本發(fā)明涉及農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種生物殺菌劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，人民對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的數(shù)量、質(zhì)量及其安全性提出了越來越高的要求。保障無公害、優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品的供給和實(shí)現(xiàn)資源的可持續(xù)利用是21世紀(jì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的最大挑戰(zhàn)。

水稻紋枯病是由立枯絲核菌(rhizoctoniasolanikühn)侵染引起的真菌性病害。但是，近年來，由于施肥水平的提高、密植栽培技術(shù)的推廣及高抗品種的缺乏，水稻紋枯病在我國(guó)的發(fā)生和危害有普遍加重的趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全國(guó)水稻紋枯病年發(fā)病面積達(dá)1300萬hm²，造成的產(chǎn)量損失一般為10％～20％，嚴(yán)重時(shí)稻株倒伏枯死，減產(chǎn)可達(dá)70％以上，已成為水稻生產(chǎn)的第一大病害。

水稻紋枯病嚴(yán)重威脅水稻的安全生產(chǎn)。長(zhǎng)期以來，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上防治水稻紋枯病主要依賴化學(xué)藥劑，如己唑醇、丙環(huán)唑、烯唑醇等。這不僅造成了嚴(yán)重的水田生態(tài)環(huán)境和水質(zhì)污染，而且增加了水稻中有毒化學(xué)物質(zhì)的殘留，對(duì)人類健康帶來嚴(yán)重威脅，“優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)”與“安全性”已成為水稻生產(chǎn)中十分突出的矛盾。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種生物殺菌劑及其應(yīng)用，本發(fā)明提供的生物殺菌劑高效、持久、無公害，能夠有效防治水稻病害。

本發(fā)明提供了一種生物殺菌劑，包括有效成分、生物殺菌劑可接受的輔料和水；

所述有效成分包括克里本類芽孢桿菌和井岡霉素。

優(yōu)選的是，所述的生物殺菌劑中克里本類芽孢桿菌的有效孢子量為2×10⁹～5×10⁹cfu/ml。

優(yōu)選的是，所述生物殺菌劑中井岡霉素的質(zhì)量百分含量為2～5％。

優(yōu)選的是，所述輔料包括分散劑。

優(yōu)選的是，所述分散劑包括亞甲基二萘磺酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈉、苯乙基酚聚氧乙烯硫酸鈉或壬基酚聚氧乙烯醚。

優(yōu)選的是，所述分散劑在生物殺菌劑中的質(zhì)量百分含量為1～3％。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述的生物殺菌劑的制備方法，包括以下步驟：

1)將克里本類芽孢桿菌和井岡霉素分別溶于水制成克里本類芽孢桿菌水劑和井岡霉素水劑；

2)將所述克里本類芽孢桿菌水劑、井岡霉素水劑和輔料混合，混合得到生物殺菌劑。

優(yōu)選的是，所述克里本類芽孢桿菌水劑中克里本來芽孢桿菌的濃度為5×10⁹～2×10¹⁰cfu/ml。

優(yōu)選的是，所述井岡霉素水劑中井岡霉素的質(zhì)量百分含量為4～10％。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述生物殺菌劑或上述技術(shù)方案所述制備方法制備得到的生物殺菌劑在防治水稻紋枯病中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種生物殺菌劑，包括有效成分、生物殺菌劑可接受的輔料和水；所述有效成分包括克里本類芽孢桿菌和井岡霉素。通過將克里本類芽孢桿菌和井岡霉素進(jìn)行復(fù)配，本申請(qǐng)的生物殺菌劑能夠有效防治水稻紋枯病，抑制病原真菌。本申請(qǐng)生物殺菌劑的使用，能夠大量引入有益微生物，使病原菌的生存環(huán)境得到惡化，高效、持久地控制水稻病害的流行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本申請(qǐng)生物殺菌劑的防治效果高達(dá)74.08％。

生物保藏證明

克里本類芽孢桿菌(paenibacilluskribbensis)，于2013年08月13日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，生物保藏編號(hào)為cgmccno.7996。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種生物殺菌劑，包括有效成分、生物殺菌劑可接受的輔料和水；

