靈菌紅素在防控家蠶核型多角體病毒病中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一類小分子化合物靈菌紅素（Prodiginine，PG）抑制BmNPV的作用，以及在防控家蠶核型多角體病毒病中的應用。細胞試驗顯示，PG在0.01-0.8μg/L濃度范圍內可干擾BmNPV在細胞中的增殖，阻止病毒多角體形成；在1-300μg/L濃度范圍內可選擇性的導致感染BmNPV的家蠶細胞死亡，其死亡率超過97%；PG在上述使用范圍內對家蠶正常細胞不表現出毒性。個體試驗顯示，靈菌紅素在濃度范圍1-10mg/只經口添飼家蠶，能使核型多角體病毒病病蠶停止進食并提前死亡，易于淘汰染病病蠶，同時對健康個體不表現出毒性。利用靈菌紅素抑制BmNPV增殖及多角體的形成，同時具有加速核型多角體病毒病病蠶死亡的作用，防止并有效控制家蠶核型多角體病毒病的擴散。
【專利說明】靈菌紅素在防控家蠶核型多角體病毒病中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及獸用藥物領域，具體涉及靈菌紅素在防控家蠶核型多角體病毒病中的應用。
【背景技術】
[0002]養蠶業作為我國傳統養殖業，是多個地區農民的重要經濟收入來源。2011年，我國蠶繭產量為63.74萬噸，產值為218.7億元，絲綢工業產值為2037.9億元。家蠶密集飼養易感病，蠶病每年給養蠶業帶來的損失約占蠶業生產總產值的20%，其中病毒性蠶病占總損失的八成左右，尤其以家香核型多角體病毒mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)造成的血液型膿病危害最為嚴重。基于14個省91個縣1782個農戶的調查顯示，家蠶核型多角體病毒病近年來發生范圍廣，其中86.92%的農戶在養蠶過程中曾遭遇此病并造成大量減收(李建琴等.蠶業科學，2013，39 (2):355-364)，甚至導致部分農戶或一定養蠶區域絕產。
[0003]BmNPV屬桿狀病毒科，核型多角體病毒(NPV)屬，其整個生活史可分為出芽型病毒(BV)和包涵型病毒(0DV)，在感染末期的細胞核中可觀察到包被ODV的多角體形成。不同于其它類型的動物病毒，NPV通過宿主細胞微絲骨架在細胞內或細胞間進行快速移動，病毒接種Ih便可從細胞膜進入細胞核內，起始病毒基因的表達。其次，NPV采取不重復感染的策略進行快速傳播，即有大量病毒感染同一個宿主細胞時，絕大部分病毒通過直接出芽的方式在細胞間大量擴散，轉而感染相鄰細胞(Ohkawa等.Journal of Cell Biology, 2010,190 (2): 187-195)。此外，NPV還能通過昆蟲的血淋巴以及氣管系統在宿主各組織間迅速傳播。自然情況下，家蠶通過食下病毒多角體發生感染。NPV高效而迅速的感染特性使家蠶食入病毒多角體后在較短的時間內即可發展為全身感染。BmNPV增殖極快，具有當齡感染當齡發病的特征，家蠶感染后體內形成大量多角體，血液呈乳白色濃汁狀，死亡時體壁破裂污染蠶座并成為傳染源。由于BmNPV傳染性極強，密集飼養過程中因為各種原因導致家蠶感染BmNPV，即使同一蠶座內僅有少量個體感染也容易引起大面積流行。如何去除傳染源是家蠶核型多角體病毒病防控中最關鍵最棘手的問題。目前的應對措施主要是養蠶期間的體外消毒。但實際飼養過程中發生BmNPV感染后則無有效方法抑制病毒多角體形成，或有目的地淘汰患病個體。
