本發(fā)明涉及一種野生稻抗紋枯病的鑒定方法，屬植物保護(hù)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

水稻紋枯病是由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染引起的一種世界性水稻病害，造成水稻巨大的產(chǎn)量損失和品質(zhì)降低(Savary et al.,2006)。水稻紋枯病致病菌的菌絲主要在葉鞘、葉片，導(dǎo)致葉片枯死，最終使水稻結(jié)實(shí)率降低和千粒重下降，嚴(yán)重時(shí)引起植株倒伏或整株枯死，損失高達(dá)50％以上。盡管不同菌株間的致病性差異顯著，但是初步認(rèn)為紋枯菌中不存在生理小種分化(Jia et al.,2007；Marchetti et al.,1991)。水稻對(duì)紋枯病的抗性易受環(huán)境影響，不同的水稻品種對(duì)紋枯病的抗病力是有差異的(潘學(xué)彪等，2001)，中抗紋枯病的品種可以減輕紋枯病對(duì)產(chǎn)量的影響(向珣朝等，2005)，迄今未發(fā)現(xiàn)免疫或高抗種質(zhì)，開(kāi)展抗病遺傳育種研究難度較大，國(guó)際上對(duì)該領(lǐng)域的研究較少。

野生稻是栽培稻的祖先，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的多樣性生態(tài)環(huán)境選擇進(jìn)化，富含水稻育種可利用的重要基因。中國(guó)在“八五”計(jì)劃期間鑒定了2000余份普通野生稻的紋枯病抗性，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)免疫和高抗材料,僅檢測(cè)到少數(shù)中抗材料，如S1001,S3192,S1031,S3304和S8153等(韓飛等，2007)。Eizenga等在生長(zhǎng)箱中對(duì)21份野生稻材料進(jìn)行紋枯病菌接種鑒定，發(fā)現(xiàn)印度野生稻(Oryza nivara)、巴蒂野生稻(Oryza barthii)和南方野生稻(Oryza meridionalis)的紋枯病抗性較好，其他均較易感紋枯病(Eizenga et al.,2007)。Prasad和Eizenga采用多種評(píng)定方法對(duì)涉及15個(gè)種的60份野生稻材料進(jìn)行了紋枯病抗性鑒定，結(jié)果只發(fā)現(xiàn)4份中抗材料，包括上述3種野生稻和1種藥用野生稻(Oryza officinalis)等(Prasad et al.,2008)。云南藥用野生稻由于原生境生態(tài)類型的多樣性，在長(zhǎng)期自然進(jìn)化中形成了豐富的遺傳多樣性，具有許多優(yōu)異性狀，是改良和拓寬栽培稻遺傳基礎(chǔ)的寶貴基因資源。周而勛等1998年發(fā)表的水稻紋枯病菌分離的技術(shù)，病樣組織只用自來(lái)水沖洗，即放在水瓊脂上分離，在實(shí)際操作非常容易污染，且分離病菌時(shí)間長(zhǎng)等不足(周而勛等，1998)。因此，快速分離紋枯病菌并從云南藥用野生稻資源中精確鑒定免疫或中高抗水稻紋枯病材料至關(guān)重要。

本發(fā)明將提供快速分離水稻紋枯病菌并對(duì)云南藥用野生稻居群抗紋枯病特性進(jìn)行鑒定的方法，對(duì)深入挖掘抗水稻紋枯病稻種資源，為水稻抗病育種及云南藥用野生稻抗病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有分離和鑒定技術(shù)之不足，而提供一種野生稻抗紋枯病特性鑒定的方法。

本發(fā)明的野生稻抗紋枯病的鑒定方法，其具體步驟如下：

1、病樣采集：在水稻分蘗盛期及孕穗期，在采集水稻莖稈上有典型云紋狀病斑的水稻莖稈用剪刀從植株基部剪斷，保留病斑部位，去除葉片后于自封袋中密封保存；

2、分離紋枯病菌：采集當(dāng)天或第二天開(kāi)始分離病菌，將有明顯病斑的莖稈用剪刀剪成1-2cm段，用體積百分比為75％的酒精對(duì)病樣消毒5sec，無(wú)菌水漂洗2次，后放置于1段于水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)皿中央，或分散放置1-2段，并在1000ml水瓊脂培養(yǎng)基中滴入2-3滴乳酸，培養(yǎng)1-2天后，在無(wú)菌和強(qiáng)光的環(huán)境中，觀察在帶病莖稈周圍向瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的透明菌絲的形狀，樹(shù)枝狀分叉的菌絲為紋枯病菌絲，呈放射狀的菌絲為其他雜真菌的菌絲；挑取含有分叉樹(shù)枝狀的1.0cm×1.0cm水瓊脂培養(yǎng)基菌絲塊或用1.0cm直徑的打孔器打菌絲轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)；2天后，米糠色的菌絲呈放射狀布滿培養(yǎng)皿，再培養(yǎng)3天即長(zhǎng)出米糠色菌核，說(shuō)明分離出的病菌即是水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)；

