專利名稱：一種茶尺蠖核型多角體病毒的定性檢測方法
技術領域：
本發明屬生物制劑檢測技術領域，具體涉及一種病毒制劑的定性檢測方法。
背景技術：
^K^MM^MW'M^ (Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus,EoNPV) Mff 狀病毒科，核型多角體病毒屬，該病毒于1977年在我國首次發現。EoNPV是茶尺蠖的病原性 天敵，通過幼蟲取食后在蟲體內迅速增殖，致使其感染發病而死亡。目前這種病毒已可以通 過室內大量增殖，經配制形成產品，進行商業化生產，近年來，EoNPV作為一種高效病毒殺蟲 劑在各省茶區廣泛推廣使用，對茶尺蠖進行有效的生物防治，產生了良好的社會、經濟和生 態效益。因為這種病毒產品不同于一般的農藥，它是一個活體，目前只有通過生物測定的方 法進行檢測。也就是說，用病毒產品喂飼茶尺蠖幼蟲，看是否發病來確定該生物農藥產品是 否有效，這是因為核型多角體病毒是寄主專一性的，因而茶尺蠖病毒只能感染茶尺蠖幼蟲。 這種傳統的生物測定的方法使得目前在EoNPV病毒制劑的生產、使用過程中存在毒力指標 檢測粗放、評價周期過長、制劑質量難以有效監控等問題。

發明內容
鑒于現有技術中存在的上述問題，本發明發明利用免疫學原理，通過制備茶尺蠖 核型多角體病毒多角體蛋白單克隆抗體，再借助ELISA手段來定性檢測未知樣品中是否有 茶尺蠖核型多角體病毒。所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定性檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)制備茶尺蠖核型多角體病毒單克隆抗體；2)樣品檢測；所述的步驟1)主要包括以下步驟a.茶尺蠖核型多角體病毒的分離純化；b.將純化的茶尺蠖核型多角體病毒作為抗原對小鼠進行免疫；c.細胞融合和克隆在加強免疫3天后取小鼠脾細胞和正處于對數生長期的骨髓 瘤細胞在PEG6000的作用下進行細胞融合，每次融合后，將細胞接種于96孔培養板，用含 HAT的1640完全培養基選擇培養10天，然后將HAT改為HT培養1周；待細胞長至顯微鏡 視野的1/4，取培養上清用ELISA法檢測抗體，以茶尺蠖核型多角體病毒作為包被原對所選 陽性細胞進行再篩選，選擇最終的陽性細胞以有限稀釋法進行克隆；d.對檢測為陽性單克隆細胞株進行傳代培養，篩選出陽性單克隆抗體細胞株；e.雜交瘤細胞腹水效價測定；f.單抗對病毒蛋白特異性識別；所述的步驟2)主要包括以下步驟a.將待檢樣品置于包被液中，按每孔100iiL加入酶聯板的小孔中，設置對照， 37°C下包被3-4h或4°C冰箱包被過夜；
b.用 1 XPBST 洗滌 3 次，每次 5min ；c.加150μ L重量百分濃度為2% _5 %的脫脂奶粉，37°C下封閉Ih ；d.配制茶尺蠖核型多角體病毒單克隆抗體于2wt% _5襯％脫脂奶粉中，體積配比 為1 1000，每孔加100 μ L，37°C下溫浴Ih ；e.用 1 XPBST 洗 滌 3 次，每次 5min ；f.用1 XPBST將辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠稀釋5000倍，每孔加100 μ L稀 釋后的抗體，37°C下溫育Ih; g.用 1 X PBST 洗滌 3 次，每次 5min ；h.力卩 100 μ L 顯色液，37°C下溫育 3_5min ；i.力口 50 μ L 終止液；j.用酶標儀測讀各孔在λ = 492nm處的光密度值0D，計算P/N =樣品OD值/對 照OD值，若P/N彡2.1，即為陽性。所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定性檢測方法，其特征在于步驟1)步驟a所 述的茶尺蠖核型多角體病毒分離純化方法為以茶尺蠖核型多角體病毒感染茶尺蠖幼蟲， 收集被感染的茶尺蠖蟲尸，用研缽將蟲尸磨碎，用5層粗棉布過濾其中較大顆粒后，使用新 配制的裂解液裂解 l_2h，裂解液為 0. lmol/L Na2CO3,0. 