專利名稱：抗核型多角體病毒的轉基因蠶及其產生方法
技術領域：
本發明涉及到抗核型多角體病毒的轉基因蠶。此外，本發明涉及到生產抗核型多角體病毒的轉基因蠶的方法。
背景技術：
在蠶業工場，蠶被核型多角體病毒(NPV)嚴重侵害。迄今為止，許多研究者進行著生產抗NPV蠶的研究工作，但是，至今無一取得成功。這是由于世界上現有的蠶都缺乏抗NPV基因。為了阻止這種病毒的侵害，對蠶卵孵化區及相關設備進行徹底消毒被鼓勵使用。然而，在養蠶場這樣的做法不但麻煩，而且造成了巨大的人力物力消耗，結繭成本昂貴，并成為了農場復雜化的因素之一。
NPV是具有至少50或更多個基因的大DNA型病毒。眾所周知，這些基因在宿主蠶細胞中增殖表達。已知其中若干的基因是病毒生長所必需的(Kool M，AhrensCH，Goldbach RW，Rohrmann GF，Vlak JM.(1994)Identification of genes involved inDNA replication of the Autographa californica baculovirus.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(23)11212-11216；Lu A，Miller LK.(1995)The roles of eighteen baculovirus lateexpression factor genes in transcription and DNA replication.J.Virol.69(2)975-982)。
近來，發展了一些利用轉座子或標記基因生產轉基因蠶的新方法(Tamura，T.(1999)Methods for producing transformed silkworms using transposons.Abstracts of the7th Conference on Insect Functions，p10-22；Horn，C.，B，Jaunich and E.A.Wimmer，(2000)Highly sensitive，fluorescent transformation marker for Drosophila transgenesis.Dev Genes Evol 210623-629；Horn，C.，and E.A.Wimmer，(2000)A versatile vetor setfor animal transgenisis Dev Genes Evol 210630-637；Thomas，J.L.，M.Da Rocha，A.Besse，B.Mauchamp and G.Chavancy，2002 3xP3-EGFP marker facilitates screening fortransgenic silkworm Bombyx mori L.from the embryonic stage onwards.Insect BiochemMol Biol 32247-253；Tamura，T.，Thibert，C.，Royer，C.，Kanda，T.，Abraham，E.，Kamba，M.，Komoto，N.，Thomas，J.-L.，Mauchamp，B.，Chavancy，G，Shirk，P.，Fraser，M.，Prudhomme，J.-C.and Couble，P.(2000)A piggyBac element-derived vector efficientlypromotes germ-line transformation in the silkworm Bombyx mori L.NatureBiotechnology 18，81-84；Berghammer，A.J.，Klingler and E.A.Wimmer，(1999)Auniversal marker for transgenic insects.Nature 402370-371；Tomita，M.，Sato，T.，Adachi，T.，Munetsuna，H.，Tamuara，T.，Kanda，T.，Yoshizato，K.(2001)Production of humancollagen gene-incorporated transgenic silkworm.Abstracts of the 24th Annual Meeting ofMolecular Biology Society of Japan)。這些方法使用DNA型piggyBac轉座子作為載體，使用綠色熒光蛋白(GFP)基因作為標記基因。由于這些方法能夠有效的生產重組體，因此被運用于多種實際應用，例如用于生產有用的蛋白(Tomita，M.，M..H.，SatoT，Adachi T，Hino R，Haysshi M，Shimizu K，Nakamura N，Tamura T，Yoshizato，K.，(2003)Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons.Nat.Biotechnol.21，52-56.)和新的纖維，以及培育被認為具有抗病毒特性的變種。因此，一部分這類研究已經著手進行。

