專利名稱：棉鈴蟲顆粒體病毒增效蛋白應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用工程菌株Escherichia coli M15(pEHa)生產棉鈴蟲增效蛋白PHEn的方法，以及PHEn在農林業病蟲生物防治中的應用。
目前，已在9種顆粒體病毒、舞毒蛾(Lymantria dispar)NPV和4種痘病毒中發現了昆蟲病毒增效蛋白(Hashimoto，Y and B.G.Corsaro，etal.1991.J.Gen.Virol，722645-265l；Hayakawa，T.and J.H.Xu，et al.1996.Gene.177269-270).昆蟲病毒增效蛋白是病毒基因編碼的一種金屬蛋白酶，具有一個典型的金屬蛋白酶鋅-結合域HEXXH，位置十分保守，且對中腸圍食膜的降解作用受到金屬螯合劑的抑制。(Jongeneel，C.V.and J.Bouvier，et al.FEBS Lett.242211-214；Lepore，L.S and P.R.Poelvink，et al.J.lnvertbr.Path-ol.68131-140)。昆蟲病毒增效蛋白可以提高昆蟲的敏感性，加速核型多角體病毒NPV的感染進程，同時能提高蘇云金桿菌伴孢晶體對幼蟲的毒力(Corsaro B.G.and Guzen M.R.et al.1993Academic Press 127-145)。增效蛋白的作用機制有二種一種是增效蛋白能與中腸細胞膜上的特異位點結合，介導病毒襄膜與細胞質膜之間的融合，促進桿狀病毒進入宿主細胞內，從而增加病毒感染的效果。但增效蛋白與中腸細胞膜上的特異位點結合并不是增進病毒感染所必需的。另一種機制是增效蛋白通過降解腸粘蛋白IIM而破壞昆蟲幼蟲中腸圍食膜，使病毒粒子更容易進入中腸細胞，同時提高了某些必須穿透圍食膜而發生作用的生物殺蟲劑的效能(Wang P andHammer AD.1997.J.Gen.Viorl.783018-3089.)。
棉鈴蟲顆粒體病毒(HaGV)增效蛋白基因的ORF大小為2706bP，編碼含902個氨基酸，分子量為104.6KD的蛋白質。我們已經構建了含HaGV增效蛋白的基因3′端2.1Kb片段的工程菌株Escherichia coli M15(pEHa)。本發明的目的是提供一種利用該工程菌株生產棉鈴蟲顆粒體病毒增效蛋白的(PHEn)晶體方法，以及利用PHEn作為有效成分，用于病毒殺蟲劑、BT殺蟲劑、阿維菌素等生物殺蟲劑或利用生物殺蟲劑制備的復合生物殺蟲劑而提高殺蟲效果，或單獨用于轉基因抗蟲植物防治蟲害的方法。一、生產棉鈴蟲增效蛋白晶體PHEn方法1.PHEn的表達挑取工程菌株Escherichia coli M15(pEHa)單菌落于含100μg/mlAmpcillin和25μg/ml Kan amycin的25ml LB培養基中，37℃，200rpm過夜培養。活化菌液以1∶20接種含100μg Ampcillin和25μg/ml Kanamycin的500ml LB培養液中，繼續培養，當其濃渡OD600＝0.3時，加入IPIG至終濃渡1mmol/L，37℃誘導5h，收獲菌液，4000rpm離心10min，收集菌體沉淀。2.PHEn的提取和純化在細菌沉淀中加入2-5倍體積的超聲波處理液，(50mmol/L Tris-HClPH8.0-0.1mol/L NaCl-2mg/ml溶菌酶)，反復凍融3次，37℃，保溫1h，然后置于冰中用超聲波破碎細菌。置于光學顯微鏡高倍物鏡觀察，有大量晶體。處理液上30-60％蔗糖梯度，4000rpm離心40min，取出包涵體帶，用滅菌雙蒸水洗3次，收獲純化的PHEn晶體，4℃保存。3.PHEn的鑒定，采用SDS-PAGE電泳分析(1)制備樣品收集工程菌株Escherichia coli M15(pEHa)未誘導培養物和經IPTG誘導5h后培養物各1mL，經離心沉淀，收獲菌體，純化的PHEn晶體，用適量滅菌雙蒸水重懸。(2)上樣和電泳參照Sambrook“分子克隆手冊”制備10％分離膠和濃縮膠。在樣品中加等體積2×SDS凝膠加樣緩沖液，于100℃加熱3-5min變性。樣品上樣。以100V電泳至溴酚蘭進入分離膠，提高電壓至150V，當溴酚蘭到達底部前約1cm處結束電泳。(3)固定、染色和脫色剝膠后以5倍體積染液固定、染色過夜，收凝膠浸泡于脫色液中平緩搖動4h以上，其間更換脫色液4-5次。(4)結果分析脫色完全后即可觀察照像。PHEn的10％ SDS-PAGE結果見