05mol/L NaCl，pH = 10. 3 ；用 50% 的HCl中和堿液，3000g離心5min，去除其中未裂解的多角體；再160000g、1.5h超速離心， 沉淀茶尺蠖核型多角體病毒；最后用PBS溶解純化的病毒粒子，存于4°C冰箱待用。所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定性檢測方法，其特征在于步驟1)步驟b所 述的小鼠免疫具體方法如下將分離純化后的茶尺蠖核型多角體病毒粒子作為抗原與等量 福氏完全佐劑充分混合，經皮下多點注射BALB/c小鼠，每只80-100 μ g，間隔14d用含等量 的福氏不完全佐劑的蛋白抗原相同劑量作第2、3、4次免疫，14d后，腹腔注射不加佐劑的蛋 白抗原，每只100 μ g，3d后取脾細胞用于細胞融合。所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定性檢測方法，其特征在于步驟1)步驟e 所述的雜交瘤細胞腹水效價測定方法為將篩選出的陽性單克隆雜交瘤細胞株進行擴大培 養，并向小鼠腹部注射降植燒，一周后，使用生理鹽水將細胞沉淀懸浮，接種于小鼠腹腔，待 小鼠腹腔明顯鼓脹，抽取腹水測定其抗體效價并保存于4°C備檢；培養上清或腹水，經稀釋 后加到包被原包被的酶標板中，孵育、洗滌后，再加入HRP標記的羊抗鼠IgG，底物顯色；陽 性對照為小鼠陽性血清，同時分別以同等稀釋的Sp2/0培養上清，或無免疫小鼠血清為陰 性對照，空白對照為PBS。所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定性檢測方法，其特征在于步驟1)步驟 f所述的單抗對病毒蛋白特異性識別方法為首先是克隆表達茶尺蠖核型多角體病毒蛋 白基因，根據茶尺蠖核型多角體病毒基因組的多角體蛋白基因序列，采用DNAStar軟件， 設計了 一對特異性引物如下EoNPV ph F :5，-atgtatactcgttaca-3，和 EoNPV ph R 5’ -ttaatacgcaggtcct-3’，擴增多角體蛋白基因，PCR反應采用25 μ L體系，PCR擴增程序 如下先94°C預變性3min ；然后94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s ；循環30次，最后72°C延伸 IOmin ；PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定；將擴增的基因片段克隆連接至pMDIS-T克隆載體，連接產物轉化至TG1，提取質 粒，用BamH I和Xho I雙酶切切下ph基因片段，并連接到經BamH I和Xho I雙酶切的表達載體質粒PGEX-4T2，提取質粒并用BamH I和Xho I雙酶切鑒定，得到表達載體質粒 pGEX-4T2-ph ；將構建的pGEX-4T2_ph表達載體轉化表達菌E. coli BL21，挑取單菌落并在37°C、 200rpm/min條件下對其進行培養8_10h ；第二天用5%菌液轉接于5mLLB液體培養基中，培 養2-3h，直至0D600為0. 4-0. 6，隨后加入0. lmmol/L的IPTG，在37°C對其誘導培養6_8h， 收集菌體，用PBS稀釋，然后加入SDS-PAGE上樣緩沖液，進行沸水浴5min，使用12000g轉速 離心lOmin去除不溶物質， 取10 u L樣品進行SDS-PAGE檢測及Western-blot分析；在此過 程中，同時以BL21菌液和轉化PGEX-4T2的誘導菌液作為參照；利用Western-blot對兩株單抗的特異性進行鑒定，按常規方法進行；將茶尺蠖病 毒粒子、多角體表達蛋白、載體PEGX-4T2表達蛋白進行SDS-PAGE，用小鼠腹水作為一抗。上述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定性檢測方法，突破了傳統的生物測定技 術，解決了茶尺蠖核型多角體病毒的準確定性問題。本發明的優點是借助免疫學手段，制 備了茶尺蠖核型多角體病毒單克隆抗體，建立了茶尺蠖核型多角體病毒的準確定性檢測方 法，與傳統生物測定方法相比，本方法毒力指標檢測更為精細，毒力評價周期大大縮短，可 廣泛用于病毒制劑質量的評定，規范茶尺蠖病毒的生產應用。