發明內容
鑒于上述情形作出了本發明。本發明的目的是提供一種表現出抗NPV抗性的轉基因蠶及其生產的方法。更具體地說，要提供一種攜帶有編碼RNA分子的表達型DNA的NPV-抗性轉基因蠶，該RNA分子顯示出對于NPV增殖必需的基因(agene essential for proliferation of NPV in silkworms)的RNAi效應(RNAi effect)，以及這種蠶的生產方法。
本發明人進行了大量分析使之達到了上述目的。首先，發明人檢驗了是否能夠通過轉基因蠶生產抗NPV的蠶。更具體而言，以來源于病毒的基因作為模板人工合成能形成具有發卡式結構的mRNA的基因，并檢測攜帶有該基因的轉基因蠶中NPV的增殖情況。結果是，病毒繁殖被顯著抑制。
更具體地，本發明涉及表現出抗NPV抗性的轉基因蠶及其生產的方法。[1]-[17]是本發明的具體目的，描述如下。
表現出抗核型多角體病毒抗性的轉基因蠶，其中該蠶攜帶有編碼一種RNA分子的表達型DNA，該RNA分子顯示出對核型多角體病毒增殖所必需的基因的RNAi效應。
如[1]的轉基因蠶，其中編碼RNA分子的DNA是一種編碼具有發卡型結構的RNA分子的DNA。
如[2]所述的轉基因蠶，其中編碼具有發卡型結構的RNA分子的DNA是這樣一種DNA，其中編碼mRNA任一區域的有義RNA的有義編碼DNA以及與該有義編碼DNA互補的DNA通過接頭連接，使得所述有義編碼DNA及其互補DNA相互面向，其中所述mRNA編碼核型多角體病毒增殖所必需的基因。
如[1]-[3]任一項所述的轉基因蠶，其中所述核型多角體病毒增殖所必需的基因是lef1基因。
如[4]的轉基因蠶，其中編碼有義RNA的DNA是(a)或(b)的DNA(a)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA；(b)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA，其中一個或多個的核苷酸被取代，刪除，插入，和/或添加。
如[4]的轉基因蠶，其中編碼顯示出RNAi效應的RNA分子的DNA是包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的DNA。
一種生產表現出抗核型多角體病毒抗性的轉基因蠶的方法，該方法包括以下步驟(a)將編碼一種RNA分子的DNA轉入蠶卵，該RNA分子顯示出對核型多角體病毒增殖所必需的基因的RNAi效應；(b)從轉入了所述DNA的卵孵化的蠶中挑選出轉基因蠶。
制備抗核型多角體病毒的蠶的方法，其中該方法包括了在蠶細胞中表達編碼一種RNA分子的DNA的步驟，該RNA顯示出對核型多角體病毒增殖所必需的基因的RNAi效應。
如[7]或[8]的方法，其中編碼RNA分子的DNA是一種編碼具有發卡型結構的RNA分子的DNA。
如[9]所述的方法，其中編碼具有發卡型結構的RNA分子的DNA是這樣一種DNA，其中編碼mRNA任一區域的有義RNA的有義編碼DNA以及與該有義編碼DNA互補的DNA通過接頭連接，使得所述有義編碼DNA及其互補DNA相互面向，其中所述mRNA編碼核型多角體病毒增殖所必需的基因。
如[7]-[10]任一項方法，其中所述的核型多角體病毒增殖所必需的基因是lef1基因。
包含有編碼一種RNA分子的DNA的載體，該RNA分子顯示出對核型多角體病毒增殖所必需的基因的RNAi效應，其中所述的DNA被插入轉座子的末端反向重復序列之間并與啟動子功能性相連；所述的DNA包括編碼有義RNA的有義編碼DNA及其互補DNA，該有義RNA為編碼所述基因的mRNA任一區域的有義RNA；其中所述的有義編碼DNA與其互補DNA通過接頭連接使得它們相互面向。
如[12]的載體，所述的核型多角體病毒增殖所必需的基因是lef1基因。
