本發明屬于植物繁殖領域，具體涉及一種梅葉冬青組織培養快速繁殖方法。
背景技術：
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梅葉冬青(Ilex asprella Champ.ex Benth)屬于冬青科冬青屬，落葉灌木，株高可達3米。主要分布于我國浙江、江西、福建、臺灣、湖南、廣東、廣西、香港等地；在菲律賓群島也有分布。多生于海拔400-1000米的山地疏林中或路旁灌叢中。其根、莖、葉均可入藥，味苦、甘、性涼，清熱解毒、生津止渴。為廣東、廣西等嶺南地區常用中藥，用于感冒、高熱煩渴、扁桃體炎、咽喉炎、氣管炎、百日咳等。梅葉冬青根為王老吉涼茶、沙溪涼茶等的主要原料，嶺南民間也廣泛用梅葉冬青自制涼茶。根據研究梅葉冬青的葉片含有熊果酸，具有鎮靜、消炎，抗糖尿病、冠心病及心絞痛等效應。隨著現代醫學對梅葉冬青活性成分和藥理成分的研究深入，其臨床應用逐年擴大，梅葉冬青具有廣闊的市場前景和經濟效益。
目前，梅葉冬青原料主要來源于野生資源，隨著市場的需求擴大，梅葉冬青自然資源日益枯竭，無法滿足當前的市場需求。人工栽培是以后的重要發展方向。常見的梅葉冬青繁殖技術主要為種子有性繁殖和枝條扦插繁殖。梅葉冬青種子具有深度休眠、隔年發芽的特性，其種子發芽繁殖受到季節明顯影響。另外，梅葉冬青種子小，其采集費時耗力，且不易儲存。梅葉冬青扦插繁殖，需采集大量當年生木質化枝條，對梅葉冬青生長存在較大破壞，且在大規模種植時，易受到材料量的限制。
技術實現要素：
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本發明的目的是提供一種育苗繁殖不受時間和原材料數量的影響，繁殖系數高，培育時間短，為大規模的培育梅葉冬青種苗提供技術保障的梅葉冬青組織培養快速繁殖方法。
本發明的梅葉冬青組織培養快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步驟：
a、選取健康無病蟲害8-12cm的梅葉冬青當年新抽帶芽枝條，去除枝條的葉，用酒精棉拭去枝條表面的灰塵并剪成3-5段，每段帶有1-2個休眠芽點的枝段作為外植體；
b、將外植體滅菌，然后將滅菌后的外植體插入初代誘芽培養基中培養誘導出腋芽或頂芽，培養條件為：1500-2000Lx，24℃-28℃，光照時間12h-14h，黑暗時間12h-10h，培養20-30天，外植體的休眠芽生發成腋芽或頂芽，萌發率可達到80％以上，所述的初代誘芽培養基每升含有：1mg ZT(玉米素)、0.05mg NAA(萘乙酸)、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、30g蔗糖，余量為MS培養基，pH 5.8-6.0；
c、將腋芽或頂芽切下，接入不定芽增殖培養基中進行增殖培養獲得不定芽，培養條件為：1500-2000Lx，24℃-28℃，光照時間12h-14h，黑暗時間12h-10h，所述的不定芽增殖培養基每升含有：1mg 6-BA(6-芐氨基基嘌呤)、0.05mgNAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為MS培養基，pH 5.8-6.0；增殖培養周期為35-45天，增殖系數可達到5；
d、將不定芽接入壯苗培養基進行壯苗培養得到無根壯苗，培養條件為：1500-2000Lx，24℃-28℃，光照時間12h-14h，黑暗時間12h-10h，所述的壯苗培養基每升含有：0.1mg 6-BA、0.1mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為MS培養基，pH 5.8-6.0；
e、將2-3cm高帶有3-5個葉片的無根壯苗接入生根誘導培養基中培養得到組培苗，培養條件為：1500-2000Lx，24℃-28℃，光照時間12h-14h，黑暗時間12h-10h，所述的生根誘導培養基每升含有：1mg IBA(吲哚乙酸)、0.02g AC(活性炭)、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為1/2MS培養基，pH 5.8-6.0；培養30-45天，生根率可達到85％以上；
f、將組培苗進行移栽培養；
所述的步驟b的將外植體滅菌優選是在無菌操作臺上，將外植體置于體積分數75％酒精溶液中浸泡30s；移到無菌工作臺上，將酒精消毒的外植體放入錐形瓶中，加入質量分數0.1％的升汞水溶液，滴加1滴吐溫，浸泡10-15min，中間晃動數次，最后用無菌水沖洗3次，得到滅菌處理的外植體。
所述的移栽培養是待組培苗生根5-10條，根長1-2cm時，將組培苗移到溫度濕度與外界相一致的培養室中，4天后打開瓶蓋，使生出根的組培苗與外界保持較高的接觸，7天后加水取出生根苗，洗凈培養基，用質量分數0.1％高錳酸鉀水溶液浸泡1-3min，移入珍珠巖：蛭石體積比＝3:2的基質中。移栽成活率可達到95％以上。
本發明中的MS培養基是指沒有加瓊脂的液體培養基，其配方屬于本領域的公知常識，所述的1/2MS培養基是MS培養基中大量元素減半，而其他不變的培養基。
與現有的技術相比，本發明的具有以下優點：
本發明實現了野生梅葉冬青組織培養快速繁殖，為野生梅葉冬青組織培養技術開辟新道路。本發明的方法操作簡單，易于實施，可一次性培育出大量的梅葉冬青生長幼苗。本發明能夠有效的縮短育苗時間，且本發明所用的培養基和試劑易配置，成本低，易大范圍推廣。
具體實施方式：