圖 1 為 EoNPV Western-blot 分析結果；圖 2 為 SDS-PAGE 和 Western-blot 分析結果；圖2中M 蛋白質分子質量標準；1 :GST_Ph融合蛋白；2 :PGEX_4T_2載體；3 :ph融 合蛋白；4 :PGEX-4T-2o
具體實施例方式現結合本發明的實施例對本發明作進一步說明。實施例1、茶尺蠖核型多角體病毒多角體蛋白單克隆抗體的制備1. EoNPV病毒粒子的分離純化以茶尺蠖核型多角體病毒EoNPV(浙江杭州株)感染適齡幼蟲，收集并磨碎染病 死亡蟲尸；用5層粗棉布過濾其中較大顆粒后，使用適量新配制的裂解液0. lmol/L Na2C03, 0. 05mol/L NaCl (pH = 10. 3)裂解多角體 l_2h ；用 50% 的 HC1 中和堿液，3000g 離心 5min， 去除其中未裂解的多角體；在160000g、l. 5h超速離心，沉淀EoNPV病毒粒子；最后用PBS溶 解純化的病毒粒子，存于4°C冰箱待用。2.小鼠免疫將分離純化后的茶尺蠖核型多角體病毒粒子作為抗原與等量福氏完全佐劑充分 混合，經皮下多點注射BALB/c小鼠，每只80-100 u g，間隔14d用含等量的福氏不完全佐 劑的蛋白抗原相同劑量作第2、3、4次免疫，14d后，腹腔注射不加佐劑的蛋白抗原，每只 100 u g，3d后取脾細胞用于細胞融合。3.細胞融合和克隆在加強免疫后3天左右取小鼠脾細胞和正處于對數生長期的骨髓瘤細胞在 PEG6000的作用下進行融合，每次融合后，將細胞接種于96孔培養板，用含HAT的1640完全培養基選擇培養10天左右，然后將HAT改為HT培養1周。待細胞長至顯微鏡視野的1/4，取培養上清用ELISA法檢測抗體，以EoNPV病毒粒 子作為包被原對所選陽性細胞進行再篩選，選擇最終的陽性細胞以有限稀釋法進行克隆。4.陽性單克隆抗體細胞株的篩選對檢測為陽性的單克隆細胞株進行規律傳代培養，并且每一代檢測它們的抗體分 泌情況，最終獲得穩定分泌抗體的EoNPV單克隆抗體細胞株。目的初篩選所得細胞株不一 定是單個雜交瘤細胞株，里面可能混有其它細胞，因此必須進行3次以上的亞克隆，直至所 有細胞孔都為陽性方可。5.小鼠腹水制備及鑒定將最后篩選出的陽性單克隆雜交瘤細胞株進行擴大培養，并向小鼠腹部注射降植 烷，一周后，使用生理鹽水將細胞沉淀懸浮，接種于小鼠腹腔，待小鼠腹腔明顯鼓脹，抽取腹 水測定其抗體效價并保存于4°C備檢。6. McAb效價測定培養上清或腹水，經稀釋后加到包被原包被的酶標板中，孵育、洗滌后，再加入HRP 標記的羊抗鼠IgG，底物顯色。陽性對照為小鼠陽性血清，同時分別以同等稀釋的Sp2/0培 養上清，或無免疫小鼠血清為陰性對照，空白對照為PBS。7.單抗對病毒蛋白特異性識別首先是克隆表達茶尺蠖核型多角體病毒蛋白基因，根據茶尺蠖核型多角體病毒 基因組(NC_008586. 1)的多角體蛋白基因序列，采用DNAStar軟件，設計了一對特異性引 物，EoNPV ph F:5，-GGATCCatgtatactcgttaca-3，(見序列表 SEQ No. 1)禾口 EoNPV ph R 5，-CTCGAGttaatacgcaggtcct-3，(見序列表 SEQ No. 2)擴增多角體蛋白基因(GGATCC 和 CTCGAG為酶切位點)。