本發明涉及植物生物
技術領域：
。更具體地說，本發明涉及一種促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法。
背景技術：
：羅漢果甜苷v屬于葫蘆烷型四環三萜類物質，本課題組前期根據羅漢果轉錄組數據，已推導出甜苷v可能的生物合成途徑。羅漢果甜苷v生物合成的前體物質是異戊烯二磷酸(ipp)和3,3-二甲基烯內基焦磷酸(dmapp)，二者是通過甲羥戊酸(mva)和甲基赤蘚糖醇磷酸化(mep)兩條途徑形成，mva途徑發生在胞質中，mep途徑發生在質體中。來源于上述兩途徑的ipp或dmapp經牻牛兒基焦磷酸合酶(gps)催化形成牻牛兒基焦磷酸(gpp)，ipp與gpp在法呢基焦磷酸合酶(fps)的催化作用下進而形成法呢基焦磷酸(fpp)，然后經角鯊烯合酶(ss)、角鯊烯環氧化酶(se)的催化形成2,3-氧化角鯊烯，葫蘆二烯醇合酶(cs)進一步催化形成葫蘆二烯醇，最后在cyp450酶和葡萄糖基轉移酶的作用下，形成羅漢果甜苷v。異戊二烯類物質的產生受到限速酶活性的嚴格調控，一直被認為在其生物合成途徑中起著重要的調控作用。作為異戊二烯途徑中的限速酶，cyp450酶基因的表達對羅漢果甜苷v的生物合成起著決定性作用。過表達cyp450酶基因，可以促進羅漢果甜苷v的積累；相反，如果抑制cyp450酶基因的表達，羅漢果甜苷v的產量將顯著降低。然而，cyp450酶基因是個超基因家族，本課題組前期研究發現，cyp89a143與羅漢果甜苷v的合成途徑有一定關聯。現有技術中未見有促進羅漢果cyp89a143基因表達來提高羅漢果中甜苷v含量的報道。技術實現要素：本發明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優點。本發明還有一個目的是提供一種通過茉莉酸甲酯處理羅漢果組培苗或其果實來促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，為有效促進羅漢果中甜苷v含量積累奠定基石。本發明還有一個目的是提供一種通過對羅漢果組培苗根系處理與花粉處理進一步促進羅漢果cyp89a143基因表達來提高羅漢果甜苷v含量的方法。為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，將羅漢果組培苗接種于誘導培養基中誘導培養至少30天，其中，誘導培養基中茉莉酸甲酯的濃度為50-400μmol/l。優選的是，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，所述誘導培養基中還包括基礎培養基，其配方為：ms+1.5mg/l6-ba+0.3mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。優選的是，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，所述誘導培養的條件為：相對濕度60-66％、光照強度1400lux、光照時間8h/d、溫度23±2℃。優選的是，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，誘導培養基的配制方法如下：將茉莉酸甲酯溶解于體積分數為2％的乙醇水溶液，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基礎培養基中，至茉莉酸甲酯濃度為50-400μmol/l，滅菌并冷卻至24-26℃。優選的是，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，所述誘導培養基中茉莉酸甲酯的濃度為250-300μmol/l。優選的是，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，將經誘導培養的羅漢果組培苗移栽后，待授粉后20-30天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑誘導液至表面滴水，連續噴灑5天，所述誘導液中含有濃度為50-400μmol/l的茉莉酸甲酯。優選的是，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，所述誘導液中含有濃度為150-200μmol/l的茉莉酸甲酯。優選的是，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，所述誘導培養基中還包括有0.15mg/l油菜素甾醇和0.03mg/l獨角金內酯。