如[13]的載體，其中編碼有義RNA的DNA是(a)或(b)的DNA(a)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA；(b)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA，其中一個或多個的核苷酸被取代，刪除，插入，和/或添加。
如[13]的載體，其中編碼顯示出RNAi效應的RNA分子的DNA是包含SEQID NO2的核苷酸序列的DNA。
試劑盒，其包含[12]-[15]任一項所述的載體以及具有編碼轉座酶的DNA的載體。
具有制備抗核型多角體病毒的蠶的試劑，該試劑含有[12]-[15]的任一項所述的載體，或者[16]的試劑盒。


圖1表示用于生產轉基因蠶的載體結構。P表示來源于病毒的SK18啟動子，lef表示與病毒復制有關的部分lef1基因(以箭頭表示基因的方向)，Fbp(A)是蠶絲心蛋白基因來源的多聚A信號，A3pGFP表示用于區分轉基因蠶的標記基因。在lef1的有義DNA和反義DNA之間存在長度為96個核苷酸的接頭。
圖2表示在具有抗病毒基因的轉基因蠶中的病毒繁殖。在將一定數量的病毒(每個個體105病毒多角體)施加予轉基因蠶(tg)和對照組后72小時和96小時后，測定血中的病毒數量。病毒數量是通過實時(real-time)PCR定量病毒DNA的方法進行測定。
具體實施例方式
本發明首次成功地通過誘導一種編碼RNA分子的DNA的表達生產了抗NPV的蠶，其中RNA分子顯示出了對NPV在蠶細胞中增殖所必需的基因的RNAi效應。
本發明是基于該研究，提供了一種表現出抗NPV抗性的轉基因蠶，該轉基因蠶攜帶有編碼RNA分子的表達型DNA，該RNA分子顯示出抗NPV增殖必需基因的RNAi效應。
在本發明中，“攜帶有編碼RNA分子的表達型DNA的轉基因蠶，該RNA分子顯示出對NPV增殖所必需的基因的RNAi效應”的含義不僅包括組成型表達該DNA的轉基因蠶，而且還包括在具體條件(如誘導型表達)下能夠表達該DNA的轉基因蠶。
本發明所述的編碼表現RNAi效應的RNA分子的DNA，包括了那些編碼代謝物表現RNAi效應的RNA分子的DNA(例如通過RNA鏈裂解得到的產品)。
本發明所述的編碼表現為RNAi效應的RNA分子的DNA，優選地是編碼具有發卡型結構的RNA分子的DNA。編碼具有發卡型結構的RNA分子的DNA的例子包括，但不限于，含有編碼mRNA任一區域的有義(或反義)RNA的有義(或反義)密碼子DNA之DNA，該mRNA編碼NPV的增殖必需基因；以及與該DNA互補的DNA通過接頭連接使得相互面向。
這里，“相互面向”意味著兩條序列彼此之間位于相互面對的方向。換句話說本發明的DNA具有的結構是，其具有的末端反向重復序列是通過用接頭連接編碼有義RNA的DNA形成的。更具體的說，當編碼有義RNA的DNA序列(雙鏈)是例如AGTC(有義鏈)::::
TCAG(反義鏈)上述通過接頭形成末端反向重復序列的、編碼有義RNA的DNA序列的結構可以表示為AGTC-LLL-GACT:::: ::::
TCAG-LLL-CTGA(這里“L”表示接頭的任意核苷酸，“:”表示氫鍵)本發明的DNA優選具有的結構是如上述的結構，即編碼靶基因mRNA任一區域的有義RNA的有義編碼DNA，和該DNA的互補DNA通過接頭使得它們相互面向地連接。“互補DNA”可以更具體的描述為編碼反義于上述的“靶基因mRNA任一區域”的RNA的DNA。因此，換句話說，本發明的DNA可以描述為具有這樣的結構，其中具有編碼反義于靶基因mRNA任一區域的RNA的反義編碼DNA與該DNA互補的DNA通過接頭以相對的(opposite)方向連接。
由于本發明的DNA具有在反向重復序列之間的接頭，那么本發明的DNA轉錄產物也具有包含在末端反向重復序列中的接頭的結構。而具有這樣結構的RNA分子通常在重復序列之間形成氫鍵并形成發卡結構。
本發明組成接頭的DNA長度并不特別加以限制，只需要其能夠使鄰近的重復序列形成氫鍵。然而，當不把內含子計算在內時，其長度范圍通常在幾個核苷酸(如1-10核苷酸)到大約100個核苷酸之間，更優選的是幾十個核苷酸(如60，70，80，或90個核苷酸)。
組成接頭的DNA核苷酸序列并不特別加以限制，可以是任意的核苷酸序列。并且，只要上述的反向重復序列之間能夠形成氫鍵，接頭也并非絕對需要。因此，本發明所述的DNA包括了缺乏接頭的情況。
在本發明所述的DNA中有義編碼DNA，或其互補DNA的長度，通常是1000個核苷酸或者更少，更優選的是大約500個核苷酸。
而且，在本發明中，在雙鏈RNA部分中的RNA堿基對不需要完全配對，事實上可以存在著不配對的位點。在一定程度內存在著的不配對位點并不影響RNA形成。