PCR反應采用25 ii L體系，PCR擴增程序如下先94°C預變性3min ； 然后94°C 30s,62°C 30s,72°C 30s ；循環30次，最后72°C延伸lOmin。PCR產物用瓊脂糖凝 膠電泳鑒定，預測片段大小約741bp。(測序結果為ATGTATACTCGTTACAGTTACAACCCGTCGTT GGGTCGCACCTACGTCTACGACAATAAGTATTTCAAGAATCTCGGCGCCGTAATCAAAAACGCCAAACGCAAGAAGC ATCAACTTGAACATGAAGTCGAAGAACACGCTCTCGACCCTCTGGACAGGTATCTTGTTGCCGAGGACCCTTTCATG GGGCCGGGCAAGAATCAAAAACTAACTTTGTTCAAAGAGATTCGCAACGTCAAGCCCGACACGATGAAACTGATCGT TAATTGGAGCGGCAAAGAATTTCTCAGAGAAACTTGGACTCGTTTCATGGAAGACAGTTTCCCCATTGTCAACGACC AAGAAGTGATGGACGTGTTTTTGGTGATTAACATGCGTCCCACCAGGCCCAACCGTTGTTACAAATTCTTAGCTCAA CACGCGCTGCGTTGCGATCCCGATTACGTGCCGCACGAGGTGATCAGAATCGTTGAGCCCAGCTACGTGGGCAGCAA CAACGAATATCGCATCAGTCTGGCTAAACGCGGAGGCGGTTGCCCCGTTATGAACCTGCACGCCGAGTACACCAACT CTTTCGAGGAATTCATCAACCGCGTGATTTGGGAGAATTTCTACAAGCCCATCGTGTATGTGGGCACCGATTCCGCC GAAGAGGAGGAAATCCTACTTGAAGTTTCGCTTGTCTTCAAAATCAAAGAATTCGCCCCTGACGCACCTTTGTATTC AGGACCTGCGTATTAA (見序列表 SEQ No. 3)。將擴增的基因片段克隆連接至pMD18-T克隆載體，連接產物轉化至TG1，提取質 粒，用BamH I和Xho I雙酶切切下ph基因片段，并連接到經BamH I和Xho I雙酶切的 表達載體質粒PGEX-4T2，提取質粒并用BamH I和Xho I雙酶切鑒定，得到表達載體質粒 pGEX-4T2-ph。將構建的pGEX-4T2_ph表達載體轉化表達菌E. coli BL21，挑取單菌落并在37°C、200rpm/min條件下對其進行培養8-10h。第二天用5%菌液轉接于5mLLB液體培養基中，培 養2-3h，直至0D600為0. 4-0. 6，隨后加入0. lmmol/L的IPTG，在37°C對其誘導培養6_8h， 收集菌體，用PBS稀釋，然后加入SDS-PAGE上樣緩沖液，進行沸水浴5min，使用12000rpm轉 速離心lOmin去除不溶物質，取10 ii L左右樣品進行SDS-PAGE檢測及Western-blot分析。 在此過程中，同時以BL21菌液和轉化pGEX-4T2的誘導菌液作為參照。利用Western-blot對兩株單抗的特異性進行鑒定，按常規方法進行。將茶尺蠖 病毒粒子、多角體表達蛋白、載體PEGX-4T2表達蛋白進行SDS-PAGE，用小鼠腹水作為一抗。 通過Western-blot實驗，以確定與EoNPV單抗特異性結合的蛋白是否是該病毒的多角體蛋 白。分析結果見圖1和圖2。其中圖1中，制備的單抗與茶尺蠖核型多角體病毒蛋白結 合，證明該單抗為茶尺蠖核型多角體病毒的單抗，即此單抗可以用于茶尺蠖核型多角體病 毒的定性檢測。圖2中SDS-PAGE的樣品1和2分別為表達的GST_Ph融合蛋白，ph代表茶 尺蠖核型多角體病毒的多角體蛋白、PGEX-4T-2載體；Western-blot的樣品3和4分別為 ph 蛋白、PGEX-4T-2。