本發明屬于植物的組織培養
技術領域：
，尤其涉及一種藍莓組織培養的再生培養基及培養方法和應用。
背景技術：
：藍莓為杜鵑花科越橘屬植物，是具有較高的經濟價值和廣闊開發前景的新興果樹樹種。藍莓果實營養豐富，既可鮮食，也可深加工，低能量且含有多種抗氧化成分，尤其是其抗氧化能力為所有果品蔬菜之首。藍莓果實不僅具有增強人體免疫力、防癌抗癌的奇特功效、并可以顯著降低心血管疾病、糖尿病、帕金森病等的發病率；因此，藍莓被譽為“黃金漿果”，是聯合國糧農組織(fao)重點推薦的人類五大健康食品之一。我國藍莓種植和研究較晚，從20世紀80年代才開始引進種植，但近幾年發展呈迅猛態勢。隨著近來市場對藍莓的需求量不斷增長，傳統的扦插、壓條等繁殖方法繁殖系數和出苗率低，生根難，繁殖規模受限等缺點，難以滿足迅速推廣優良品種的需要。采用組織培養方法可以在短期內快速繁殖種苗，不僅繁殖率高，而且可以保持原繁殖母株的優良性狀，生產出的苗木質量好，均勻一致，容易脫去病毒，為后期樹體生長結果奠定良好的基礎，組織培養技術近來來在生產上應用越來越廣泛。在藍莓組織培養中再生培養基的配方以及外源植株激素的加入至關重要。目前所公開的培養基的配方都是針對不同的品種而言的，并不是一種培養基配方就適合所有的藍莓初代培養或再生培養。由于藍莓品種差異對培養基的營養成分需求略有不同，因此通過組織培養方式生產藍莓種苗時，需依據品種使用不同的培養基。同時，外源植物激素作為生長調節劑對離體外植體的分化存在明顯促進作用，不同的植物激素種類及濃度對于離體外植體細胞的分化和不同器官發生起著不同的作用。目前，對于藍莓外植體的再生技術尤其是藍莓葉片離體再生技術的研究并不多，而且還存在著諸多問題。為進一步改良藍莓品質，建立穩定的、高效的葉片離體再生體系是進行遺傳轉化的重要基礎的前提，有助于對藍莓進行遺傳改良。因此，研究出適宜的藍莓外植體再生技術中激素種類、濃度配比、再生培養基以及培養條件具有重要的現實意義。鑒于此，特提出本發明。技術實現要素：本發明的第一目的在于提供一種藍莓組織培養的再生培養基，具有針對性強、適應性好，成本低廉的優點，能夠有效提高愈傷組織的誘導率和不定芽的分化率。本發明的第二目的在于提供一種藍莓葉片離體再生的培養方法，該方法通過使用上述的藍莓組織培養的再生培養基進行藍莓葉片離體再生的培養，具有操作簡便，成本低，誘導效率高，周期短的優點。本發明的第三目的在于提供一種上述的藍莓組織培養的再生培養基在培養藍莓布里吉塔方面的應用。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：根據本發明的一個方面，本發明提供一種藍莓組織培養的再生培養基，包括初代培養基、增殖培養基和葉片不定芽誘導培養基；所述初代培養基包含：改良wpm培養基+0.5～2mg/l6－ba+15～40g/l蔗糖+5～15g/l植物凝膠，ph為5.2～5.4；所述增殖培養基包含：改良wpm培養基+0.5～2mg/lzt+15～40g/l蔗糖+5～15g/l植物凝膠，ph為5.2～5.4；所述葉片不定芽誘導培養基包含：改良wpm培養基+2～4mg/ltdz+15～40g/l蔗糖+5～15g/l植物凝膠，ph為5.2～5.4；其中，改良wpm培養基，是將wpm培養基中的cacl2·2h2o替換為糖醇鈣。作為進一步優選技術方案，各培養基的原料及其含量分別是：所述初代培養基包含：改良wpm培養基+1～1.5mg/l6－ba+20～30g/l蔗糖+5～10g/l植物凝膠，ph為5.2～5.3；所述增殖培養基包含：改良wpm培養基+1～1.5mg/lzt+20～30g/l蔗糖+5～10g/l植物凝膠，ph為5.2～5.3；所述葉片不定芽誘導培養基包含：改良wpm培養基+3～4mg/ltdz+20～30g/l蔗糖+5～10g/l植物凝膠，ph為5.2～5.3。作為進一步優選技術方案，各培養基的原料及其含量分別是：所述初代培養基包含：改良wpm培養基+1mg/l6－ba+20g/l蔗糖+5g/l植物凝膠，ph為5.2；所述增殖培養基包含：改良wpm培養基+1mg/lzt+20g/l蔗糖+5g/l植物凝膠，ph為5.2；所述葉片不定芽誘導培養基包含：改良wpm培養基+4mg/ltdz+20g/l蔗糖+5g/l植物凝膠，ph為5.2。