效果

本發明產生的積極效果是：

(a)本發明所采用的外植體可在某固定時間段大量集中獲得并進行組織培養，打破了外植體不易獲得且污染率高的限制；

(b)本發明確立了亨利兜蘭無菌播種的最佳果莢成熟期，此時播種縮短了果莢生長時間，且種子萌發早，萌發率高、幼苗的增殖效果好；

(c)本發明還提供了適于亨利兜蘭離體快繁的培養基體系，包括萌發培養基、增殖培養基和生根壯苗培養基，培養基配方簡單，離體快繁的操作流程簡潔易操作，生產低成本，可進行商業化大規模生產。

前述內容僅僅是示意性的并且決不旨在是限制性的。除了上述示意性方面、實施方式和特征，通過參考下述詳細說明，進一步的方面、實施方式和特征將更容易被理解。

附圖簡述

通過參考下述附圖，本發明的進一步的方面、特征將更容易被理解。本領域技術人員應該理解，這些附圖僅示意性地闡述了根據本發明的一些實施方式，而不應將其視為是對本發明范圍的限制。

圖1示出了亨利兜蘭授粉過程的示意圖。

圖2示出了授粉后150天和330天采集的種子的圖像，其中在授粉后150天采集的亨利兜蘭的種子為白色，330天采集的為褐色。

圖3示出了在亨利兜蘭授粉后240天、270天、330天和390天采集的種子萌發165天生長情況。

圖4示出了不同時期(從授粉后210天到420天)采摘的果莢在培養基(1)和培養基(2)中分別培養8周和16周后種子的萌發率，其中培養基(1)為1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠，培養基(2)為1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠。

圖5示出了根據本發明一個方面的亨利兜蘭組培快繁技術體系的流程圖。

圖6示出了根據本發明一個方面的亨利兜蘭的組織培養過程圖。

圖7示出了亨利兜蘭的出瓶煉苗情況。

具體實施方式

在下文中，僅簡單地描述了某些示例性實施例。正如本領域技術人員可認識到的那樣，在不脫離本發明的精神或范圍的情況下，可通過各種不同方式修改所描述的實施例。因此，附圖和描述被認為本質上是示例性的而非限制性的。

實施例1.亨利兜蘭自交授粉和果莢最佳采摘期的確定

實驗材料：亨利兜蘭獲取自中國農業科學院蔬菜花卉研究所溫室；本發明所有實施例中使用的各種試劑或培養基成分均經商購獲得。

選擇花大色艷的亨利兜蘭進行人工異花授粉，如圖1所示，授粉后生長得到果莢。

授粉后，分別在第120天、第150天、第180天、第210天、第240天、第270天、第330天、第360天、第390天以及第420天收集果莢。

將上述果莢分別用自來水洗凈后，置于75％酒精浸泡30s，再以0.1％升汞滅菌15min，最后用無菌水清洗3遍。將洗凈的果莢切開，將種子接種于萌發培養基(培養基(1)和培養基(2))上，暗培養大約4周后原球莖萌發，大約8周有芽長出，然后轉為光照周期為12h培養。

培養基(1)為1/2MS+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠，培養基(2)為1/2MS+100ml/L椰汁+1.0mg/L NAA+1.0g/L活性炭20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠。培養條件為：培養室培養的溫度為24±2℃，光照強度為1000-15001x，光照周期為12h；黑暗培養溫度為24±2℃。

結果發現，在授粉后150天-270天采集的亨利兜蘭的種子為白色，授粉后300天之后采集的種子為褐色(見圖2)。亨利兜蘭種子暗培養大約4周開始有原球莖萌發，大約8周有芽長出，轉入光培養后，大概10周轉綠。授粉后120天到210天采集的種子沒有萌發率，表明采取果莢的時間尚早，種胚發育不完全。授粉后270天采集的果莢在培養基(2)上培養8周后發芽率最高，達62.15％，16周時由于褐化等原因萌發率稍有降低。授粉后360天的果莢在播種16周時，培養基(2)上的萌發率達到56.33％。可見成熟度高的種子萌發稍慢，但是成活率稍高(見圖2-4)。

實施例2.亨利兜蘭種子的組織培養快速繁殖

如附圖5-7所示，本發明的亨利兜蘭種子的組織培養快速繁殖方法包括如下步驟：

1、自交授粉：選擇花大色艷的亨利兜蘭進行異花授粉；

2、果莢采摘：在亨利兜蘭自交后270天左右采集果莢；

3、無菌播種：按照實施例1中所述的方法以采集的果莢為外植體進行消毒，切開果莢將種子接種在萌發培養基(實施例1中的培養基(2))中進行暗培養40天左右，有原球莖萌發后轉為光照周期為12h培養，8周時，種子萌發率可達62.15％；

4、增殖繼代培養：將步驟3中產生的幼苗接種到增殖培養基中，每4周繼代一次，其中增殖培養基為1/2MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+100ml/L椰乳+1.5g/L活性炭20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠；

5、生根壯苗培養：將步驟4中增殖培養8周的、生長健壯的2cm左右的幼苗轉接到生根壯苗培養基中進行培養，其中生根壯苗培養基為1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+1.5g/L活性炭+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠；

6、生根苗移栽：在步驟5中的幼苗培養4周后，將根系生長良好的植株轉移到自然光下煉苗，然后將其移栽至基質中進行培養，成活率可達95％。

實施例3.亨利兜蘭種子的組織培養快速繁殖

如附圖6-7所示，本發明的亨利兜蘭種子的組織培養快速繁殖方法包括如下步驟：

1、自交授粉：選擇花大色艷的亨利兜蘭進行異花授粉；

2、果莢采摘：在帶葉兜蘭自交后330天左右采集果莢；

3、無菌播種：采用上述培養基(1)按照實施例2所述的方法進行無菌播種，種子萌發率達55.22％；

4、增殖繼代培養：按照實施例2所述的方法進行增殖繼代培養；

5、生根壯苗培養：按照實施例2所述的方法進行生根壯苗培養；

6、生根苗移栽：在步驟5中的幼苗培養4周后，將根系生長良好的植株轉移到自然光下煉苗，然后將其移栽至基質中進行培養，成活率可達95％。

實施例4.亨利兜蘭種子的組織培養快速繁殖

如附圖6-7所示，本發明的亨利兜蘭種子的組織培養快速繁殖方法包括如下步驟：

1、自交授粉：選擇花大色艷的亨利兜蘭進行異花授粉；

2、果莢采摘：在帶葉兜蘭自交后360天左右采集果莢；

3、無菌播種：采用上述培養基(2)按照實施例2所述的方法進行無菌播種，種子萌發率達56.33％；

4、增殖繼代培養：按照實施例2所述的方法進行增殖繼代培養；

5、生根壯苗培養：按照實施例2所述的方法進行生根壯苗培養；

6、生根苗移栽：在步驟5中的幼苗培養4周后，將根系生長良好的植株轉移到自然光下煉苗，然后將其移栽至基質中進行培養，成活率可達95％。

以上所述，僅為本發明的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到其各種變化或替換，這些都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應以所述權利要求的保護范圍為準。