本發(fā)明涉及中藥資源開(kāi)發(fā)利用技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是一種利用暗紫貝母愈傷組織生產(chǎn)暗紫貝母總生物堿的方法。
背景技術(shù)：
暗紫貝母（fritillariaunibracteatahsiaoetk.c.hsia）系百合科多年生草本植物，是名貴藥材川貝母的主要基原植物之一。目前，以暗紫貝母干燥鱗莖為主要來(lái)源的川貝母是貝母中的佳品，習(xí)稱“松貝”，具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳的功效，是治療咳嗽的重要良藥。暗紫貝母在自然環(huán)境中生長(zhǎng)緩慢，周期長(zhǎng)，從種子萌發(fā)到長(zhǎng)成藥材，需要4-5年的時(shí)間，遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，由于長(zhǎng)期采挖，野生資源極度匱乏，面臨枯竭。為了解決暗紫貝母資源緊缺問(wèn)題，有大量研究集中于暗紫貝母組培快繁培養(yǎng)方面，期望通過(guò)鱗莖再生來(lái)增加種苗資源，實(shí)現(xiàn)規(guī)模化人工栽培，這在一定程度上縮短了生產(chǎn)周期，但面臨許多問(wèn)題，如組培苗馴化成功率不高，且種植區(qū)域受限等。隨著貝母生物堿成分研究的不斷發(fā)展，直接從貝母組培鱗莖或組培物中提取生物堿更具有優(yōu)勢(shì)，可以在短期內(nèi)繁殖大量材料來(lái)供提取生物堿，且不受時(shí)間和區(qū)域限制。
申請(qǐng)?zhí)枮椤?00910164379.9”的中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一種采用細(xì)胞團(tuán)塊懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)川貝母總生物堿的方法，該方法是將愈傷組織打碎后進(jìn)行培養(yǎng)生產(chǎn)川貝母，屬于發(fā)酵工程范疇，存在著培養(yǎng)復(fù)雜，過(guò)程不容易控制的問(wèn)題。并且，暗紫貝母與川貝母生物堿成分在質(zhì)與量上存在一定的差異，對(duì)暗紫貝母生物堿進(jìn)行組培生產(chǎn)研究具有重要意義，但目前未見(jiàn)相關(guān)利用暗紫貝母來(lái)生產(chǎn)貝母總生物堿的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種利用暗紫貝母愈傷組織生產(chǎn)暗紫貝母總生物堿的方法，本發(fā)明方法利用愈傷組織來(lái)制備貝母總生物堿，其具有生產(chǎn)周期短、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種利用暗紫貝母愈傷組織制制備暗紫貝母總生物堿的方法，步驟包括：
（1）愈傷組織的誘導(dǎo)：以實(shí)驗(yàn)室通過(guò)組織培養(yǎng)生產(chǎn)的鱗莖為外植體，選取幼嫩的鱗瓣片切成0.5cm的小塊，接種于ms+naa1-2mg/l+6-ba0.5-1mg/l+2,4-d1-1.5mg/l+瓊脂5g/l+蔗糖30g/l的培養(yǎng)基上，控制ph為5.8、培養(yǎng)室溫度為23±1℃、空氣相對(duì)濕度50%-60%、光照時(shí)間12小時(shí)/天、光照強(qiáng)度2000l條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)30-35天獲得到大量愈傷組織；
（2）增殖與生物堿積累培養(yǎng)：將步驟（1）中產(chǎn)生的愈傷組織切成0.8×0.8cm，接種至培養(yǎng)基ms+zt1.5-3mg/l+naa0-0.2mg/l+瓊脂4.5g/l+蔗糖30g/l的培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)溫度23±1℃、空氣相對(duì)濕度50%-60%、光照時(shí)間12小時(shí)/天、光照強(qiáng)度2000l條件下培養(yǎng)30-35d后獲得生物堿含量高的培養(yǎng)物；
（3）貝母生物堿含量測(cè)定：收集步驟（2）培養(yǎng)后的愈傷組織，置于干燥的濾紙上吸收水分，并放入烘箱中40℃烘干至恒重，以西貝母堿為對(duì)照，提取暗紫貝母生物堿，并檢測(cè)其含量。
本發(fā)明中，提取暗紫貝母的提取方法采用《中國(guó)藥典》（2005版）的操作方法。
本發(fā)明方法還提供一種利用上述方法制備的暗紫貝母總生物堿。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，利用本發(fā)明方法制備的暗紫貝母總生物堿在生物制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明利用暗紫貝母作為貝母總生物堿的提取原料，其愈傷組織具有繁殖快、增殖率高的特點(diǎn)，通過(guò)激素調(diào)控次生代謝產(chǎn)物積累，達(dá)到了快速生產(chǎn)暗紫貝母總生物堿的目的，其培養(yǎng)后的愈傷組織中西貝母堿百分含量高達(dá)0.32%，是藥典中規(guī)定的藥材標(biāo)準(zhǔn)含量的6倍多。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，貝母總生物堿產(chǎn)量高，適合工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1
一種利用暗紫貝母愈傷組織制制備暗紫貝母總生物堿的方法，步驟包括：
（1）愈傷組織的誘導(dǎo)：以實(shí)驗(yàn)室通過(guò)組織培養(yǎng)生產(chǎn)的鱗莖為外植體，選取幼嫩的鱗瓣片切成0.5cm的小塊，接種于ms+naa1-2mg/l+6-ba0.5-1mg/l+2,4-d1-1.5mg/l+瓊脂5g/l+蔗糖30g/l的培養(yǎng)基上，控制ph為5.8、培養(yǎng)室溫度為23±1℃、空氣相對(duì)濕度50%-60%、光照時(shí)間12小時(shí)/天、光照強(qiáng)度2000l條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)30-35天獲得到大量愈傷組織；
（2）增殖與生物堿積累培養(yǎng)：將步驟（1）中產(chǎn)生的愈傷組織切成0.8×0.8cm，接種至培養(yǎng)基ms+zt1.5-3mg/l+naa0-0.2mg/l+瓊脂4.5g/l+蔗糖30g/l的培養(yǎng)基中，控制培養(yǎng)溫度23±1℃、空氣相對(duì)濕度50%-60%、光照時(shí)間12小時(shí)/天、光照強(qiáng)度2000l條件下培養(yǎng)30-35d后獲得生物堿含量高的培養(yǎng)物；
（3）貝母生物堿含量測(cè)定：收集步驟（2）培養(yǎng)后的愈傷組織，置于干燥的濾紙上吸收水分，并放入烘箱中40℃烘干至恒重，磨成粉末過(guò)3號(hào)篩，取2g粉末加入40ml的三氯甲烷-甲醇（4:1）溶液進(jìn)行貝母生物堿的提取，過(guò)濾去渣定容至50ml。取2-5ml溶液，蒸干，加10ml三氯甲烷溶液，溶解待測(cè)。以西貝母堿為對(duì)照品（對(duì)照品溶液0.2mg/ml），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)紫外分光光度計(jì)依法測(cè)定供試品吸光度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品的含量，計(jì)算即得（《中國(guó)藥典》2,015）。測(cè)得步驟（2）培養(yǎng)后的愈傷組織中西貝母堿百分含量高達(dá)0.32%，是藥典中規(guī)定的藥材標(biāo)準(zhǔn)含量的6倍多。
以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。