作為進一步優選技術方案，所述改良wpm培養基包括大量元素和微量元素；所述大量元素包括(nh4)2so4、糖醇鈣、kh2po4、kno3和mgso4·7h2o；所述微量元素包括h3bo3、namoo4·2h2o、mnso4·h2o、znso4·7h2o和cuso4·5h2o。作為進一步優選技術方案，所述改良wpm培養基包括元素a液、元素b液、元素c液、元素d液、元素e液和有機物；元素a液的組分及含量為：400mg/l(nh4)2so4，684mg/l糖醇鈣；元素b液的組分及含量為：6.2mg/lh3bo3，170mg/lkh2po4，0.25mg/lnamoo4·2h2o；元素c液的組分及含量為：190mg/lkno3；元素d液的組分及含量為：370mg/lmgso4·7h2o，22.3mg/lmnso4·h2o，8.6mg/lznso4·7h2o，0.25mg/lcuso4·5h2o；元素e液的組分及含量為：27.8mg/lfeso4·5h2o，37.3mg/lna2edta；有機物的組分及含量為：100mg/l肌醇，0.5mg/l煙酸，0.5mg/l磷酸吡哆醇(vb6)，0.5mg/l磷酸硫胺素(vb1)，2.0mg/l甘氨酸。根據本發明的另一個方面，本發明還提供一種使用以上所述的藍莓組織培養的再生培養基進行藍莓葉片離體再生的培養方法，包括以下步驟：外植體的選取與消毒處理：選用生長健壯的藍莓枝條作為外植體，對外植體進行消毒處理；初代培養：將消毒后的藍莓莖段切成2～3cm的莖段，每段帶有1～2個腋芽，接種于初代培養基上進行初代培養，培養28～32天長出新枝；增殖培養：將初代培養長出的新枝切割后轉接到新鮮的增殖培養基上進行增殖培養，每隔15～20天更換1次新鮮增殖培養基；葉片離體再生培養，包括外植體的選取和葉片不定芽的誘導；外植體的選取：選用增殖誘導的嫩葉作為外植體；葉片不定芽的誘導：切取距葉柄2/3的幼嫩葉片，近軸面朝上平放，并接種于葉片不定芽誘導培養基中，先進行黑暗培養5～8天，再進行正常光照培養。作為進一步優選技術方案，所述的消毒處理是將采集的枝條去掉葉片，并保留葉柄，剪成6～8cm帶腋芽的莖段；將莖段用流動水沖洗20～40min，用質量濃度為0.08％～0.2％的洗滌劑溶液浸泡3～10min，再用流動水沖洗20～40min；隨后用體積比為75％的酒精浸泡10～30s，再用體積分數為10％～30％的次氯酸鈉浸泡20～40min，用無菌水沖洗2～5次，每次1～4min，瀝干水分，備用。作為進一步優選技術方案，所述初代培養、增殖培養和葉片不定芽的誘導的正常光照培養條件均是，培養溫度為22～28℃，光照強度為2000～3000lx，光照時間為12～18h/d。作為進一步優選技術方案，所述葉片離體再生培養還包括生根培養，將不定芽的小苗接種到生根培養基中進行生根培養；優選地，所述生根培養基包含：改良1/2wpm培養基+0.5～2mg/liba+15～40g/l蔗糖，ph為5.2～5.4；優選地，所述生根培養基為液體培養基，將液體培養基放置于穴盤式生根裝置中進行生根培養；所述穴盤式生根裝置包括托盤和穴盤，所述托盤內設置有用于容納液體培養基的第一腔體，所述穴盤設置于所述第一腔體內，所述穴盤上設置有多個呈陣列布置的穴孔，在每個所述穴孔內放入一顆或多顆不定芽的小苗進行生根培養。根據本發明的另一個方面，本發明還提供以上所述的藍莓組織培養的再生培養基在培養藍莓布里吉塔方面的應用。與現有技術相比，本發明的有益效果在于：1、本發明的提供的藍莓組織培養的再生培養基，包括初代培養基、增殖培養基和葉片不定芽誘導培養基，各階段培養基中，采用的是改良wpm培養基，即將wpm培養基中的cacl2·2h2o替換為糖醇鈣，從而有效減少氯離子對藍莓生長的不利影響，而且還極大滿足植物生長對鈣元素的需求。同時，本發明的激素種類和配比合理，尤其在葉片不定芽誘導培養基中，采用tdz代替現有技術中常用的zt或naa，不僅誘導效率高，不定芽的分化率高，而且成本低，大大節約了組培成本，為企業創造更大的經濟價值。2、本發明提供的藍莓葉片離體再生的培養方法，操作簡便，針對性強、適應性好，成本低廉，周期短，有效提高了愈傷組織的誘導率和不定芽的分化率；建立了穩定高效的藍莓葉片再生體系，進而為建立藍莓遺傳轉化體系提供了植株培養技術上的有利準備。3、本發明提供的藍莓組織培養的再生培養基在培養藍莓布里吉塔方面的應用，以填補現有技術還沒有專門針對“布里吉塔”組織組織培養快繁而試驗的再生培養基配方及外源植株激素種類的空白，為更好的推廣藍莓“布里吉塔”奠定堅實的基礎。