[0004]靈菌紅素(Prodigiosin,PG)是一類天然紅色素的總稱,屬于沙雷氏菌等微生物產生的次生代謝產物，具有抗菌、抗腫瘤、抗原蟲、免疫調節等多種生物學活性。但靈菌紅素對病毒BmNPV的抑制作用即對家蠶核型多角體病毒病的防控作用尚無研究報道。

【發明內容】

[0005]本發明提供靈菌紅素在防控家蠶核型多角體病毒病中的應用及使用方法。
[0006] 本發明的目的第一是將小分子化合物靈菌紅素作為家蠶核型多角體病毒的抑制劑。[0007]所述的家蠶核型多角體病毒抑制劑包括含有靈菌紅素的固態或液態制劑。
[0008]本發明涉及的靈菌紅素在體外實驗中，其濃度范圍0.01-0.8 μ g/L可干擾BmNPV在細胞中的正常增殖，阻止病毒多角體形成，多角體形成率低于1%。
[0009]本發明涉及的靈菌紅素在體外實驗中，其濃度范圍1-300 μ g/L可選擇性的導致感染BmNPV的家蠶細胞死亡，其死亡率超過97%，但對正常細胞不表現出毒性。
[0010]本發明的目的第二是提供靈菌紅素防控家蠶核型多角體病毒病的方法，應用方法包括步驟:將所述的靈菌紅素與清水混合后均勻噴灑于桑葉或飼料上添飼家蠶，用量為
1-10 g靈菌紅素添飼1000只家蠶。
[0011]動物實驗發現，靈菌紅素在濃度范圍1-10 mg/只經口添飼家蠶，能使核型多角體病毒病病蠶停止進食并提前死亡，同時對健康家蠶不表現出毒性。
[0012]靈菌紅素添飼核型多角體病毒病病蠶后，病蠶個體偏小，停止食桑直至死亡，顯著區別于健康蠶體，易于淘汰。
[0013]靈菌紅素添飼健康家蠶后，對核型多角體病毒病具有預防作用。
[0014]本發明的優點在于，利用靈菌紅素抑制BmNPV增殖及多角體的形成，同時具有加速核型多角體病毒病病蠶死亡的作用，防止并有效控制家蠶核型多角體病毒病的擴散。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為體外實驗中，靈菌紅素對正常家蠶細胞的安全濃度范圍。當靈菌紅素濃度為300 μ g/L時，細胞存活率約為94.38%。在小于300 μ g/L濃度范圍內，靈菌紅素對家蠶細胞不表現出毒性。
[0016]圖2為體外實驗中，靈菌紅素對BmNPV的抑制作用。A:正常家蠶細胞；B:感染BmNPV的家蠶細胞，細胞內出現大量多角體，5~6 d后細胞裂解，多角體釋放；C:家蠶細胞感染BmNPV于24 h內用靈菌紅素(0.1 μ g/L)處理，5~6 d后細胞內仍未見多角體產生，細胞生長良好。D:家蠶細胞感染BmNPV于24 h內用靈菌紅素(I μ g/L)處理，超過97%感染細胞于處理后8 h內死亡。
[0017]圖3為體外實驗中，靈菌紅素對家蠶感染細胞存活率及多角體形成的影響。家蠶細胞感染BmNPV于24 h內用靈菌紅素(Prodigiosin I μ g/L)處理或不處理(Control),細胞存活率(Cell viability)幾乎為O ;相比之下，99%以上靈菌紅素處理組細胞內未見有多角體(Polyhedron)形成，而不用靈菌紅素處理的對照組，100%的細胞內均形成大量多角體。
[0018]圖4為體內實驗中，添飼靈菌紅素對核型多角體病毒病病蠶死亡時間的影響。Prodigiosin Treatment:試驗組病蠶，感染 BmNPV 后，添飼靈菌紅素！Negative Control:陰性對照組健康蠶，不感染BmNPV,只添飼靈菌紅素！Positive Control:陽性對照組病蠶，只感染BmNPV，不添飼靈菌紅素。87.96%試驗組病蠶較陽性對照組病蠶提前2~3 d左右死亡，陰性對照組健康蠶則正常發育至上蔟。