優選的是，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，所述組培苗經所述誘導培養之前經過根部處理，所述根部處理具體包括：將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2-3條粗壯根用無菌刀分別劃2-3個傷口，傷口深度小于0.2mm，再用經過預浸泡處理的玉米須包覆組培苗的根系，連續變溫處理10-12次，然后將組培苗上的玉米須去除，置于100-200高斯磁場中磁化處理1h；每次變溫處理均為將根系包覆有玉米須的組培苗先置于2℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min；所述預浸泡處理是指將玉米須經洗凈干燥后，于30-40℃水溫的預浸泡溶液浸泡處理15min，所述預浸泡溶液中含有1mg/l的納米氧化鋅、2g/l檸檬酸、2μg/l的天花粉、0.3g/l葡甘露聚糖，以磁化水為溶劑。優選的是，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，羅漢果組培苗移栽后，于盛花期早上6-7點摘取雄株2-3級側蔓上的花朵，取花粉，將花粉先置于花粉浸泡液中用頻率為3khz的超聲波振蕩器中攪拌處理2h，再經400目紗布過濾后，將紗布連同濾上物一起平攤置于帶蓋的玻璃器皿中，蓋上設有通氣孔，將帶蓋玻璃器皿連同花粉一起置于40℃恒溫干燥機中干燥8h，密封儲存于4℃下備用，授粉前將其取出置于相對濕度為85-90％的環境中吸濕24h；其中，所述花粉浸泡液中含有30g/l的蜂蜜、0.20mg/l油菜素甾醇、0.10mg/l視黃酸、0.03mg/l獨角金內酯，溶劑為磁化水。本發明的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法操作簡單，成本低，對環境友好，適于規模生產，具有較強的實用性和推廣價值，至少包括以下有益效果：1)本發明通過在羅漢果組培苗移栽前對其進行采用含有茉莉酸甲酯的誘導培養基中誘導培養，長期內以刺激并誘導羅漢果中cyp89a143基因的表達，從而促進cyp450酶基因過表達，促進羅漢果甜苷v的生物合成，提高其產量；2)本發明通過在羅漢果組培苗移栽后，于授粉后20-30d采用含有茉莉酸甲酯的誘導液處理羅漢果表面，在短期內進一步刺激并誘導羅漢果中cyp89a143基因的表達，從而促進促進羅漢果甜苷v的生物合成；3)本發明通過在誘導培養基中加入適宜量的油菜素甾醇和獨角金內酯，與茉莉酸甲酯起協調作用，進一步誘導刺激羅漢果組培苗表達cyp89a143基因；4)本發明通過對羅漢果組培苗誘導培養前進行根系處理，以去除弱根，劃傷刺激強根，并以連續變溫處理與磁場處理結合，刺激并脅迫羅漢果組培苗果實中甜苷v生物合成途徑中關鍵酶基因cyp89a143的高表達，從而進一步提高羅漢果甜苷v的含量；5)本發明通過對用于授粉的雄株花粉采用花粉浸泡液結合超聲振蕩處理，充分發揮花粉浸泡液中主要成分的作用，其中蜂蜜、磁化水結合超聲波的空化作用將花粉浸泡液中的油菜素甾醇、視黃酸和獨角金內酯充分包裹雄株花粉，強烈誘導并調控羅漢果雌株授粉后酶基因cyp89a143高表達，促進cyp89a143基因表達量積累，從而促進cyp450酶基因高表達，提高羅漢果甜苷v含量。本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。需要說明的是，下述實施方案中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。需要說明的是，本文所述的羅漢果組培苗為常規組培方法得到。6-ba為6-芐氨基腺嘌呤，iba為吲哚丁酸。實施例1：一種促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，將羅漢果組培苗接種于誘導培養基中誘導培養至少30天，其中，誘導培養基中茉莉酸甲酯的濃度為50μmol/l。其中，所述誘導培養基中還包括基礎培養基，其配方為：ms+1.5mg/l6-ba+0.3mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。其中，所述誘導培養的條件為：相對濕度60-66％、光照強度1400lux、光照時間8h/d、溫度23±2℃。誘導培養基的配制方法如下：將茉莉酸甲酯溶解于體積分數為2％的乙醇水溶液，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基礎培養基中，至茉莉酸甲酯濃度為50μmol/l，滅菌并冷卻至24-26℃。實施例2：一種促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，將羅漢果組培苗接種于誘導培養基中誘導培養至少30天，其中，誘導培養基中茉莉酸甲酯的濃度為400μmol/l。