具體實施方式下面將結合實施方式和實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施方式和實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。需要說明的是，本發明中的英文字母縮寫以及單位符號等的表示，均為本為本領域技術人員所公知的，均按常規理解即可，如無特殊說明，均為常規表達方式，例如wpm為woodplantmedium，代表木本植物用培養基；zt為zeatin，代表玉米素；h/d為hour/day，代表小時/天。根據本發明的一個方面，本實施方式提供一種藍莓組織培養的再生培養基，包括初代培養基、增殖培養基和葉片不定芽誘導培養基；初代培養基包含：改良wpm培養基+0.5～2mg/l6－ba+15～40g/l蔗糖+5～15g/l植物凝膠，ph為5.2～5.4；增殖培養基包含：改良wpm培養基+0.5～2mg/lzt+15～40g/l蔗糖+5～15g/l植物凝膠，ph為5.2～5.4；葉片不定芽誘導培養基包含：改良wpm培養基+2～4mg/ltdz+15～40g/l蔗糖+5～15g/l植物凝膠，ph為5.2～5.4；其中，改良wpm培養基，是將wpm培養基中的cacl2·2h2o替換為糖醇鈣。本發明中的改良wpm培養基，是在已經報道的wpm培養基配方的基礎上，根據藍莓生長的特殊需要改進得到的。其中，所述的已經報道的wpm培養基配方典型但非限制的例如為：400mg/lnh4no3，556mg/lca(no3)2·4h2o，96mg/lcacl2·2h2o，900mg/lk2so4，170mg/lkh2po4，370mg/lmgso4·7h2o，0.25mg/lnamoo4·2h2o，22.4mg/lmnso4·h2o，8.6mg/lznso4·7h2o，0.25mg/lcuso4·5h2o，27.8mg/lfeso4·5h2o，37.3mg/lna2edta，100mg/l肌醇，0.5mg/l煙酸，0.5mg/l磷酸吡哆醇(vb6)，0.5mg/l磷酸硫胺素(vb1)，2.0mg/l甘氨酸。與原來的wpm培養基相比，本發明的改良wpm培養基將原有的cacl2·2h2o替換為糖醇鈣，ca(鈣)是構成細胞壁的一種成分，ca對細胞分裂、保護質膜不受破壞有顯著的作用，因此在培養基中需要添加大量的ca元素，現有的ca元素的提供方式，都是通過cacl2·2h2o提供。然而，cacl2·2h2o中含有cl(氯)離子，cl離子對于藍莓植物生長有一定的毒害或阻礙作用，不利于植物的生根，組織液中過量的cl離子的積累往往會造成危害。本發明將cacl2·2h2o替換為糖醇鈣，不僅極大滿足植物對ca元素的需求，而且減少cl離子的迫害作用。本發明提供的植物生長調節劑中：6－ba即6－芐基氨基嘌呤(6－benzylaminopurine)，具有促進細胞分裂，促進非分化組織分化，促進生物體內物質的積累，誘導芽的分化，促進側芽萌發，防止老化等作用，還能減少植物體內葉綠素的分解，具有抑制衰老、保綠等作用。本發明中的6－ba添加量為0.5～2mg/l，在一個具體實施方式中，可選的，6－ba添加量為0.5mg/l、1mg/l、1.5mg/l或2mg/l。zt即玉米素(zeatin)，是存在于高等植物的一種天然植物細胞分裂素，不僅促進側芽生長，刺激細胞分化(側端優勢)，促進愈傷組織和種子發芽，還能防止葉片老化，逆轉芽部受到的毒素傷害和抑制過度根部形成；高濃度的zt還能產生不定芽分化。本發明中的zt添加量為0.5～2mg/l，在一個具體實施方式中，可選的，zt添加量為0.5mg/l、1mg/l、1.5mg/l或2mg/l。tdz即噻苯隆(thidiazuron，又名脫葉靈)，具有很強的細胞分裂素活性(ctk)，它的ctk活性要比一般ctk高幾十倍至幾百倍；它可以促進植物芽的再生和繁殖，可以促進種子萌發，促進愈傷組織生長，延緩植物衰老；并且可以對其它的植物激素和生理活性物質的作用來調節植物的生長發育過程。本發明中的tdz添加量為2～4mg/l，在一個具體實施方式中，可選的，tdz添加量為2mg/l、2.5mg/l、3mg/l、3.5mg/l或4mg/l。