實施例2、ELISA檢測取EoNPV生物制劑和化學農藥，使用0.9%的生理鹽水將樣品按1 10、1 100、 1 1000,1 10000稀釋，用移液槍將其混勻，為稀釋后的樣品設置3個重復，并設置陰 性對照，用1XPBS作為陰性對照。將上述配置稀釋后的樣品隨后向酶標板小孔分別加入 100 u L/孔。在4°C冰箱包被過夜或者37°C下包被2-3h。A.使用1 X PBST連續洗滌酶標板3次，每次洗滌5min ；B.配制2%-4%的脫脂奶粉，向小孔中分別加150 iiL 2%-5%脫脂奶粉，在37°C 下封閉lh。 C.使用1 X PBST連續洗滌酶標板3次，每次洗滌5min ；D.將制備的EoNPV單克隆抗體溶于2% 脫脂奶粉中，按1 1000稀釋，每孔 加 lOOil L，在 37°C下溫浴 l_2h。E.使用1 X PBST連續洗滌酶標板3次，每次洗滌5min ；F.將辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠按1 5000用1XPBST稀釋，在酶標板中每 孔加入100 uL 37°C下溫育lh。G.使用1 XPBST連續洗滌酶標板3次，每次洗滌5min ；加顯色液100 u L/孔，在 37°C下溫育10-15min。顯色液為24. 3mL 0. 1M檸檬酸和25. 7mL 0. 2MNa2HP04等體積混合， 并在臨用前加入20mg鄰苯二胺和75 ii L雙氧水。H.向每孔加入2mol/L H2S04終止液50 u L，終止該反應。I.使用酶標儀測讀酶標板各孔在入=492nm處的光密度值0D，然后計算P/N = 樣品0D值/對照0D值。如果P/N彡2. 1，則為陽性。試驗結果應用上述所制備的抗體對樣品進行ELISA檢測，結果顯示，陽性EoNPV 生物制劑樣品均顯色，且顏色較深，陰性對照無顯色反應，且化學農藥和1XPBS陰性對照 的0D492值均較小，另外EoNPV生物制劑樣品與陰性對照0D492值之比大于2. 1。
序列表
<110>中國農業科學院茶葉研究所<120> 一種茶尺蠖核型多角體病毒的定性檢測方法
<130>案卷參考號
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atgtatactc gttaca <210>2 <211>16 <212>DNA <213>人工序列 <400>2
ttaatacgca ggtcct
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<211>741
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
16
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atgtatactcgttacagttacaacccgtcgttgggtcgcacctacgtctacgacaataag60tatttcaagaatctcggcgccgtaatcaaaaacgccaaacgcaagaagcatcaacttgaa120catgaagtcgaagaacacgctctcgaccctctggacaggtatcttgttgccgaggaccct180ttcatggggccgggcaagaatcaaaaactaactttgttcaaagagattcgcaacgtcaag240cccgacacgatgaaactgatcgttaattggagcggcaaagaatttctcagagaaacttgg300actcgtttcatggaagacagtttccccattgtcaacgaccaagaagtgatggacgtgttt360ttggtgattaacatgcgtcccaccaggcccaaccgttgttacaaattcttagctcaacac420gcgctgcgttgcgatcccgattacgtgccgcacgaggtgatcagaatcgttgagcccagc480tacgtgggcagcaacaacgaatatcgcatcagtctggctaaacgcggaggcggttgcccc540gttatgaacctgcacgccgagtacaccaactctttcgaggccgcgtgatt600tgggagaatttctacaagcccatcgtgtatgtgggcaccgattccgccgaagaggaggaa660atcctacttgaagtttcgcttgtcttcaaaatcaaagaattcgcccctgacgcacctttg720tattcaggacctgcgtattaa74權利要求
一種茶尺蠖核型多角體病毒的定性檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)制備茶尺蠖核型多角體病毒單克隆抗體；2)樣品檢測；所述的步驟1)主要包括以下步驟a.茶尺蠖核型多角體病毒的分離純化；b.將純化的茶尺蠖核型多角體病毒作為抗原對小鼠進行免疫；c.細胞融合和克隆在加強免疫3天后取小鼠脾細胞和正處于對數生長期的骨髓瘤細胞在PEG6000的作用下進行細胞融合，每次融合后，將細胞接種于96孔培養板，用含HAT的1640完全培養基選擇培養10天，然后將HAT改為HT培養1周；待細胞長至顯微鏡視野的1/4，取培養上清用ELISA法檢測抗體，以茶尺蠖核型多角體病毒作為包被原對所選陽性細胞進行再篩選，選擇最終的陽性細胞以有限稀釋法進行克隆；d.對檢測為陽性單克隆細胞株進行傳代培養，篩選出陽性單克隆抗體細胞株；e.雜交瘤細胞腹水效價測定；f.單抗對病毒蛋白特異性識別；所述的步驟2)主要包括以下步驟a.將待檢樣品置于包被液中，按每孔100μL加入酶聯板的小孔中，設置對照，37℃下包被3-4h或4℃冰箱包被過夜；b.用1×PBST洗滌3次，每次5min；c.加150μL重量百分濃度為2％-5％的脫脂奶粉，37℃下封閉1h；d.配制茶尺蠖核型多角體病毒單克隆抗體于2wt％-5wt％脫脂奶粉中，體積配比為1∶1000，每孔加100μL，37℃下溫浴1h；e.用1×PBST洗滌3次，每次5min；f.用1×PBST將辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠稀釋5000倍，每孔加100μL稀釋后的抗體，37℃下溫育1h；g.用1×PBST洗滌3次，每次5min；h.加100μL顯色液，37℃下溫育3-5min；i.加50μL終止液；j.用酶標儀測讀各孔在λ＝492nm處的光密度值OD，計算P/N＝樣品OD值/對照OD值，若P/N≥2.1，即為陽性。
2.根據權利要求1所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定性檢測方法，其特征在于 步驟1)步驟a所述的茶尺蠖核型多角體病毒分離純化方法為以茶尺蠖核型多角體病毒 感染茶尺蠖幼蟲，收集被感染的茶尺蠖蟲尸，用研缽將蟲尸磨碎，用5層粗棉布過濾其中較 大顆粒后，使用新配制的裂解液裂解l_2h，裂解液為0. lmol/L Na2C03,0. 05mol/L NaCl, pH =10. 3 ；用50%的HC1中和堿液，3000g離心5min，去除其中未裂解的多角體；再160000g、 1. 5h超速離心，沉淀茶尺蠖核型多角體病毒；最后用PBS溶解純化的病毒粒子，存于4°C冰 箱待用。
3.根據權利要求1所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定性檢測方法，其特征在于步 驟1)步驟b所述的小鼠免疫具體方法如下將分離純化后的茶尺蠖核型多角體病毒粒子作 為抗原與等量福氏完全佐劑充分混合，經皮下多點注射BALB/c小鼠，每只80-100 u g，間隔14d用含等量的福氏不完全佐劑的蛋白抗原相同劑量作第2、3、4次免疫，14d后，腹腔注射 不加佐劑的蛋白抗原，每只100 μ g，3d后取脾細胞用于細胞融合。