其中，所述誘導培養基中還包括基礎培養基，其配方為：ms+1.5mg/l6-ba+0.3mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。其中，所述誘導培養的條件為：相對濕度60-66％、光照強度1400lux、光照時間8h/d、溫度23±2℃。誘導培養基的配制方法如下：將茉莉酸甲酯溶解于體積分數為2％的乙醇水溶液，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基礎培養基中，至茉莉酸甲酯濃度為400μmol/l，滅菌并冷卻至24-26℃。實施例3：一種促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，將羅漢果組培苗接種于誘導培養基中誘導培養30天，其中，誘導培養基中茉莉酸甲酯的濃度為300μmol/l。其中，所述誘導培養基中還包括基礎培養基，其配方為：ms+1.5mg/l6-ba+0.3mg/liba+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。其中，所述誘導培養的條件為：相對濕度60-66％、光照強度1400lux、光照時間8h/d、溫度23±2℃。誘導培養基的配制方法如下：將茉莉酸甲酯溶解于體積分數為2％的乙醇水溶液，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基礎培養基中，至茉莉酸甲酯濃度為300μmol/l，滅菌并冷卻至24-26℃。實施例4：在實施例3的基礎上，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，將經誘導培養的羅漢果組培苗移栽后，待授粉后20-30天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑誘導液至表面滴水，連續噴灑5天，所述誘導液中含有濃度為50μmol/l的茉莉酸甲酯。實施例5：在實施例3的基礎上，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，將經誘導培養的羅漢果組培苗移栽后，待授粉后20-30天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑誘導液至表面滴水，連續噴灑5天，所述誘導液中含有濃度為400μmol/l的茉莉酸甲酯。實施例6：在實施例3的基礎上，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，將經誘導培養的羅漢果組培苗移栽后，待授粉后20-30天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑誘導液至表面滴水，連續噴灑5天，所述誘導液中含有濃度為200μmol/l的茉莉酸甲酯。實施例7：在實施例3的基礎上，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，所述誘導培養基中還包括有0.15mg/l油菜素甾醇和0.03mg/l獨角金內酯。實施例8：在實施例6的基礎上，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，所述誘導培養基中還包括有0.15mg/l油菜素甾醇和0.03mg/l獨角金內酯。實施例9：在實施例3的基礎上，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，所述組培苗經所述誘導培養之前經過根部處理，所述根部處理具體包括：將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2-3條粗壯根用無菌刀分別劃2-3個傷口，傷口深度小于0.2mm，再用經過預浸泡處理的玉米須包覆組培苗的根系，連續變溫處理10-12次，然后將組培苗上的玉米須去除，置于100-200高斯磁場中磁化處理1h；每次變溫處理均為將根系包覆有玉米須的組培苗先置于2℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min；所述預浸泡處理是指將玉米須經洗凈干燥后，于30-40℃水溫的預浸泡溶液浸泡處理15min，所述預浸泡溶液中含有1mg/l的納米氧化鋅、2g/l檸檬酸、2μg/l的天花粉、0.3g/l葡甘露聚糖，以磁化水為溶劑。