蔗糖，是最為常用也是較好的碳源，可為細胞提供合成新化合物的碳骨架，為細胞的呼吸代謝提供底物與能源，能夠使得藍莓植株生長更健壯。本發明中的蔗糖添加量為15～40g/l，在一個具體實施方式中，可選的，蔗糖添加量為15g/l、20g/l、25g/l、30g/l、35g/l或40g/l。植物凝膠，是從假單胞菌分泌而來的一種瓊脂的替代物，是葡萄糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖的混合物，具有無色、透亮和高韌性的特點，能夠克服傳統瓊脂在植物組織培養中的固有缺陷。將植物凝膠用于藍莓的組織培養中能夠使培養基的酸堿度更加穩定，藍莓植株生長的更好。本發明中的植物凝膠添加量為5～15g/l，在一個具體實施方式中，可選的，植物凝膠添加量為5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l或15g/l。本發明的培養基ph為5.2～5.4，藍莓組織培養對ph值的要求比較嚴格，過高或過低都會對植株生長和生根造成影響，因此要精準調節ph值。其ph值優選為5.2，也可以為5.3或5.4。需要注意的是，各培養基的配制過程中，在培養基中加入各激素、蔗糖和植物凝膠，調節ph值，121℃高壓滅菌20min，備用；尤為注意的是，zt須在60℃以下超凈工作臺中加入。與現有技術相比，本發明的藍莓組織培養的再生培養基，采用改良wpm培養基，針對性強，適應性好，且各階段的激素種類選取與配比合理，使得植株生長健壯，尤其是在葉片不定芽誘導培養基中，采用tdz代替現有技術中常用的zt或naa，有效提高了愈傷組織的誘導率和不定芽的分化率，而且成本低，效果好，經濟效益好。此外，在初代培養基、增殖培養基和葉片不定芽誘導培養基中，分別采用6－ba、zt和tdz作為植物生長調節劑，三者配合使用，更適宜于藍莓“布里吉塔”品種的培育，使得誘導效率更高，育苗周期短，降低了成本，提高了苗木的繁殖效率。作為一種可選實施方式，各培養基的原料及其含量分別是：初代培養基包含：改良wpm培養基+1～1.5mg/l6－ba+20～30g/l蔗糖+5～10g/l植物凝膠，ph為5.2～5.3；增殖培養基包含：改良wpm培養基+1～1.5mg/lzt+20～30g/l蔗糖+5～10g/l植物凝膠，ph為5.2～5.3；葉片不定芽誘導培養基包含：改良wpm培養基+3～4mg/ltdz+20～30g/l蔗糖+5～10g/l植物凝膠，ph為5.2～5.3。作為一種可選實施方式，各培養基的原料及其含量分別是：初代培養基包含：改良wpm培養基+1mg/l6－ba+20g/l蔗糖+5g/l植物凝膠，ph為5.2；增殖培養基包含：改良wpm培養基+1mg/lzt+20g/l蔗糖+5g/l植物凝膠，ph為5.2；葉片不定芽誘導培養基包含：改良wpm培養基+4mg/ltdz+20g/l蔗糖+5g/l植物凝膠，ph為5.2。通過對各階段培養基中各附加量的用量的進一步調整和優化，從而進一步優化了本發明中植物激素等附加物的功效，使得效果更好，更有益于植物的生長。作為一種可選實施方式，所述改良wpm培養基包括大量元素和微量元素；所述大量元素包括(nh4)2so4、糖醇鈣、kh2po4、kno3和mgso4·7h2o；所述微量元素包括h3bo3、namoo4·2h2o、mnso4·h2o、znso4·7h2o和cuso4·5h2o。作為一種可選實施方式，所述改良wpm培養基包括元素a液、元素b液、元素c液、元素d液、元素e液和有機物；元素a液的組分及含量為：400mg/l(nh4)2so4，684mg/l糖醇鈣；元素b液的組分及含量為：6.2mg/lh3bo3，170mg/lkh2po4，0.25mg/lnamoo4·2h2o；元素c液的組分及含量為：190mg/lkno3；元素d液的組分及含量為：370mg/lmgso4·7h2o，22.3mg/lmnso4·h2o，8.6mg/lznso4·7h2o，0.25mg/lcuso4·5h2o；元素e液的組分及含量為：27.8mg/lfeso4·5h2o，37.3mg/lna2edta；有機物的組分及含量為：100mg/l肌醇，0.5mg/l煙酸，0.5mg/l磷酸吡哆醇(vb6)，0.5mg/l磷酸硫胺素(vb1)，2.0mg/l甘氨酸。