圖1，工程菌株Escherichia coli M15(pEHa)表達了含增效蛋白C-端702個氨基酸，共720個氨基酸的融合蛋白，分子量為78.17×103D SDS-PAGE，結果顯示融合蛋白的分子量約為78KD。二、PHEn生物活性測定及其應用1.PHEn對昆蟲病毒的增效生物活性將AcNPV(苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒)、SeNPV(甜菜夜蛾核型多角體病毒)、HaNPV(棉鈴蟲核型多角體病毒)、DpCPV(松毛蟲質型多角體病毒)和純化的PHEn作系列稀釋并用血球計數板計數，以3齡不同靶昆蟲幼蟲作為供試蟲，設(1)NPV或CPV2.4×105IB/ml；(2)2.4×105IB/ml(NPV或CPV多角體)+1.2×103OB/ml(OBPHEn包涵體)；(3)2.4×105IB/ml+未誘導菌體蛋白1μg/μl；(4)105OB/ml(5)單蒸水。取3齡初幼蟲室溫下單頭飼養于24孔Costar細胞培養皿中，每孔加適量人工飼料，并加10μl上述各種處理夜于人工飼料表面，使其充分吸收，幼蟲取食48h后補加足量新鮮人工飼料，統計死亡和存活蟲數(見表1)，結果表明，PHEn對幼蟲不產生致死作用，可以提高AcNPV、SeNPV、HaNPV、SpltNPV、DpCPV對各自靶幼蟲感染死亡率平均提高20-30％，縮短LT50平均為1.8天以上。
表1PHEn對昆蟲病毒的增效活性
2.PHEn對Bt的增效生物活性將Bt菌株(16000μg/ml)作1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶6000，1∶8000稀釋成五個不同濃度，人工飼料添食感染2齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度30頭，3個重復，同時設立正常對照。根據統計結果，Bt對2齡棉鈴蟲幼蟲致死中濃渡LC50為0.652g/L，取該致死中濃度Bt稀釋液與1×103OB/ml(OB PHEn包涵體)復配，人工飼料添食感染2齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度40頭，3個重復，同時設立Bt對照，實驗結果表明PHEn提高Bt對2齡棉鈴蟲幼蟲死亡率為37.6％。3.PHEn對阿維菌素的增效生物活性將阿維菌素(1.8％乳油)作1∶3000，1∶6000，1∶9000，1∶12000稀釋成4個不同濃度，人工飼料添食感染2-3齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度40頭，3個重復，同時設立正常對照。根據統計結果，阿維菌素(1.8％孔油)對2-3齡棉鈴蟲幼蟲致死中濃渡LC50為1∶5800，取致死中濃度阿維菌素稀釋液與1×1030B/ml(OBPHEn包涵體)復配，人工飼料添食感染2-3齡棉鈴蟲幼蟲，每個稀釋度40頭，3個重復，同時，設立阿維菌素對照，實驗結果表明，PHEn提高阿維菌素(1.8％新油)對2-3齡棉鈴蟲幼蟲死亡率為29.73％。
圖面說明圖1，HaGV增效蛋白PHEn表達和純化M.分子量標準1、2、3、E.Coli M15(pQE30)蛋白4.純化晶體PHEn5、6、7、IPTG誘導Escherichia coli M15(pEHa)5h蛋白
權利要求
1.利用工程菌株Escherichia coli M15(pEHa)生產棉鈴蟲顆粒體病毒(HaGV)增效蛋白PHEn的方法。其特征在于將工程菌株Escherichia coli M15(pEHa)單菌落挑到內含100μg/ml的氨芐青霉素和25μlg/m卡那霉素的LB培養基中，37℃，200rpm過夜培養，以1∶20比例接種到含上述雙抗的500mlLB培養基中繼續培養，當其溶液達到OD600＝0.3時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷至終濃渡1mM，37℃，200rpm誘導表達5h，收獲菌液，4000rpm離心10min，收獲菌體沉淀，再經提取、純化獲得HaGV增效蛋白晶體(PHEn)。
2.權利要求所述方法生產的HaGV增效蛋白與昆蟲病毒、蘇云金桿菌、阿維菌素等生物殺蟲劑或利用生物殺蟲劑制備的復合生物殺蟲劑復合，用于農林業病蟲的生物防治；或單獨使用該增效蛋白于轉基因抗蟲植物防治蟲害。
全文摘要
本發明公開了利用基因工程生產的棉鈴蟲顆粒體病毒(HaGV)增效蛋白作為有效成分,提高病毒殺蟲劑、BT殺蟲劑、阿維菌素等生物殺蟲劑或利用生物殺蟲劑制備的復合生物殺蟲劑,或單獨用于轉基因抗蟲植物的防治蟲害方法。
文檔編號C12N9/50GK1384195SQ0111467
公開日2002年12月11日 申請日期2001年5月9日 優先權日2001年5月9日
發明者孟小林, 徐進平 申請人:深圳萬德福基因工程有限公司