實施例10：在實施例6的基礎上，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，所述組培苗經所述誘導培養之前經過根部處理，所述根部處理具體包括：將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2-3條粗壯根用無菌刀分別劃2-3個傷口，傷口深度小于0.2mm，再用經過預浸泡處理的玉米須包覆組培苗的根系，連續變溫處理10-12次，然后將組培苗上的玉米須去除，置于100-200高斯磁場中磁化處理1h；每次變溫處理均為將根系包覆有玉米須的組培苗先置于2℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min；所述預浸泡處理是指將玉米須經洗凈干燥后，于30-40℃水溫的預浸泡溶液浸泡處理15min，所述預浸泡溶液中含有1mg/l的納米氧化鋅、2g/l檸檬酸、2μg/l的天花粉、0.3g/l葡甘露聚糖，以磁化水為溶劑。實施例11：在實施例8的基礎上，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，所述組培苗經所述誘導培養之前經過根部處理，所述根部處理具體包括：將組培苗根系中根長小于最長根長度1/4的短根剪除，再將2-3條粗壯根用無菌刀分別劃2-3個傷口，傷口深度小于0.2mm，再用經過預浸泡處理的玉米須包覆組培苗的根系，連續變溫處理10-12次，然后將組培苗上的玉米須去除，置于100-200高斯磁場中磁化處理1h；每次變溫處理均為將根系包覆有玉米須的組培苗先置于2℃下貯存1min，再置于25℃下貯存5min；所述預浸泡處理是指將玉米須經洗凈干燥后，于30-40℃水溫的預浸泡溶液浸泡處理15min，所述預浸泡溶液中含有1mg/l的納米氧化鋅、2g/l檸檬酸、2μg/l的天花粉、0.3g/l葡甘露聚糖，以磁化水為溶劑。實施例12：在實施例6的基礎上，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，羅漢果組培苗移栽后，于盛花期早上6-7點摘取雄株2-3級側蔓上的花朵，取花粉，將花粉先置于花粉浸泡液中用頻率為3khz的超聲波振蕩器中攪拌處理2h，再經400目紗布過濾后，將紗布連同濾上物一起平攤置于帶蓋的玻璃器皿中，蓋上設有通氣孔，將帶蓋玻璃器皿連同花粉一起置于40℃恒溫干燥機中干燥8h，密封儲存于4℃下備用，授粉前將其取出置于相對濕度為85-90％的環境中吸濕24h；其中，所述花粉浸泡液中含有30g/l的蜂蜜、0.20mg/l油菜素甾醇、0.10mg/l視黃酸、0.03mg/l獨角金內酯，溶劑為磁化水。實施例13：在實施例11的基礎上，所述的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，羅漢果組培苗移栽后，于盛花期早上6-7點摘取雄株2-3級側蔓上的花朵，取花粉，將花粉先置于花粉浸泡液中用頻率為3khz的超聲波振蕩器中攪拌處理2h，再經400目紗布過濾后，將紗布連同濾上物一起平攤置于帶蓋的玻璃器皿中，蓋上設有通氣孔，將帶蓋玻璃器皿連同花粉一起置于40℃恒溫干燥機中干燥8h，密封儲存于4℃下備用，授粉前將其取出置于相對濕度為85-90％的環境中吸濕24h；其中，所述花粉浸泡液中含有30g/l的蜂蜜、0.20mg/l油菜素甾醇、0.10mg/l視黃酸、0.03mg/l獨角金內酯，溶劑為磁化水。為了說明本發明的技術效果，本發明的申請人針對不同方法或實施例得到的羅漢果果實，針對cyp89a143基因表達量以及甜苷v含量進行測定，具體方法以及結果如下。1、cyp89a143基因表達量測定方法：利用abi7500實時熒光定量pcr儀，采用qrt-pcr檢測cyp89a143基因的表達。步驟一、樣品前處理：采集羅漢果果實，挑取果肉，切成2-4mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃備用。步驟二、先采用改良trizol法提取羅漢果果實總rna；步驟三、將rna反轉錄為cdna的反應體系為rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反應條件為37℃(15min)→85℃(5s)→4℃；步驟四、采用primerpremier5.0軟件設計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中，cyp89a143引物序列為：fp：gataagaatgcggccgcatggaagcttgggttactgctt，rp：cgagctcttagttagagatgtctcttgga；內參基因用ubq5，序列為fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc；步驟五、qrt-pcr反應體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl；反應條件為95℃(30s)，接著進行40個cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。