本實施方式提供的改良wpm培養基，與原來的wpm培養基相比，將原來的wpm培養基中nh4no3400mg/l、ca(no3)2·4h2o556mg/l、cacl2·2h2o96mg/l和k2so4900mg/l四種組分去掉，而加入了(nh4)2so4400mg/l、糖醇鈣684mg/l、h3bo36.2mg/l和kno3190mg/l四種組分，原來的四種組分營養不均衡，n(氮)元素含量偏低，而且cl(氯)元素含量高，很不利于藍莓的生長，因此改良后添加糖醇鈣，有效減少cl元素對藍莓生長的毒害作用，同時充分提供藍莓生長所需要的ca(鈣)元素；此外，n元素能夠在(nh4)2so4中能夠充分提供，k(鉀)元素在kno3中能夠充分提供。因此，本實施方式提供的改良wpm培養基，更適合藍莓“布里吉塔”品種，營養成分均衡，適應性好，更有益于藍莓植物的生長，植物生長效果更好，而且母液的配置更加便利。根據本發明的另一個方面，本實施方式還提供一種使用以上所述的藍莓組織培養的再生培養基進行藍莓葉片離體再生的培養方法，所述方法包括以下步驟：外植體的選取與消毒處理：選用生長健壯的藍莓枝條作為外植體，對外植體進行消毒處理；初代培養：將消毒后的藍莓莖段切成2～3cm的莖段，每段帶有1～2個腋芽，接種于初代培養基上進行初代培養，培養28～32天長出新枝；增殖培養：將初代培養長出的新枝切割后轉接到新鮮的增殖培養基上進行增殖培養，每隔5～8天更換1次新鮮增殖培養基；葉片離體再生培養，包括外植體的選取和葉片不定芽的誘導；外植體的選取：選用增殖誘導的嫩葉作為外植體；葉片不定芽的誘導：切取距葉柄2/3的幼嫩葉片，近軸面朝上平放，并接種于葉片不定芽誘導培養基中，先進行黑暗培養5～8天，再進行正常光照培養。本實施方式采用藍莓“布里吉塔”為葉片離體再生培養對象。外植體是指植物組織培養中的各種接種材料，可為植物的根、葉、莖、花藥等。本發明中選擇藍莓生長旺盛季節健壯、無病蟲害、樹形好的半木質化“布里吉塔”新梢為外植體。需要注意的是，初代培養中，將消毒后的莖段接種于初代培養基上時，莖段要平放，動作要快，盡量減少外植體與外界空氣的接觸時間，以減少褐變，提高成活率。培養28～32天長出新枝，例如可以為28天、29天、30天、31天或32天。增殖培養過程中，每隔15～20天更換1次新鮮增殖培養基，例如可以為15天、16天、17天、18天、19天或20天。在葉片離體再生培養過程中，先進行黑暗培養5～8天，例如可以為5天、6天、7天或8天，再進行正常光照培養，并且每隔15天更換1次新鮮培養基，30天后統計平均出愈率，90天后統計不定芽的平均誘芽數。本發明建立了穩定、高效的藍莓葉片離體再生體系，具有操作簡便，針對性強、適應性好，成本低廉，周期短的優點，有效提高了愈傷組織的誘導率和不定芽的分化率，為建立藍莓遺傳轉化體系提供了植株培養技術上的有利準備。作為一種可選實施方式，所述的消毒處理是將采集的枝條去掉葉片，并保留葉柄，剪成6～8cm帶腋芽的莖段；將莖段用流動水沖洗20～40min，用質量濃度為0.08％～0.2％的洗滌劑溶液浸泡3～10min，再用流動水沖洗20～40min；隨后用體積比為75％的酒精浸泡10～30s，再用體積分數為10％～30％的次氯酸鈉浸泡20～40min，用無菌水沖洗2～5次，每次1～4min，瀝干水分，備用。其中，帶腋芽的莖段為6～8cm，例如可以為6cm、7cm或8cm。用流動水沖洗20～40min，例如可以為20min、25min、30min、35min或40min。所述的洗滌劑溶液為現有的市售的任一種洗滌靈溶液或洗衣粉溶液；其質量濃度為0.08％～0.2％，例如可以為0.08％、0.1％、0.12％、0.15％、0.18％或0.2％；浸泡3～10min，例如可以為3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。所述的次氯酸鈉體積分數為10％～30％，例如可以為10％、15％、20％、25％或30％；浸泡20～40min，例如可以為20min、25min、30min、35min或40min。用無菌水沖洗2～5次，例如可以為2次、3次、4次或5次；每次1～4min，例如可以為1min、2min、3min或4min。