3、菌株保存：無(wú)菌狀態(tài)下，在PDA培養(yǎng)基上挑取收集菌核于1.5ml離心管中，裝至2/3處，將離心管放置在-20℃的冰箱中保存待用；

4、病菌菌種準(zhǔn)備：將分離獲得水稻紋枯病菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)活化2-4天,獲得菌絲；活化培養(yǎng)后的菌落邊緣，用6mm打孔器打孔獲取5mm×5mm菌餅接種至新的PDA培養(yǎng)基上，黑暗、28℃培養(yǎng)2天后菌絲鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿，按1根5cm木質(zhì)牙簽剪短成5段，用體積百分比為75％的酒精對(duì)牙簽滅菌5sec后放置于長(zhǎng)滿菌絲的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3-5天至菌絲菌核覆蓋牙簽段，待用；

5、待鑒定品種的準(zhǔn)備：將武育粳3號(hào)的種子浸泡24-48h，種子在培養(yǎng)皿中于濕潤(rùn)濾紙上28℃催芽，待種子露白，將種子播種于盆中，每品種均勻播種3行,每行10株苗；每品種播3次重復(fù)；注意澆水，盆中保水深度為5cm,在溫室或露天放置,待苗長(zhǎng)至3-4葉期待用；藥用野生稻植株的準(zhǔn)備，將藥用野生稻按分蘗分成帶根的植株，剪去葉片，分別種植在盆中，1盆1個(gè)分蘗，保水深度5cm，待新芽新莖長(zhǎng)出后接種；

6、接種：將步驟(4)中的長(zhǎng)有菌絲和菌核的牙簽用鑷子夾取放置于2cm×5cm的膠帶紙上，貼包至步驟(5)獲得的水稻苗基部，使牙簽與稻莖接觸，每行選擇10株接種；噴霧，使保濕度大于80％，環(huán)境溫度28℃；待病斑擴(kuò)展至膠帶紙外時(shí)，將膠帶紙及牙簽取下；幼苗正常生長(zhǎng)管理；

7、鑒定野生稻抗紋枯病抗性：在接種7-10天后、或感病對(duì)照品種武育粳3號(hào)發(fā)病至9級(jí)，調(diào)查待鑒定藥用野生稻病情；病情嚴(yán)重程度，采用Eizenga等的調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)，即為0級(jí)：全株無(wú)病；1級(jí)：以劍葉為第1片葉向下數(shù)起，第4片葉及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；3級(jí)：第3片葉及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；5級(jí)：第2片葉及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；7級(jí)：第1片葉及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；9級(jí)：全株發(fā)病，枯死。

上述步驟中的水瓊脂培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基均為公知的通用培養(yǎng)基，培養(yǎng)和活化條件同現(xiàn)有技術(shù)。

本發(fā)明用到的儀器及材料均為市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。

本發(fā)明的有益的效果在于：本發(fā)明能夠快速鑒定藥用野生稻抗紋枯病抗源，提高篩選效率；工作周期大大縮短，操作方便、快捷，工作量小；對(duì)深入挖掘抗水稻紋枯病稻種資源，為水稻抗病育種及云南藥用野生稻抗病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1顯示水稻紋枯病菌分離。

圖2為打孔器打孔獲得的水稻紋枯病菌菌餅。

圖3顯示紋枯病菌餅轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。

圖4顯示放入滅菌牙簽。

圖5顯示長(zhǎng)滿菌絲和菌核的牙簽。

圖6顯示將牙簽移入待接種藥用野生稻植株葉鞘或莖基部用膠帶紙固定。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述。

本實(shí)施例所用到的儀器及材料均為市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。水瓊脂培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基均為公知的通用培養(yǎng)基，培養(yǎng)和活化條件同現(xiàn)有技術(shù)。

實(shí)施實(shí)例1：從水稻紋枯病病葉中快速分離純化紋枯病病菌

1、病樣采集：在水稻分蘗盛期及孕穗期，在采集水稻莖稈上有典型云紋狀病斑的水稻莖稈用剪刀從植株基部剪斷，保留病斑部位，去除葉片后于自封袋中密封保存，貼上標(biāo)有采集地、時(shí)間的標(biāo)簽。