本發明所述的DNA可以由本領域技術人員使用通常的基因工程技術合成。例如，可以用過下述操作制備從lef1的ORF序列的5’末端第430位核苷酸上，以及從5’末端第526位核苷酸上，分別進行PCR擴增，將擴增產物以相對的方向(opposite orientations)連接在一起。
例如，本發明所述的NPV增殖必需基因包括了lef1基因，ie-1基因，和p143(DNA解旋酶)基因。這些基因的核苷酸序列已經公開于Accession NoNC_001962，lef1基因，ie-1基因，和p143基因分別是ORF6(GENE ID1488636)，ORF123(GENE ID1488755)，和ORF78(GENE ID1724488)(Sumiko Gomi，Kei Majima and SusumuMaeda，Journal of General Virology(1999)，80，1323-1337)。
本領域技術人員熟知病毒DNA很容易變異。因而，本發明所述的基因并不僅限于含有上述公開序列的基因，只要所述突變基因對于NPV增殖是必需的即可。
當lef1基因被選作NPV增殖必需基因，例如編碼RNA分子的DNA含有的有義編碼DNA包括了含有SEQ ID NO1序列的DNA，但不限于此。一個或多個核苷酸被取代，刪除，插入，和/或添加的含有SEQ ID NO1序列的DNA也同樣可以被利用。
包括一個或多個核苷酸的取代，刪除，插入，和/或添加的SEQ ID NO1核苷酸序列中的突變，不僅包括了自然突變還包括了人工突變。核苷酸序列的突變數量和突變位點不受限制，只要該核苷酸序列可以表達表現出對核型多角體病毒增殖所必需的基因的RNAi效應的RNA分子。通常，突變數量不超過總核酸的10％，優選不超過5％，更優選不超過1％。
當lef1基因被選作靶基因，例如編碼具有發卡式結構的RNA分子的DNA例子包括了含有SEQ ID NO2序列的DNA(位置1-430lef1位點有義序列，位置431-526接頭序列，位置527-956反義序列)，但不以此為限。
本發明生產轉基因蠶的方法將在實施例中描述；然而，本發明所述的轉基因蠶并不被限定為以實施例所述的方法生產的蠶。
例如，本發明的轉基因蠶能夠被這樣的方法生產將編碼RNA分子的DNA轉入蠶卵，其中RNA分子顯示出抗核型多角體病毒NPV增殖必需基因的RNAi效應，從攜帶所述DNA的卵孵化的蠶中挑選出轉基因蠶。
例如，將DNA轉入蠶卵如下實施將piggyBAC轉座子作為載體注射進發育早期的蠶卵(Tamura，T.，Thibert，C.，Royer，C.，Kanda，T.，Abraham，E.，Kamba，M.，Komoto，N.，Thomas，J.-L.，Mauchamp，B.，Chavancy，G.，Shirk，P.，Fraser，M.，Prudhomme，J.-C.and Couble，P.，2000，Nature Biotechnology 18，81-84)。
例如，含有位于轉座子末端反向重復序列之間的DNA的載體(Handler，A.M.，McCombs，S.D.，Fraser，M.J.，Saul，S.H.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(13)7520-5)，其中該DNA具有這樣的DNA，其編碼顯示出靶向NPV增殖所必需基因的RNAi效應的RNA，并功能性的連接到任意啟動子的下游，該載體和攜帶有編碼轉座子的DNA的載體(輔助載體)一起轉移入蠶卵。
在本發明中，“功能性連接”表示啟動子和DNA連接，使得轉錄因子和啟動子結合從而誘導位于啟動子下游的DNA表達。因而，只要DNA轉錄可以發生，那么在啟動子和該DNA之間可以有任意DNA序列。
例如，適合本發明使用的啟動子包括，但不限制為，可以在任意組織中表達的基因的啟動子，如SK18啟動子，熱休克蛋白基因的啟動子，和胞質肌動蛋白與tRNA基因的啟動子，異源基因啟動子系統如利用轉錄調控系統的GAL4/UAS系統，和在脂肪體(fat body)以及中腸中特異性表達的基因的啟動子。
進一步地，輔助載體的例子包括，但不限制為，pHA3PIG(Tamura，T.，Thibert，C.，Royer，C.，Kanda，T.，Abraham，E，Kamba，M.，Komoto，N.，Thomas，J.-L.，Mauchamp，B.，Chavancy，Shirk，P.，Fraser，M.，Prudhomme，J.-C.and Couble，P.，2000，NatureBiotechnology 18，81-84)，但不以此為限。