可選的，本發明中的消毒處理過程為：將采集的枝條去掉葉片，并保留葉柄，剪成6～8cm帶腋芽的莖段；將莖段用流動水沖洗30min，用質量濃度為0.1％的洗滌劑溶液浸泡5min，再用流動水沖洗30min；隨后在超凈工作臺用體積比為75％的酒精浸泡20s，再用體積分數為30％的次氯酸鈉浸泡30min，用無菌水沖洗3次，每次2min，瀝干水分，備用。作為一種可選實施方式，所述初代培養、增殖培養和葉片不定芽的誘導的正常光照培養條件均是，培養溫度為22～28℃，光照強度為2000～3000lx，光照時間為12～18h/d。本發明中，可采用微電腦時控開關控制培養室每日光照時間。可選的，葉片離體再生培養中，黑暗培養時，溫度為18～22℃，濕度為60％～80％；正常光照培養的條件與初代培養的條件相同。本發明中各組織培養階段的培養培養溫度為25±3℃，優選為25℃，例如可以為22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃或28℃。光照強度為2000～3000lx，優選為2500lx，例如可以為2000lx、2100lx、2200lx、2300lx、2400lx、2500lx、2600lx、2700lx、2800lx、2900lx或3000lx。光照時間為12～18h/d，優選為16h/d，例如可以為12h/d、13h/d、14h/d、15h/d、16h/d、17h/d或18h/d。作為一種可選實施方式，所述葉片離體再生培養還包括生根培養，將不定芽的小苗接種到生根培養基中進行生根培養；優選地，所述生根培養基包含：改良1/2wpm培養基+0.5～2mg/liba+15～40g/l蔗糖，ph為5.2～5.4；優選地，所述生根培養基為液體培養基，將液體培養基放置于穴盤式生根裝置中進行生根培養；所述穴盤式生根裝置包括托盤和穴盤，所述托盤內設置有用于容納液體培養基的第一腔體，所述穴盤設置于所述第一腔體內，所述穴盤上設置有多個呈陣列布置的穴孔，在每個所述穴孔內放入一顆或多顆不定芽的小苗進行生根培養。更優選地，所述生根培養基包含：改良1/2wpm培養基+1～1.5mg/liba+20～30g/l蔗糖，ph為5.2～5.3；更優選地，所述生根培養基包含：改良1/2wpm培養基+1mg/liba+20g/l蔗糖，ph為5.2。本實施方式還提供了不定芽的生根培養，進而建立一個完整的藍莓“布里吉塔”組培快速繁殖技術，為大量推廣藍莓“布里吉塔”奠定更好的基礎。其中，改良1/2wpm培養基是指將改良wpm培養基中的無機鹽成分含量減半，其他成分不變。iba即吲哚丁酸，是組織培養中常用的植物生長調節劑，能夠促進植物生根，是促進發根能力較強的生長調節物質。所述生根培養的條件為：培養溫度為23～27℃，光照強度為3000lx，光照時間為12～16h/d，培養30～45天，生根率可達95％以上。生根培養溫度為23～27℃，優選為25℃，例如可以為23℃、24℃、25℃、26℃或27℃。光照時間為12～16h/d，優選為14h/d，例如可以為12h/d、13h/d、14h/d、15h/d或16h/d，可采用微電腦時控開關控制培養室每日光照時間。本實施方式在生根培養中采用的生根裝置為發明人自己研發的培養裝置，即穴盤式生根裝置。具體的講，該穴盤式生根裝置包括托盤和穴盤，托盤內設置有用于容納液體培養基的第一腔體，穴盤設置于第一腔體內，穴盤上設置有多個呈陣列布置的穴孔；沿穴盤的高度方向，穴盤具有相對應的第一表面和第二表面；穴孔沿高度方向的一端在第一表面上形成第一開口；穴盤的第二表面上設置有第二開口，且第二開口與穴孔連通；第一表面遠離第一腔體的底面，第二表面與第一腔體的底面之間有距離；當第一腔體內設置有液體培養基時，第二開口浸沒于液體培養基中。進一步地，該穴盤式生根裝置還包括設置有杯腔的濾紙杯；穴孔呈錐臺體，且穴孔貫穿穴盤，并在穴盤的第一表面形成第一開口，在第二表面形成第二開口，且第一開口的直徑大于第二開口的直徑；濾紙杯呈圓柱體，且圓柱體的直徑大于第二開口的直徑，且小于第一開口的直徑；濾紙杯搭設于穴孔內，且杯腔的底面位于穴孔內。進一步地，該穴盤式生根裝置還包括吸水濾紙；吸水濾紙與濾紙杯連接，且吸水濾紙通過第二開口與第一腔體內的生根營養液接觸。沿所述穴盤的高度方向，濾紙杯的高度高于第一開口。采用上述穴盤式生根裝置進行生根培養的優勢在于，穴盤上設置有多個穴孔，每個穴孔中可以放入一棵或者多棵不定芽，因而不定芽的培育密度增大，使得單位面積上不定芽的數量遠遠大于使用營養杯培育不定芽的數量，因而實現了可在有限面積內誘導大量不定芽生根，大大節省了育苗空間。