所述有效成分包括克里本類芽孢桿菌和井岡霉素。

本發(fā)明提供的生物殺菌劑包括有效成分克里本類芽孢桿菌。在本發(fā)明中，所述生物殺菌劑中克里本類芽孢桿菌的有效孢子量為2×10⁹～5×10⁹cfu/ml，更優(yōu)選為3×10⁹cfu/ml。本發(fā)明所述克里本類芽孢桿菌保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，生物保藏編號(hào)為cgmccno.7996。本發(fā)明對(duì)所述克里本類芽胞桿菌的制備方法沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的克里本類芽胞桿菌的制備方法即可，如采用申請(qǐng)?zhí)枮?01310643992.5的專利公開的克里本類芽胞桿菌的制備方法。

本發(fā)明的生物殺菌劑還包括有效成分井岡霉素。在本發(fā)明中，所述生物殺菌劑中井岡霉素的質(zhì)量百分含量為2～5％，更優(yōu)選為2.5％。本發(fā)明對(duì)所述井岡霉素的來源沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的井岡霉素的市售產(chǎn)品即可。

本發(fā)明提供的生物殺菌劑包括余量的生物殺菌劑可接受的輔料，本發(fā)明對(duì)所述輔料的種類沒有特殊的限定。如表面活性劑、增稠劑、消泡劑、抗凍劑、ph值調(diào)節(jié)劑、警戒劑和防腐劑等。

在本發(fā)明中，所述輔料包括分散劑。在本發(fā)明中，所述分散劑包括亞甲基二萘磺酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈉、苯乙基酚聚氧乙烯硫酸鈉或壬基酚聚氧乙烯醚。在本發(fā)明中，當(dāng)所述分散劑為亞甲基二萘磺酸鈉時(shí)，所述亞甲基二萘磺酸鈉在生物殺菌劑中的質(zhì)量百分含量為1％～3％，更優(yōu)選為1％。

在本發(fā)明中，所述生物殺菌劑包括余量的水。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述的生物殺菌劑的制備方法，包括以下步驟：

1)將克里本類芽孢桿菌和井岡霉素分別溶于水制成克里本類芽孢桿菌水劑和井岡霉素水劑；

2)將所述克里本類芽孢桿菌水劑、井岡霉素水劑和輔料混合，混合得到生物殺菌劑。

本發(fā)明將克里本類芽孢桿菌和井岡霉素分別溶于水制成克里本類芽孢桿菌水劑和井岡霉素水劑。在本發(fā)明中，所述克里本來芽孢桿菌水劑中克里本來芽孢桿菌的濃度為5×10⁹～2×10¹⁰cfu/ml，更優(yōu)選為6×10⁹。在本發(fā)明中，所述井岡霉素水劑中井岡霉素的質(zhì)量百分含量為4～10％，更優(yōu)選為5％。

得到克里本類芽孢桿菌水劑和井岡霉素水劑后，本發(fā)明將所述克里本類芽孢桿菌水劑、井岡霉素水劑和輔料混合，混合得到生物殺菌劑。在本發(fā)明中，所述混合優(yōu)選采用攪拌方式，所述攪拌的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為200～400rpm，更優(yōu)選為250～300rpm；所述攪拌的時(shí)間優(yōu)選為2～4h，更優(yōu)選為3h。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述生物殺菌劑或上述技術(shù)方案所述制備方法制備得到的生物殺菌劑在防治水稻紋枯病中的應(yīng)用。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種生物殺菌劑及其應(yīng)用做進(jìn)一步詳細(xì)的介紹，本發(fā)明的技術(shù)方案包括但不限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

克里本類芽孢桿菌一級(jí)種子液的制備：將保藏的克里本類芽孢桿菌菌種接種于裝有活化培養(yǎng)基的茄型瓶中，28℃培養(yǎng)12h進(jìn)行活化培養(yǎng)，完成菌種活化；活化后的克里本類芽孢桿菌菌種按照1％的接種量接種于克里本類芽孢桿菌一級(jí)液體培養(yǎng)基中，一級(jí)液體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：蔗糖3％、硝酸鈉0.15％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、氯化鉀0.05％、硫酸鐵0.002％，余量為水。克里本類芽孢桿菌一級(jí)液體培養(yǎng)的溫度為30℃，初始ph值為7.5，進(jìn)入培養(yǎng)24h內(nèi)按照15m³/h通氣量進(jìn)行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)24h后按照20m³/h的通氣量進(jìn)行通氣培養(yǎng)，光照培養(yǎng)30h后，停止培養(yǎng)，得到克里本類芽孢桿菌一級(jí)種子液。