本發明所述的轉座子的例子包括piggyBac，但不以此為限，mariner和minos被使用(Shimizu，K.，Kanba，M.，Sonobe，H.，Kanda，T.，Klinakis，A.G.，Savakis，C.andTamura，T.(2000)Insect Mol.Biol.，9，217-281；wang W，Swevers L，Iatrou K.(2000)Insect Mol Biol 9(2)145-55)。
在本發明中，桿狀病毒載體也可以被用來生產本發明轉基因蠶(Yamao，M.，N.Katayama，H.Nakazawa，M.Yamakawa，Y.Hayashi et al.，1999，Genes Dev.13511-516)。
以下，詳細描述將DNA轉入蠶卵的方法；但是，本發明的將DNA轉入蠶卵的方法并不以此為限。例如，可以用一將DNA注射入蠶卵用針管將DNA直接轉入蠶卵。在優選的實施方案中，事先在蛋殼上用物理或化學方法打個孔，DNA就是通過這個孔轉入蠶卵。在這個實施方案中，用來通過這個孔將DNA注射入卵的插入管的插入角度應保持與蠶卵腹表面接近垂直。
在本發明中，在蛋殼上進行物理打孔的方法，例如是用針或微型激光器。優選地，使用針在蛋殼上打孔。針的制造材料、針的強度等，都不需要特別限定，只要該針能夠在蠶卵上打孔就可。本發明使用的針通常是用有一個尖端的桿狀針但是，并不只限定為該形狀。只要能在蠶卵上打孔，任何形狀的物體都可以采用。例如，本發明所述的“針”也包括了具有尖端的金字塔型物體，有尖端的圓錐物體。在本發明中，優選使用鎢針。本發明采用的針的粗細(直徑)打出的孔要能夠讓下述的毛細管穿過，因而針的粗細通常大約在2-20μm，或優選的是5-10μm。另外的，在蛋殼上以化學方法打孔的方法，可以采用化學物質，包括但不限于次氯酸。
在本發明中，打孔的位置不作特別限制，只要能使通過該孔注射DNA的插入管的插入角度保持與蠶卵腹表面接近垂直。打孔的位置優選地在卵的腹側表面(ventral surface)或其對側面，更優選的在腹側表面，甚至更優選略微朝著蠶卵腹側表面中央的背面末端(back end)。
本發明中，“接近垂直”意味著70°-120°更優選的是80°-90°。本發明中，“將發育為胚細胞的位置”通常在卵腹側貼近卵表面的位置(通常是在距卵表面0.01mm-0.05mm的位置)，優選是在卵的腹面中央，靠近卵表面位置的略微靠后端的位置。
本發明注射DNA采用的管子并不特別限定材料、強度、內直徑等；然而，在DNA注射管插入之前在蛋殼上用物理或化學方法打孔，優選管子的粗細(外直徑)應該要能夠穿過這個打開的孔。例如，這樣的管子的實例包括，但不限定為，玻璃毛細管。
在本發明中DNA轉移方法的優選實施方案，利用裝備了針和DNA注射管的機械手(manipulator)來執行以下步驟，在蠶卵上用物理或化學方法打孔，將DNA注射管穿過該孔插入蠶卵，其插入角度與蠶卵腹面接近垂直，注射DNA。通常，本發明優選使用包含以上述機械手作為組成部件的裝置來進行操作。
這樣的裝置的組成部件包括，解剖顯微鏡、光源、可移動平臺、用金屬零件固定到顯微鏡的粗機械手、固定在粗機械手上的微機械手、和一個可以調節DNA注射空氣壓力的注射器。注射器使用的壓力由氮罐提供，并使用腳踏開關來打開壓力閥。要注射的蠶卵固定在基質上，例如玻璃玻片，蠶卵的位置移動則使用可移動平臺控制。連接四個管子的控制器用來操作微機械手的玻璃毛細管。實際操作過程是，使用粗機械手將鎢針對準蠶卵，通過平臺操縱桿水平移動蠶卵而打孔。接著操作微機械手的控制器使玻璃毛細管的尖端導向到打孔的位置，再使用平臺操縱桿將毛細管插入蠶卵。在這個方案中，玻璃毛細管必須插入使之與蠶卵腹面垂直。打開腳踏開關注射DNA，再操作操縱桿拔出毛細管。使用速效粘合劑或類似物封閉該孔，在恒溫恒濕的孵卵器中照護蠶卵。本發明使用的裝置優選的是日本專利NO.1654050所述的裝置，或者是其的改進產品。
進一步，在本發明的具體方案中，被用作DNA轉移的蠶卵優選的固定在基底(substrate)上。適合本發明的基底例如包括玻片和塑料片，但不以此為限。在本發明的具體方案中，理想的情況是，在蠶卵的方向恰當放置后固定，使得DNA能夠精確的注射入將發育為胚細胞的蠶卵位置。進一步，在具體方案中，固定到基底上的蠶卵數量并不特別限定。當要操作多個蠶卵時，通過將其定向優選將蠶卵固定在基底上以使蠶卵的腹背放置方向應當一致。本發明可以采用固定蠶卵的方法有，例如，誘導蠶產卵在一種可購得的事先抹有水溶性膠水的紙(疏卵卡(loose egg cards))上，通過加水在紙上分開卵，然后把濕的卵在基底上排成列，風干。優選的以合適的方向把卵固定在玻片上。并且，可以使用雙面膠帶，粘合劑等類似物將卵固定在基底上。