將不定芽放置于穴孔內，由于第二開口浸沒于液體培養基中，因而液體培養基能夠為不定芽提供營養物質，且可以方便的通過調節液體培養基的濃度和數量對不定芽的營養供給，使得液體培養基液能夠滿足不定芽的正常生長；另外，不定芽的根可以通過第二開口進入穴盤和第一腔體的底面之間的空間，此空間一方面能夠提供不定芽生根所需要的的足夠的空間，另一方面，穴盤和第一腔體的底面之間的液體培養基能夠繼續為伸出第二開口的不定芽的生根提供營養物質。也就是說，本實施方式提供的生根裝置能夠在滿足不定芽正常生根生長的前提下，提高不定芽的培育密度，實現了在有限面積內誘導大量不定芽生根，節省空間，且操作方便，經濟效益好。根據本發明的另一個方面，本實施方式還提供一種以上所述的藍莓組織培養的再生培養基在培養藍莓布里吉塔方面的應用。目前所公開的培養基的配方都是針對不同的品種而言的，并不是一種培養基配方就適合所有的藍莓初代培養或再生培養。而本發明經過多次試驗，篩選出適合于藍莓“布里吉塔”組織培養的再生培養基配方?！安祭锛逼贩N原產于澳大利亞，樹勢強，樹體緊湊，酸甜適度，土壤適應性強，是同一時期品種中果味較好的品種；且在我國浙江等地的適應性強。目前已發表的相關文獻資料中，還沒有專門針對“布里吉塔”組織培養快繁而試驗的培養基配方。因此，布里吉塔的組織培養的培養基配方目前還屬空白；而本發明通過多次試驗，研究出最適合藍莓“布里吉塔”組織培養的再生培養基配方，填補了此項空白，為更好的推廣藍莓“布里吉塔”奠定堅實的基礎。下面結合具體實施例、對比例、實驗例和效果例，對本發明作進一步說明。實施例1－4一種藍莓組織培養的再生培養基，包括初代培養基、增殖培養基和葉片不定芽誘導培養基，實施例1－4各階段培養基的配方如表1所示。表1實施例1－4各階段培養基的配方其中，改良wpm培養基包括元素a液、元素b液、元素c液、元素d液、元素e液和有機物；元素a液的組分及含量為：400mg/l(nh4)2so4，684mg/l糖醇鈣；元素b液的組分及含量為：6.2mg/lh3bo3，170mg/lkh2po4，0.25mg/lnamoo4·2h2o；元素c液的組分及含量為：190mg/lkno3；元素d液的組分及含量為：370mg/lmgso4·7h2o，22.3mg/lmnso4·h2o，8.6mg/lznso4·7h2o，0.25mg/lcuso4·5h2o；元素e液的組分及含量為：27.8mg/lfeso4·5h2o，37.3mg/lna2edta；有機物的組分及含量為：100mg/l肌醇，0.5mg/l煙酸，0.5mg/l磷酸吡哆醇(vb6)，0.5mg/l磷酸硫胺素(vb1)，2.0mg/l甘氨酸。對比例1－3一種藍莓組織培養的再生培養基，包括初代培養基、增殖培養基和葉片不定芽誘導培養基，與實施例3不同的葉片不定芽誘導培養基，其余均與實施例3相同。對比例1－3中，葉片不定芽誘導培養基中所采用的激素與實施例3不同，對比例1－3在葉片不定芽誘導培養基中所采用的激素種類及配比如表2所示。表2對比例1－3在葉片不定芽誘導培養基中所采用的激素種類及配比項目激素種類及配比對比例1zt4.0mg/l+naa0.5mg/l對比例2tdz2.0mg/l+naa0.5mg/l對比例3tdz4.0mg/l+naa0.5mg/l對比例4一種藍莓組織培養的再生培養基，包括初代培養基、增殖培養基和葉片不定芽誘導培養基，與實施例3不同的改良wpm培養基，其余均與實施例3相同。對比例4中，采用原有的wpm培養基，即將改良wpm培養基中的400mg/l(nh4)2so4、684mg/l糖醇鈣、6.2mg/lh3bo3和190mg/lkno3四種組分去掉，而加入nh4no3400mg/l、ca(no3)2·4h2o556mg/l、cacl2·2h2o96mg/l和k2so4900mg/l四種組分；其余組分含量不變。實驗例1一種藍莓葉片離體再生的培養方法，包括以下步驟：(1)外植體的選取與消毒處理：選擇藍莓生長旺盛季節健壯、無病蟲害、樹形好的半木質化“布里吉塔”新梢為外植體，對外植體進行消毒處理；消毒處理過程為：將采集的枝條去掉葉片，并保留葉柄，剪成6cm帶腋芽的莖段；將莖段用流動水沖洗30min，用質量濃度為0.1％的洗滌劑溶液浸泡5min，再用流動水沖洗30min；隨后在超凈工作臺用體積比為75％的酒精浸泡20s，再用體積分數為30％的次氯酸鈉浸泡30min，用無菌水沖洗3次，每次2min，瀝干水分，備用。