以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
實施例1：
a、選取健康無病蟲害8－12cm左右的野生梅葉冬青新抽帶芽枝條；去除枝條的雜葉，使用體積分數75％的酒精棉拭去枝條表面的灰塵并剪成3－5段，每段3cm左右，帶有1-2個休眠芽點，以此枝莖段作為外植體；
b、外植體滅菌：在無菌操作臺上，將上述初步消毒得到的莖段(外植體)置于體積分數75％酒精溶液中浸泡30s；移到無菌工作臺上，將酒精消毒的莖段放入錐形瓶中，加入質量分數0.1％的升汞水溶液，滴加1滴吐溫，浸泡10-15min，中間晃動數次，最后用無菌水沖洗3次，得到滅菌處理的外植體；
c、外植體誘導培養：將經滅菌處理的外植體插入初代誘芽培養基中培養，培養條件為：1500Lx，24℃-28℃，光照時間14h，黑暗時間10h，培養20-30天，外植體的休眠芽生發成腋芽或頂芽，萌發率可達到80％以上。所述的初代不定芽誘導培養基為：MS+1mg/L ZT+0.05mg/L NAA+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+3％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的初代誘芽培養基每升含有：1mg ZT、0.05mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、30g蔗糖，余量為MS培養基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將1mg ZT、0.05mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、30g蔗糖加入到少量液體MS培養基中，然后再用液體MS培養基定容到1L，調pH值至5.8-6.0，滅菌備用。
d、不定芽增殖培養：將上述所得到的長為1cm左右的腋芽或頂芽切下，接入不定芽增殖培養基中培養獲得不定芽，培養條件為：1500Lx，24℃-28℃，光照時間14h，黑暗時間10h，培養35-45天為一個周期，增殖系數可達到5。所述的不定芽增殖培養基成份為：MS+1mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+2％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的不定芽增殖培養基每升含有：1mg 6-BA、0.05mgNAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為MS培養基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將1mg 6-BA、0.05mgNAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖加入到少量液體MS培養基中，然后用液體MS培養基定容到1L，調pH值至5.8-6.0，滅菌備用。
e、壯苗培養：將增殖獲得的不定芽放入壯苗培養基中培養30-45天得到無根壯苗，培養條件為：1500Lx，24℃-28℃，光照時間14h，黑暗時間10h。所述的壯苗培養基成份為：MS+0.1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+2％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的壯苗培養基每升含有：0.1mg 6-BA、0.1mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為MS培養基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將0.1mg 6-BA、0.1mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖加入到少量液體MS培養基中，然后用液體MS培養基定容到1L，調pH值至5.8-6.0，滅菌備用。
f、分化生根培養：將上述所得到2-3cm高帶有3-5個葉片的無根壯苗接入生根誘導培養基中培養30-45天得到組培苗，生根率可達到85％以上。培養條件為：1500Lx，24℃-28℃，光照時間14h，黑暗時間10h。所述的生根誘導培養基成份為：1/2MS+1mg/L IBA+0.02g/L AC+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+2％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的生根誘導培養基每升含有：1mg IBA、0.02gAC、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為1/2MS培養基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將1mg IBA、0.02gAC、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖加入到液體1/2MS培養基中，然后用液體MS培養基定容到1L，調pH值至5.8-6.0，滅菌備用。