【具體實施方式】
[0019]實施例一.靈菌紅素的制備
該實施例采用的細菌為粘質沙雷氏菌iSerratia fflarcescefls)、鏈霉菌iStreptomycessp.)、糖多抱菌(Saccharopo sp.)、交替假單胞菌(Pseudoal teromonas sp.)、馬杜拉放線菌 (,Actinomadura sp.)。
[0020]1.菌種活化
將保藏的粘質沙雷氏菌接種于LB固體培養基(1%蛋白胨，0.5%酵母膏，l%NaCl，2%瓊脂；蒸餾水；pH 7.0)，30°C恒溫培養48 h。同樣條件下進行轉接，使菌種活化。
[0021]將保藏的鏈霉菌接種于瓊脂平板(3%酵母膏，3%蛋白胨，0.5%葡萄糖，0.4%麥芽糖，0.2% MgSO4.7H20，2%瓊脂；蒸餾水；pH 7.0), 30°C恒溫培養48 h。同樣條件下進行轉接，使菌種活化。
[0022]將保藏的糖多孢菌接種于瓊脂平板(0.1%牛肉膏，1%葡萄糖，0.5%酵母膏，2%瓊脂；蒸餾水；pH 7.0)，28°C恒溫培養3 d。同樣條件下進行轉接，使菌種活化。
[0023]將保藏的交替假單胞菌接種于瓊脂平板(0.5%蛋白胨，0.1%酵母膏，0.001%FeSO4,1% NaCl, 0.25% MgSO4.7Η20，2% 瓊脂；蒸餾水；ρΗ 6.5)，25°C恒溫培養 3 d。同樣條件下進行轉接，使菌種活化。
[0024]將保藏的馬杜拉放線菌接種于瓊脂平板(2%可溶性淀粉，0.2%酵母膏，0.1 KNO3,
0.05% NaCl, 0.05% MgSO4.7Η20，0.05%Κ2ΗΡ04,0.001% FeSO4, 0.1% 色氨酸，2% 瓊脂；蒸餾水；pH 7.3)，30°C恒溫培養48 h。同樣條件下進行轉接，使菌種活化。
[0025]2.液體發酵
將已活化的粘質沙雷氏菌接種于LB液體培養基(1%蛋白胨，0.5%酵母膏，l%NaCl ;蒸餾水；pH 7.0)，30°C恒溫，200~280 rpm連續震蕩培養24 h，作為種子液。將種子液按照1:100的比例接種于發酵培養基(1%蛋白胨，0.5%酵母膏，0.5%NaCl，0.3%甘油；蒸餾水；pH
7.2)，采用發酵罐30°C恒溫，溶氧大于20%連續攪拌培養48h。粘質沙雷氏菌發酵液用于提取如下式所示的靈菌紅素。
【權利要求】
1.靈菌紅素在防控家蠶核型多角體病毒病中的應用。
2.如權利要求1所述的靈菌紅素在防控家蠶核型多角體病毒病中的應用，其特征在于，靈菌紅素作為家蠶核型多角體病毒的抑制劑，該抑制劑為含有靈菌紅素的液態制劑或固態制劑。
3.如權利要求2所述的靈菌紅素在防控家蠶核型多角體病毒病中的應用，其特征在于，所述的液態制劑輔料包括但不限于:二甲基亞砜，聚山梨酯，檸檬酸鈉，甘油。
4.如權利要求2所述的靈菌紅素在防控家蠶核型多角體病毒病中的應用，其特征在于，所述的固態制劑輔料包括但不限于:海藻酸鈉，聚山梨酯，玉米淀粉，羧甲基纖維素。
5.如權利要求1所述的靈菌紅素在防控家蠶核型多角體病毒病中的應用，其特征在于，應用方法包括步驟:將靈菌紅素與清水混合后均勻噴灑于桑葉或飼料上添飼家蠶，用量為1-10 g靈菌紅素添飼10 00只家蠶。
【文檔編號】A61K31/4025GK103690534SQ201310640377
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月4日 優先權日:2013年12月4日
【發明者】周圍, 張琳, 馮麗春, 敖翔, 李精華, 萬永繼 申請人:西南大學