(2)初代培養：將消毒后的藍莓莖段切成3cm的莖段，每段帶有2個腋芽，接種于初代培養基上進行初代培養，培養30天長出新枝；培養條件為，培養溫度為25℃，光照強度為2500lx，光照時間為16h/d。(3)增殖培養：將初代培養長出的新枝切割后轉接到新鮮的增殖培養基上進行增殖培養，每隔15天更換1次新鮮增殖培養基；培養條件為，培養溫度為25℃，光照強度為2500lx，光照時間為16h/d。(4)葉片離體再生培養，包括外植體的選取和葉片不定芽的誘導；外植體的選取：選用增殖誘導的嫩葉作為外植體；葉片不定芽的誘導：切取距葉柄2/3的幼嫩葉片，近軸面朝上平放，并接種于葉片不定芽誘導培養基中，先進行黑暗培養7天，再進行正常光照培養，正常光照培養的條件與初代培養的條件相同。本實驗例中，采用的是實施例3所述的藍莓組織培養的再生培養基。實驗例2－8與實驗例1不同的是，實驗例2－8所采用的藍莓組織培養的再生培養基分別為實施例1、2、4和對比例1－4所提供的再生培養基。具體培養方法與實驗例1均相同。實驗例9本實驗例中，葉片離體再生培養還包括生根培養，將不定芽的小苗接種到生根培養基中進行生根培養；生根培養的條件為：培養溫度為25℃，光照強度為3000lx，光照時間為16h/d，培養30天，生根率可達96.5％，根系發達，生根效果好，植株生長勢強，且生長均一。其中的生根培養基包含：改良1/2wpm培養基+1mg/liba+20g/l蔗糖，ph為5.2。實驗例10與實驗例9不同的是，本實施例中采用的生根裝置為穴盤式生根裝置，生根培養條件與實驗例9相同。該穴盤式生根裝置包括托盤和穴盤，托盤內設置有用于容納液體培養基的第一腔體，穴盤設置于第一腔體內，穴盤上設置有多個呈陣列布置的穴孔；沿穴盤的高度方向，穴盤具有相對應的第一表面和第二表面；穴孔沿高度方向的一端在第一表面上形成第一開口；穴盤的第二表面上設置有第二開口，且第二開口與穴孔連通；第一表面遠離第一腔體的底面，第二表面與第一腔體的底面之間有距離；當第一腔體內設置有液體培養基時，第二開口浸沒于液體培養基中。每個穴孔中可以放入1～4棵不定芽小苗，培養30天，生根率可達98.2％，根系發達，生長均一，培育密度增大，增強了生長勢強，提高了繁殖效率。效果例1分別對實驗例1－8的培養方法進行統計分析。觀察愈傷的生長情況，并統計誘導分化出的不定芽的出芽數以及愈傷組織的出愈率。外植體接種于葉片不定芽誘導培養基30天后統計平均出愈率，90天后統計不定芽的平均誘芽數，統計分析結果如表3所示。表3實驗例1～8的統計分析結果由表3可以看出，實驗例1提供的初代培養基、增殖培養基和葉片不定芽誘導培養基采用的是實施例3的配方，在該配方條件下進行的藍莓葉片離體再生的培養，能夠在短時期內有效促進離體外植體再生，其產生的不定芽除葉片傷口的愈傷組織上，并且在葉片表面也產生了一定數量不定芽，誘導效率高，出芽率高。而實驗例2－4分別采用了實施例1、2和4的培養基配方進行的藍莓葉片離體再生的培養，其在各階段的激素配比與ph值略有不同，對于愈傷組織生長和出芽率有一定的影響，但在本發明所限定的范圍內均能獲得較好的再生培養效果。實驗例5－7分別采用了對比例1－3的培養基配方進行的藍莓葉片離體再生的培養，其在葉片不定芽的誘導過程中采用了不同的激素，對于葉片不定芽的誘導卻得到了較差的效果。由此可見，植物生長調節物質作為再生培養基中的關鍵物質之一，起到了極為重要的生長調節作用。而本發明采用的tdz能夠在葉片傷口形成不定芽的過程中起到了積極的促進作用。實驗例8采用了對比例4的培養基配方進行的藍莓葉片離體再生的培養，其采用的是原有的wpm培養基，再生培養效果比本發明提供的改良wpm培養基效果差。由此可見，本發明提供的改良wpm培養基針對性更強，適應性更好，更有利于不定芽的分化。綜上，采用本發明提供的藍莓組織培養的再生培養基，針對性強，適應性好，各階段的激素種類選取與配比合理，使得植株生長健壯，尤其是在葉片不定芽誘導培養基中，采用tdz激素，能夠有效提高了愈傷組織的誘導率和不定芽的分化率。最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍。當前第1頁12