2、羅漢果甜苷v含量：采用高效液相色譜法，具體方法參考《廣西中醫學院學報》第2007年04期上發表的“hplc測定羅漢果中羅漢果甜苷v的含量”一文。對比例1：以實施例1-3的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，將誘導培養基中茉莉酸甲酯的濃度依次設定為：0、50、100、150、200、250、300、400μmol/l，對比研究在誘導培養時間為30天時誘導培養基中茉莉酸甲酯的濃度對羅漢果cyp89a143基因表達量和甜苷v含量(質量百分數)的影響，結果見表1。表1誘導培養基中茉莉酸甲酯濃度對羅漢果cyp89a143基因表達量和甜苷v含量的影響茉莉酸甲酯的濃度μmol/l050100150200250300400cyp89a143基因表達量14.27.710.812.514.214.914.0甜苷v含量/(w/w％)0.731.061.401.741.992.162.232.15注：誘導培養基中不同茉莉酸甲酯濃度處理的羅漢果果實cyp89a143基因表達量以未經茉莉酸甲酯濃度處理方法得到的羅漢果果實cyp89a143基因表達量是1為參照；上述實驗數據均為上述每一個實施方案得到的20棵羅漢果果樹上任選其中5棵中得到的羅漢果果實進行平行試驗得到的。由表1可知，在誘導培養基中添加茉莉酸甲酯可以有效促進羅漢果果實cyp89a143基因的表達，且以250-300μmol/l時為最適宜濃度。對比例2：以實施例4-6的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，將誘導液中茉莉酸甲酯的濃度依次設定為：0、50、100、150、200、250、300、400μmol/l，對比研究誘導液中茉莉酸甲酯的濃度對羅漢果cyp89a143基因表達量和甜苷v含量的影響，結果見表2。表2誘導液中茉莉酸甲酯濃度對羅漢果cyp89a143基因表達量和甜苷v含量的影響茉莉酸甲酯的濃度μmol/l050100150200250300400cyp89a143基因表達量14.915.916.817.517.917.417.117.0甜苷v含量/(w/w％)2.232.352.432.482.512.452.422.40注：誘導培養基中不同茉莉酸甲酯濃度處理的羅漢果果實cyp89a143基因表達量以未經茉莉酸甲酯濃度處理方法得到的羅漢果果實cyp89a143基因表達量是1為參照；上述實驗數據均為上述每一個實施方案得到的20棵羅漢果果樹上任選其中5棵中得到的羅漢果果實進行平行試驗得到的。由表2可知，在誘導液中添加茉莉酸甲酯，于羅漢果苗木待授粉后20-30天，每天早、中、晚于羅漢果表面噴灑，可以進一步有效促進羅漢果果實cyp89a143基因的表達，且以誘導液中茉莉酸甲酯濃度為150-200μmol/l時為最適宜濃度。對比例3：對比實施例3、實施例6、實施例7、實施例8、實施例9、實施例10、實施例11、實施例12、實施例13的促進羅漢果cyp89a143基因表達的方法，測定羅漢果cyp89a143基因表達量和甜苷v含量，結果見表3。對照組設定為：以實施例3的基礎上，將誘導培養基中茉莉酸甲酯濃度設為0μmol/l，其他同實施例3。表3不同實施例方法對羅漢果cyp89a143基因表達量和甜苷v含量的影響注：誘導培養基中不同茉莉酸甲酯濃度處理的羅漢果果實cyp89a143基因表達量以未經茉莉酸甲酯濃度處理方法得到的羅漢果果實cyp89a143基因表達量是1為參照；上述實驗數據均為上述每一個實施方案得到的20棵羅漢果果樹上任選其中5棵中得到的羅漢果果實進行平行試驗得到的。實施例7與實施例8分別是在實施例3與實施例6的基礎上，于誘導培養基中增加了適量的油菜素甾醇和獨角金內酯，由表3可以看出，實施例7與實施例8分別相對實施例3與實施例6得到的羅漢果果實中cyp89a143基因表達量與甜苷v含量是明顯增加的；實施例9、實施例10、實施例11分別是在實施例3、實施例6與實施例8的基礎上，于誘導培養之前將組培苗經過根部處理，由表3可以看出，實施例9、實施例10、實施例11分別相對實施例3、實施例6與實施例8得到的羅漢果果實中cyp89a143基因表達量與甜苷v含量是顯著增加的。實施例12與實施例13分別是在實施例6與實施例11的基礎上，于移栽授粉前，對羅漢果雄花花粉進行處理，由表3可以看出，實施例12與實施例13分別相對實施例6與實施例11得到的羅漢果果實中cyp89a143基因表達量與甜苷v含量是顯著增加的。盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的實施例。當前第1頁12