檢查DNA是否被轉移入蠶卵的方法實例包括，例如，從卵中重提取注射的DNA并加以測定(Nagaraju，J.，Kanda，T.，Yukuhiro.K.，Chavancy，G，Tamura，T.，&Couble，P.(1996).Attempt of transgenesis of the silkworm(Bombyx mori L)by egg-injection offoreign DNA.Appl.Entomol.Zool.，31，589-598)，或者觀察注射入蠶卵的DNA的基因表達(Tamura，T.，Kanda，T.，Takiya，S.，Okano，K.，&Maekawa，H.(1990).Transientexpression of chimeric CAT genes injected into early embryos of the domesticatedsilkworm，Bombyx mori.Jpn.J.Gemet.，65，401-410)。
在本發明生產轉基因蠶的方法中，接下來的步驟涉及從轉入了本發明所述DNA的蠶卵孵化的蠶中挑選出轉基因蠶。例如，在本發明中，可以通過使用篩選標記物挑選出轉基因蠶。用于本發明的選擇標記，是本領域技術人員通常使用的標記，包括，但不限定為，熒光蛋白例如CFP，GFP(如A3GFP)，YFP，和DsRed。采用這些標記，可以使用熒光立體顯微鏡輕易地檢測出轉基因蠶。并且，由于熒光顏色的不同，可以同時使用多種標記。
本發明還進一步提供了用于上述方法的載體，及其試劑盒。具體地，本發明提供了含有編碼一種RNA分子的DNA的載體，該RNA分子顯示出對核型多角體病毒增殖所必需的基因的RNAi效應。在優選的具體方案中，所述的DNA被插入到轉座子的末端反向重復序列，與啟動子功能性地連接，并且包括編碼有義RNA的有義編碼DNA以及該DNA的互補DNA，所述有義RNA為編碼該基因的mRNA任一區域的有義RNA；所述有義編碼DNA及其互補DNA通過接頭相互面向地連接。例如這樣的載體包括，但不限定為，含有連接到如SK18等啟動子下游的DNA的載體，該DNA還插入到來源于piggyBac載體的轉座子末端反向重復序列(Tamura，T.，et al.，2000，Nature Biotechnology 18，81-84)，其中插入的DNA具有編碼有義(或反義)編碼DNA的DNA以及該DNA之互補的DNA，前者編碼NPV增殖必需基因的編碼mRNA的任一區域的有義(或反義)RNA，所述有義編碼DNA及其互補DNA通過接頭連接以使其相互面向。當lef1基因被選作為載體中的NPV增殖必需基因，含有前述序列的DNA被用作有義編碼DNA及編碼具有發卡式結構的RNA分子的DNA。本發明還提供了含有上述載體和具有編碼轉座子的DNA的載體(輔助載體)的試劑盒。例如輔助載體包括，但不限定為，pHA3PIG(Tamura，T.，et al.，2000，NatureBiotechnology 18，81-84)。并且，本發明提供了這些載體和試劑盒的用途。尤其是，本發明提供了作為產生抗NPV蠶的試劑的用途，該試劑含有本發明的載體或試劑盒作為活性成分。
本發明在產業上的用途是能通過產生攜帶重組病毒基因的轉基因蠶提供顯示出抗NPV的轉基因蠶。
生產顯示抗NPV蠶的極大益處是能夠避免蠶業工場中最嚴重的問題，即NPV的侵害。從而，這可以提高蠶品種生產的效率，節省農作勞動力，及生產高質量蠶絲。
本申請中引用的專利、專利申請和公開出版物在此引入作為參考。
實施例本發明可以參考以下實施例進行詳細解釋；然而，并不以此為限。
為了抑制病毒生長，將一種來源于病毒的基因用來重組生產可以制備具有發卡結構mRNA的基因。生產出的基因和載體的結構表示在圖1中。
lef1基因是與蠶中NPV的DNA復制有關的基因，也是病毒增殖所必需的基因。連接該基因，其中該基因轉錄方向已發生反轉，并用在培養細胞中表現強活性的SK18作為其啟動子。并且，可以用A3GFP基因作為標記基因以區分攜帶該基因的轉基因蠶，A3GFP可以在整個蠶體表達熒光蛋白，并可以很容易在熒光立體顯微鏡下分辨出攜帶該基因的個體。
將該載體DNA以及能夠表達具有將靶基因導入到目的基因組的效應的因子的DNA(輔助DNA)注射入發育早期的蠶卵中。飼養從卵中孵化出的幼蟲直到其發育為成體，然后獲得第二代。通過在熒光顯微鏡下觀察這些第二代幼蟲來鑒定整個蠶體發出熒光的個體。那些看起來是轉基因蠶的個體，將被繼續飼養并體系化。將一定數量的NPV多角體給予這些體系化的處于最后蟲齡期的轉基因蠶后72小時、96小時，通過實時PCR測定血中的病毒增殖。結果表明，在攜帶有如圖1所示基因的蠶中，病毒的增殖如圖2所示受到明顯抑制。