2、分離紋枯病菌：采集當(dāng)天或第二天開(kāi)始分離病菌，將帶有明顯病斑的莖稈用剪刀剪成長(zhǎng)度為1cm或2cm的數(shù)段，用濃度百分比為75％的酒精對(duì)莖桿消毒5sec，無(wú)菌水漂洗2次，后放置1段莖桿于裝有滅過(guò)菌的水瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，或分散放置1或2段消過(guò)毒的莖桿，28℃黑暗培養(yǎng)24-48h后，在無(wú)菌狀態(tài)的超凈臺(tái)上，放置一個(gè)白色光的臺(tái)燈，將培養(yǎng)皿對(duì)準(zhǔn)光源，觀察在帶病莖稈周圍向瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的透明菌絲的形狀，呈樹(shù)枝狀分叉的菌絲為紋枯病菌絲，呈放射狀的菌絲為其他雜真菌的菌絲；挑取含有分叉樹(shù)枝狀的1.0cm×1.0cm水瓊脂培養(yǎng)基菌絲塊或用1.0cm直徑的打孔器打菌絲轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)；2天后，米糠色的菌絲呈放射狀布滿培養(yǎng)皿，再培養(yǎng)3天即長(zhǎng)出米糠色菌核，說(shuō)明分離出的病菌即是水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)。

圖1是水稻紋枯病菌的分離。結(jié)果顯示消毒后的帶菌水稻莖桿放置于水瓊脂培養(yǎng)基后1-2天后，在水瓊脂培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)的呈樹(shù)枝狀分叉的菌絲即為紋枯病菌菌絲。

3、菌株保存：無(wú)菌狀態(tài)下，在PDA培養(yǎng)基上挑取收集菌核于1.5ml離心管中，裝至2/3處，將離心管放置在-20℃的冰箱中保存待用。

實(shí)施實(shí)例2用紋枯病菌接種鑒定藥用野生稻抗紋枯病特性

1、病菌菌種準(zhǔn)備：將分離獲得水稻紋枯病菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)活化2天或3天或4天，獲得菌絲；活化培養(yǎng)后的菌落邊緣，用6mm打孔器打孔獲取5mm×5mm菌餅接種至新的PDA培養(yǎng)基上(見(jiàn)圖2-3)，黑暗、28℃培養(yǎng)2天后菌絲鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿，按1根木質(zhì)牙簽剪短成5段，用濃度百分比為75％的酒精對(duì)牙簽滅菌5sec后放置于長(zhǎng)滿菌絲的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5天至菌絲菌核覆蓋牙簽段，待用，見(jiàn)圖4-5。

2、待鑒定品種的準(zhǔn)備：將感病品種武育粳3號(hào)的種子浸泡48h，種子在培養(yǎng)皿中于濕潤(rùn)濾紙上28℃催芽，待種子露白，將種子播種于盆中，每品種均勻播種3行，每行10株苗；每品種播種3次重復(fù)；注意澆水，盆中保水深度為5cm，在溫室或露天放置，待苗長(zhǎng)至3葉或4葉期待用；藥用野生稻植株的準(zhǔn)備，將藥用野生稻按分蘗分成帶根的植株，剪去葉片，分別種植在盆中，1盆1個(gè)分蘗，保水深度5cm，待新芽新莖長(zhǎng)至株高20cm接種。

3、接種：將長(zhǎng)有菌絲和菌核的牙簽(見(jiàn)圖5)用鑷子夾取放置于2cm×5cm的膠帶紙上，貼至步驟2中獲得的水稻苗的基部，使牙簽與稻莖接觸，每行選擇10株接種；噴霧，使保濕度大于80％，環(huán)境溫度28℃；待病斑擴(kuò)展至膠帶紙外時(shí)，將膠帶紙及牙簽取下；幼苗正常生長(zhǎng)管理。

4、鑒定野生稻抗紋枯病抗性：在接種7-10天后、或感病對(duì)照品種武育粳3號(hào)發(fā)病至9級(jí)，調(diào)查待鑒定藥用野生稻材料病情；病情嚴(yán)重程度分級(jí)，按病斑擴(kuò)展程度，采用Eizenga等的調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)，即為0級(jí)：全株無(wú)病；1級(jí)：以劍葉為第1片葉算起，第 4片葉及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；3級(jí)：第 3片葉及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；5級(jí)：第 2片葉及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；7級(jí)：第 1片葉及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；9級(jí)：全株發(fā)病，枯死。結(jié)果表明：參試的7個(gè)來(lái)源的藥用野生稻發(fā)病級(jí)別為1-3級(jí)，表現(xiàn)為高抗紋枯病，為良好的抗紋枯病抗源。

發(fā)明用上述方法對(duì)7個(gè)不同來(lái)源的藥用野生稻抗紋枯病進(jìn)行鑒定，其結(jié)果如表1所示。

表1 7個(gè)不同來(lái)源的藥用野生稻抗紋枯病鑒定結(jié)果

實(shí)際應(yīng)用表明：本方法不僅能夠快速鑒定藥用野生稻抗紋枯病抗源，而且篩選效率高，操作方便、快捷。