克里本類芽孢桿菌二級(jí)種子液的制備：將得到的克里本類芽孢桿菌一級(jí)種子液以10％接種量接種于克里本類芽孢桿菌二級(jí)液體培養(yǎng)基中，二級(jí)液體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：蔗糖1.5％、葡萄糖1.5％、黃豆粉1.0％、硫酸銨0.05％、磷酸氫二鉀0.05％、氯化鈣0.1％，余量為水。二級(jí)液體培養(yǎng)的溫度為32℃，ph值為7.5，進(jìn)入培養(yǎng)24h內(nèi)，通氣量為150m³/h，培養(yǎng)24h后，通氣量為250m³/h，每小時(shí)攪拌2次，每次攪拌時(shí)間為15min，光照培養(yǎng)48h后，停止培養(yǎng)，得到克里本類芽孢桿菌二級(jí)種子液。

克里本類芽孢桿菌的制備：將得到的克里本類芽孢桿菌二級(jí)種子液以10％接種量接種于克里本類芽孢桿菌三級(jí)液體培養(yǎng)基中，三級(jí)液體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：葡萄糖2.5％、玉米粉1％、硫酸銨0.05％、磷酸氫二鉀0.05％、氯化鈣0.1％，余量為水。三級(jí)液體培養(yǎng)的溫度為30℃，ph值為7.5，進(jìn)入培養(yǎng)24h內(nèi)，通氣量為2000m³/h，培養(yǎng)24h后，通氣量為1000m3/h，每小時(shí)攪拌2次，每次攪拌時(shí)間為15min，光照培養(yǎng)65h后，停止培養(yǎng)，得到克里本類芽孢桿菌三級(jí)培養(yǎng)液，采用蝶式離心機(jī)在5000rpm條件下離心20min，得到上清液和濃縮液，將濃縮液經(jīng)噴霧干燥塔干燥，得到克里本類芽孢桿菌。

實(shí)施例2

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的井岡霉素水劑和6×10⁹cfu/ml的克里本類芽孢桿菌水劑，按照重量百分比1:1置于混合器中，加入分散劑nno亞甲基二萘磺酸鈉使其在生物殺菌劑中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％,所有物料在混合器中混合均勻后，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5％井岡霉素，3×10⁹cfu/ml克里本類芽孢桿菌的生物殺菌劑。

實(shí)施例3

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的井岡霉素水劑和8×10⁹cfu/ml的克里本類芽孢桿菌水劑，按照重量百分比1:1置于混合器中，加入分散劑nno亞甲基二萘磺酸鈉使其在生物殺菌劑中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％,所有物料在混合器中混合均勻后，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％井岡霉素，4×10⁹cfu/ml克里本類芽孢桿菌的生物殺菌劑。

實(shí)施例4

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的井岡霉素水劑和9×10⁹cfu/ml的克里本類芽孢桿菌水劑，按照重量百分比1:2置于混合器中，加入分散劑nno亞甲基二萘磺酸鈉使其在生物殺菌劑中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％,所有物料在混合器中混合均勻后，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％井岡霉素，6×10⁹cfu/ml克里本類芽孢桿菌的生物殺菌劑。

實(shí)施例5

生物殺菌劑抑制水稻紋枯病菌生長(zhǎng)的室內(nèi)毒力測(cè)定：

在無菌操作臺(tái)上用無菌吸管吸取1ml各個(gè)濃度的生物殺菌劑，按照體積比1∶100的比例分別加入到已融化并冷卻至50℃左右的pda培養(yǎng)基中，充分混勻后分別倒入滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，制成系列質(zhì)量濃度的含殺菌劑的培養(yǎng)基(即井岡霉素的濃度分別為500ppm、100ppm、50ppm、10ppm、5ppm、1ppm；克里本類芽孢桿菌濃度分別為6×10⁶cfu/ml、3×10⁶cfu/ml、6×10⁵cfu/ml、3×10⁵cfu/、6×10⁴cfu/ml、3×10⁴cfu/ml，以加入等體積水的pda平板為對(duì)照。供試水稻紋枯病菌菌株在pda平板培養(yǎng)基上活化，用打孔器截取在pda培養(yǎng)基上培養(yǎng)的待用病原菌菌餅，菌絲面朝上接種于已凝固的含藥pda培養(yǎng)基中央，置于25℃下黑暗培養(yǎng)，待對(duì)照菌落直徑長(zhǎng)至大于平皿直徑2/3時(shí)，用卡尺測(cè)量菌落直徑(mm)。每個(gè)菌落用十字交叉法垂直測(cè)量直徑各1次，取其平均值。每處理重復(fù)4次，與對(duì)照比較計(jì)算各藥劑處理對(duì)菌落擴(kuò)展的生長(zhǎng)抑制率。