4.根據權利要求1所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定性檢測方法，其特征在于步 驟1)步驟e所述的雜交瘤細胞腹水效價測定方法為將篩選出的陽性單克隆雜交瘤細胞株 進行擴大培養，并向小鼠腹部注射降植烷，一周后，使用生理鹽水將細胞沉淀懸浮，接種于 小鼠腹腔，待小鼠腹腔明顯鼓脹，抽取腹水測定其抗體效價并保存于4°C備檢；培養上清或 腹水，經稀釋后加到包被原包被的酶標板中，孵育、洗滌后，再加入HRP標記的羊抗鼠IgG， 底物顯色；陽性對照為小鼠陽性血清，同時分別以同等稀釋的Sp2/0培養上清，或無免疫小 鼠血清為陰性對照，空白對照為PBS。
5.根據權利要求1所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒的定性檢測方法，其特征在于步 驟1)步驟f所述的單抗對病毒蛋白特異性識別方法為首先是克隆表達茶尺蠖核型多角 體病毒蛋白基因，根據茶尺蠖核型多角體病毒基因組的多角體蛋白基因序列，采用DNAStar 軟件，設計了一對特異性引物如下EoNPV ph F 5' -atgtatactcgttaca-3，和EoNPV ph R 5' -ttaatacgcaggtcct-3，，擴增多角體蛋白基因，PCR反應采用25 μ L體 系，PCR擴增程序如下先94°C預變性3min ；然后94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s ；循環30次， 最后72°C延伸IOmin ；PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定；將擴增的基因片段克隆連接至PMD18-T克隆載體，連接產物轉化至TG1，提取質粒，用 BamH I和Xho I雙酶切切下ph基因片段，并連接到經BamH I和Xho I雙酶切的表達載體質 粒PGEX-4T2，提取質粒并用BamH I和Xho I雙酶切鑒定，得到表達載體質粒pGEX_4T2-ph ； 將構建的pGEX-4T2-ph表達載體轉化表達菌E. coli BL21,挑取單菌落并在37°C、 200rpm/min條件下對其進行培養8_10h ；第二天用5%菌液轉接于5mLLB液體培養基中，培 養2-3h，直至0D600為0. 4-0. 6，隨后加入0. lmmol/L的IPTG，在37°C對其誘導培養6_8h， 收集菌體，用PBS稀釋，然后加入SDS-PAGE上樣緩沖液，進行沸水浴5min，使用12000g轉速 離心IOmin去除不溶物質，取10 μ L樣品進行SDS-PAGE檢測及Western-blot分析；在此過 程中，同時以BL21菌液和轉化PGEX-4T2的誘導菌液作為參照；利用Western-blot對兩株單抗的特異性進行鑒定，按常規方法進行；將茶尺蠖病毒粒 子、多角體表達蛋白、載體PEGX-4T2表達蛋白進行SDS-PAGE，用小鼠腹水作為一抗。
全文摘要
一種茶尺蠖核型多角體病毒的定性檢測方法，屬生物制劑檢測技術領域，其特征在于先制備茶尺蠖核型多角體病毒多角體蛋白單克隆抗體，然后將待檢樣品進行包被，使用間接Elisa方法進行檢測。本發明借助免疫學手段，突破了傳統的生物測定技術，解決了茶尺蠖核型多角體病毒的準確定性問題。與傳統生物測定方法相比，本方法毒力指標檢測更為精細，毒力評價周期大大縮短，可廣泛用于病毒制劑質量的評定，規范茶尺蠖病毒的生產應用。
文檔編號G01N33/577GK101871944SQ20101019002
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月2日 優先權日2010年6月2日
發明者付建玉, 唐美君, 杜軍利, 肖強 申請人:中國農業科學院茶葉研究所