上述結果表明，攜帶通過使病毒基因重組所生產的基因的轉基因蠶的產生可以導致抗病毒型蠶的產生。
序列表<110>獨立行政法人農業生物資源研究所(NATIONAL INSTITUTE OF AGROBOLOGICALSCIENCES)<120>抗核型多角體病毒的轉基因蠶及其產生方法<130>MOA-A0408<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>430<212>DNA<213>Bombyx mori<400>1atgttattgt gcaattatac acagaagcgc gtcgacatga tgtgggacgc gattgcgtac 60aacgacagcc gcaagtacgc gttcatgacg gtcaacgcgc gctggattca cgccgacaaa120tattttgata ccgccgcaca attgtatagt tacattgtgc aaaacaaagt gtccgacgtg180cacgtcaaac cgttggacga cggcggcggc agggaatggg tcgtagacgc cgattacaag240aattatgttg acgaacacga tttaatgctg aaaatttaca ttggcgccac ggcgtttttg300ttgttttaca cggaagagaa cgtgtcaaga gtcatgtat accggcaaccg tggatttcac360ttgtggttaa aattcaccga caagtttaaa atcacgtccg ctcaaaatgt tcgcgtgcat420cggtaca agg 430<210>2<211>956<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的DNA序列<400>2atgttattgt gcaattatac acagaagcgc gtcgacatga tgtgggacgc gattgcgtac 60aacgacagcc gcaagtacgc gttcatgacg gtcaacgcgc gctggattca cgccgacaaa120tattttgata ccgccgcaca attgtatagt tacattgtgc aaaacaaagt gtccgacgtg180cacgtcaaac cgttggacga cggcggcggc agggaatggg tcgtagacgc cgattacaag240aattatgttg acgaacacga tttaatgctg aaaatttaca ttggcgccac ggcgtttttg300ttgttttaca cggaagagaa cgtgtcaaga gtcatgtata ccggcaaccg tggatttcac360ttgtggttaa aattcaccga caagtttaaa atcacgtccg ctcaaaatgt tcgcgtgcat420cggtacaagg tatgcggaat gtacaaacgt acggcctctc tcacacaatg cgcaaaactg480cccggctgaa tgcaatcact atccaacttt gcaggttttt cgaaggcctt gtaccgatgc540acgcgaacat tttgagcgga cgtgatttta aacttgtcgg tgaattttaa ccacaagtga600aatccacggt tgccggtata catgactctt gacacgttct cttccgtgta aaacaacaaa660aacgccgtgg cgccaatgta aattttcagc attaaatcgt gttcgtcaac ataattcttg720taatcggcgt ctacgaccca ttccctgccg ccgccgtcgt ccaacggttt gacgtgcacg780tcggacactt tgttttgcac aatgtaacta tacaattgtg cggcggtatc aaaatatttg840tcggcgtgaa tccagcgcgc gttgaccgtc atgaacgcgt acttgcggct gtcgttgtac900gcaatcgcgt cccacatcat gtcgacgcgc ttctgtgtat aattgcacaa taacat95權利要求