采用毒力曲線法，即以藥劑質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(x)，菌絲生長(zhǎng)抑制率的百分率值為縱坐標(biāo)(y)，計(jì)算繪制毒力曲線，求出三種藥劑毒力回歸方程(y＝a+bx)、相關(guān)系數(shù)(r)，進(jìn)而計(jì)算出ec50值。

復(fù)配劑的理論ec50＝單劑iec50*配比數(shù)+單劑iiec50*配比數(shù)

增效系數(shù)sr＝混合物的理論ec50/混合物的實(shí)測(cè)ec50

參考wadley公式(增效系數(shù)sr>1.5為增效作用，1.5>sr>1.0為相加作用，sr<1.0為拮抗作用)，計(jì)算出在各種配比中的類擴(kuò)展系數(shù)(sr)復(fù)配增效作用的大小。

表12.5％井岡霉素·3×10⁹cfu/ml克里本類芽孢桿菌生物殺菌劑抑制水稻紋枯病菌生長(zhǎng)的增效測(cè)定

由表1可以看出，被測(cè)的2.5％井岡霉素·3×10⁹cfu/ml克里本類芽孢桿菌生物殺菌劑增效系數(shù)為1.9，該復(fù)配組合表現(xiàn)出對(duì)抑制水稻紋枯病菌的生長(zhǎng)有顯著的增效作用。

實(shí)施例6

2.5％井岡霉素·3×10⁹cfu/ml克里本類芽孢桿菌生物殺菌劑防治水稻紋枯病的田間小區(qū)試驗(yàn)：

采用噴霧法防治水稻紋枯病。殺菌劑樣品分為以下五組：

1：5％井岡霉素水劑；

2：6×10⁹cfu/ml克里本類芽孢桿菌水劑(2015年6月生產(chǎn))

3：6×10⁹cfu/ml克里本類芽孢桿菌水劑(當(dāng)年生產(chǎn))

4：2.5％井岡霉素·3×10⁹cfu/ml克里本類芽孢桿菌水劑(前一年生產(chǎn))

5：2.5％井岡霉素·3×10⁹cfu/ml克里本類芽孢桿菌水劑(當(dāng)年生產(chǎn))

空白對(duì)照為：清水。

在水稻分蘗盛期施藥，按每畝用量?jī)端?0kg(相當(dāng)于稀釋100倍)均勻噴霧；每個(gè)處理設(shè)4次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，每小區(qū)30m²。施藥前調(diào)查病情基數(shù)，施藥后14d分別調(diào)查各個(gè)小區(qū)的紋枯病病情指數(shù)，計(jì)算防治效果。病情調(diào)查、分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及藥效計(jì)算參照《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則》(一)有關(guān)方法進(jìn)行，用duncan方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，比較各處理間的差異。

表22.5％井岡霉素·30億活芽孢/毫升克里本類芽孢桿菌水劑防治水稻紋枯病的田間藥效

由表2可以看出，2.5％井岡霉素·3×10⁹cfu/ml克里本類芽孢桿菌水劑施藥后14天對(duì)水稻紋枯病的防治效果為74.08％。該復(fù)配生物殺菌劑明顯好于5％井岡霉素水劑對(duì)水稻紋枯病的防治效果(64.37％)；同時(shí)明顯好于6×10⁹cfu/ml克里本類芽孢桿菌水劑對(duì)水稻紋枯病的防治效果(60.91％)。另外，前一年生產(chǎn)的6×10⁹cfu/ml克里本類芽孢桿菌水劑對(duì)水稻紋枯病的防效(54.82％)比當(dāng)年生產(chǎn)的同類產(chǎn)品的防效(60.91％)下降了6.09％，前一年生產(chǎn)的復(fù)配生物殺菌劑對(duì)水稻紋枯病的防效(67.42％)比當(dāng)年生產(chǎn)的同類產(chǎn)品的防效(74.08％)下降了6.66％，說明當(dāng)年生產(chǎn)的單劑水劑和復(fù)配生物殺菌劑藥效更佳。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。