g、移栽培養：待組培苗生根5-10條，根長1-2cm時，將組培苗移到溫度濕度與外界相一致的培養室中，4天后打開瓶蓋，使生根組培苗與外界保持較高的接觸，7天后加水取出生根苗，洗凈培養基；用質量分數0.1％高錳酸鉀水溶液浸泡1-3min，移入珍珠巖：蛭石體積比為3:2的基質中培養，由此獲得梅葉冬青小苗。
實施例2：
a、選取健康無病蟲害8－12cm左右的野生梅葉冬青新抽帶芽枝條；去除枝條的雜葉，使用體積分數75％的酒精棉拭去枝條表面的灰塵并剪成3－5段，每段3cm左右，帶有1-2個休眠芽點，以此處理的枝條作為外植體；
b、外植體滅菌：在無菌操作臺上，將上述初步消毒得到的莖段(外植體)置于體積分數75％酒精溶液中浸泡30s；移到無菌工作臺上，將酒精消毒的莖段放入錐形瓶中，加入質量分數0.1％的升汞水溶液，滴加1滴吐溫，浸泡10-15min，中間晃動數次，最后用無菌水沖洗3次，得到滅菌處理的外植體；
c、外植體誘導培養：將經滅菌處理的外植體插入初代誘芽培養基中培養，培養條件為：2000Lx，24℃-28℃，光照時間12hh，黑暗時間12h，培養20-30天，外植體的休眠芽生發成腋芽或頂芽，萌發率可達到80％以上。所述的初代不定芽誘導培養基為：MS+1mg/L ZT+0.05mg/L NAA+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+3％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的初代誘芽培養基每升含有：1mg ZT、0.05mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、30g蔗糖，余量為MS培養基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將1mg ZT、0.05mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、30g蔗糖加入到少量液體MS培養基中，然后再用液體MS培養基定容到1L，調pH值至5.8-6.0，滅菌備用。
d、不定芽增殖培養：將上述所得到的長為1cm左右的腋芽或頂芽切下，接入不定芽增殖培養基中培養獲得不定芽，培養條件為：2000Lx，24℃-28℃，光照時間12hh，黑暗時間12h，培養35-45天為一個周期，增殖系數可達到5。所述的不定芽增殖培養基成份為：MS+1mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+2％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的不定芽增殖培養基每升含有：1mg 6-BA、0.05mgNAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為MS培養基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將1mg 6-BA、0.05mgNAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖加入到少量液體MS培養基中，然后用液體MS培養基定容到1L，調pH值至5.8-6.0，滅菌備用。
e、壯苗培養：將增殖獲得的不定芽放入壯苗培養基中培養30-45天得到無根壯苗，培養條件為：2000Lx，24℃-28℃，光照時間12hh，黑暗時間12h。所述的壯苗培養基成份為：MS+0.1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+2％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的壯苗培養基每升含有：0.1mg 6-BA、0.1mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為MS培養基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將0.1mg 6-BA、0.1mg NAA、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖加入到少量液體MS培養基中，然后用液體MS培養基定容到1L，調pH值至5.8-6.0，滅菌備用。
f、分化生根培養：將上述所得到2-3cm高帶有3-5個葉片的無根壯苗接入生根誘導培養基中培養30-45天得到組培苗，生根率可達到85％以上。培養條件為：2000Lx，24℃-28℃，光照時間12hh，黑暗時間12h。所述的生根誘導培養基成份為：1/2MS+1mg/L IBA+0.02g/L AC+6.2g/L瓊脂粉+0.1g/L肌醇+2％蔗糖，pH 5.8-6.0，即所述的生根誘導培養基每升含有：1mg IBA、0.02gAC、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖，余量為1/2MS培養基，pH 5.8-6.0，其每升配制方法是將1mg IBA、0.02gAC、6.2g瓊脂、0.1g肌醇、20g蔗糖加入到液體1/2MS培養基中，然后用液體MS培養基定容到1L，調pH值至5.8-6.0，滅菌備用。
g、移栽培養：待組培苗生根5-10條，根長1-2cm時，將組培苗移到溫度濕度與外界相一致的培養室中，4天后打開瓶蓋，使生根組培苗與外界保持較高的接觸，7天后加水取出生根苗，洗凈培養基；用質量分數0.1％高錳酸鉀水溶液浸泡1-3min，移入珍珠巖：蛭石為3:2的基質中，由此獲得梅葉冬青小苗。