1.表現出抗核型多角體病毒抗性的轉基因蠶，其中該蠶攜帶有編碼一種RNA分子的表達型DNA，該RNA分子顯示出對核型多角體病毒增殖所必需的基因的RNAi效應。
2.如權利要求1所述的轉基因蠶，其中編碼RNA分子的DNA是一種編碼具有發卡型結構的RNA分子的DNA。
3.如權利要求2所述的轉基因蠶，其中編碼具有發卡型結構的RNA分子的DNA是這樣一種DNA，其中編碼mRNA任一區域的有義RNA的有義編碼DNA以及與該有義編碼DNA互補的DNA通過接頭連接，使得所述有義編碼DNA及其互補DNA相互面向，其中所述mRNA編碼核型多角體病毒增殖所必需的基因。
4.如權利要求1-3中任一所述的轉基因蠶，其中核型多角體病毒增殖所必需的基因是lef1基因。
5.如權利要求4所述的轉基因蠶，其中編碼有義RNA的DNA是(a)或(b)的DNA(a)含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA；(b)含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA，其中一個或多個的核苷酸被取代，刪除，插入，和/或添加。
6.如權利要求4所述的轉基因蠶，其中編碼顯示出RNAi效應的RNA分子的DNA是含有SEQ ID NO2的核苷酸序列的DNA。
7.一種產生表現出抗核型多角體病毒抗性的轉基因蠶之方法，該方法包括以下步驟(a)將編碼一種RNA分子的DNA轉入蠶卵，其中RNA分子顯示出對核型多角體病毒增殖所必需的基因的RNAi效應；和(b)從轉入了所述DNA的卵得到的蠶中篩選出轉基因蠶。
8.一種用于制備抗核型多角體病毒的蠶的方法，其中該方法包括了在蠶細胞中表達編碼一種RNA分子的DNA的步驟，該RNA顯示出對核型多角體病毒增殖所必需的基因的RNAi效應。
9.如權利要求7或8所述的方法，其中編碼RNA分子的DNA是一種編碼具有發卡型結構的RNA分子的DNA。
10.如權利要求9所述的方法，其中編碼具有發卡型結構的RNA分子的DNA是這樣一種DNA，其中編碼mRNA任一區域的有義RNA的有義編碼DNA以及與該有義編碼DNA互補的DNA通過接頭連接，使得所述有義編碼DNA及其互補DNA相互面向，其中所述mRNA編碼核型多角體病毒增殖所必需的基因。
11.如權利要求7-10任一項所述的方法，其中所述的核型多角體病毒增殖所必需的基因是lef1基因。
12.包含有編碼一種RNA分子的DNA的載體，該RNA分子顯示出對核型多角體病毒增殖所必需的基因的RNAi效應，其中所述的DNA被插入轉座子的末端反向重復序列之間并與啟動子功能性相連；所述的DNA包括編碼有義RNA的有義編碼DNA及其互補DNA，該有義RNA為編碼所述基因的mRNA任一區域的有義RNA；其中所述的有義編碼DNA與其互補DNA通過接頭連接使得它們相互面向。
13.如權利要求12所述的的載體，其中所述的核型多角體病毒增殖所必需的基因是lef1基因。
14.如權利要求13所述的載體，其中編碼有義RNA的DNA是(a)或(b)的DNA(a)含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA；(b)含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA，其中一個或多個的核苷酸被取代，刪除，插入，和/或添加。
15.如權利要求13所述的載體，其中編碼顯示出RNAi效應RNA分子的DNA是含有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的DNA。
16.試劑盒，其包含有權利要求12-15任一項所述的載體以及具有編碼轉座酶的DNA的載體。
17.一種用于制備抗核型多角體病毒蠶的試劑，該試劑含有權利要求12-15任一項所述的載體，或者權利要求16所述的試劑盒。
全文摘要
本發明的目的是提供一種表現出抗NPV抗性的轉基因蠶及其產生的方法。生產了攜帶有編碼一種RNA分子的表達型DNA的轉基因蠶，該RNA分子顯示出抗NPV增殖必需基因的RNAi效應。在這種轉基因蠶中對NPV增殖的研究表明這些病毒的增殖能夠被抑制。
文檔編號A61K35/66GK1706939SQ200510079259
公開日2005年12月14日 申請日期2005年5月30日 優先權日2004年5月28日
發明者田村俊樹, 小島桂, 神田俊男, 伴戶久德, 松井英雄, 町田順一, 桑原伸夫 申請人:獨立行政法人農業生物資源研究所