專利名稱：：一種海參用球形紅假單胞菌的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及海洋微生物，具體地說是指一種海參用球形紅假單胞菌的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：海參用球形紅假單胞菌"/zo咖eM(io,"as—aera/cfes1J，是光合細(xì)菌的一種，光合細(xì)菌0P/7oto^"A勸'cBacten'a簡(jiǎn)稱尸6S)是具有原始光能合成體系的原核生物，是一類光能營養(yǎng)、兼性厭氧的水生、水圈微生物。光合細(xì)菌在自然界中分布極為廣泛，主要分布在海洋、江河、湖沼、活性污泥、土壤和高鹽水體等生境中。光合細(xì)菌以光能為能源，以乙酸鈉、丙酸鈉、乳酸鈉、甘露醇、蘋果酸、檸檬酸、甘油等多種有機(jī)酸為碳源。具有生長(zhǎng)繁殖速度快、易于培養(yǎng)、代謝產(chǎn)物營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)。據(jù)測(cè)定，光合細(xì)菌干菌體蛋白質(zhì)含量高達(dá)60%以上，其中氨基酸組成齊全，還含有多種維生素(B族維生素極為豐富)、葉酸、泛酸、生物素、輔酶Q和大量的類胡蘿卜素、番茄素、奸青素、胞外多糖等。因此，光合細(xì)菌有著很高的應(yīng)用價(jià)值，其產(chǎn)品廣泛用于農(nóng)業(yè)、飼料、醫(yī)藥保健、環(huán)境保護(hù)等諸多行業(yè)。(文獻(xiàn)一種光合細(xì)菌培養(yǎng)基用添加劑，專利號(hào)ZL02133074.3，發(fā)明人:薛德林、胡江春、馬成新、王偉、劉軍、王書錦)近年來，大量試驗(yàn)結(jié)果表明，光合細(xì)菌中球形紅假單胞菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用最為成功l.球形紅假單胞菌是優(yōu)質(zhì)的生物餌料，可以直接和間接為養(yǎng)殖海參及幼體提供營養(yǎng)物質(zhì)，提高變態(tài)率、成活率、增強(qiáng)抗病力、促進(jìn)生長(zhǎng)、提高品質(zhì)、提高產(chǎn)量。無論是成活率還是產(chǎn)量的提高均可達(dá)1040%。2.球形紅假單胞菌有凈化養(yǎng)殖池水質(zhì)功能，能利用水中小分子含氮化合物和異養(yǎng)微生物分解形成的有機(jī)酸和氨基酸，促進(jìn)養(yǎng)殖池底有機(jī)物的循環(huán)，可以在各種水質(zhì)條件下凈化或者協(xié)助凈化水質(zhì)，可使水產(chǎn)養(yǎng)殖池水體中的氨氮、硫化氫下降，溶解氧提高，COD、BOD值和pH值等項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到正常，改善養(yǎng)殖池水體的生態(tài)環(huán)境,凈化水質(zhì)。在自然生態(tài)凈化過程中，由于球形紅假單胞菌的參與，水體中微生物菌群組成趨于合理，即有機(jī)營養(yǎng)型微生物群落的生長(zhǎng)繁殖—球形紅假單胞菌的生長(zhǎng)繁殖—促進(jìn)藻類的生長(zhǎng)繁殖—促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)繁殖，維持水體生態(tài)平衡現(xiàn)有的球形紅假單胞菌培養(yǎng)技術(shù)中存在的主要問題l.常規(guī)的培養(yǎng)方法菌株生長(zhǎng)繁殖速度慢、含菌濃度低，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，易污染雜菌。2.菌種特性不明顯，菌體中的類胡蘿卜素和賴氨酸含量不高，耐鹽性差，菌種易退化。3.在以往的生產(chǎn)中球形紅假單胞菌是淡水培養(yǎng)，存活率低，海珍品及海參幼體對(duì)其利用的不好，不能滿足應(yīng)用的需求。申請(qǐng)人采用從近海海參養(yǎng)殖圈的底泥和鹽灘中，分離純化得到的海參用球形紅假單胞菌，在遼寧大連五島海珍品養(yǎng)殖公司海參育苗和養(yǎng)成中進(jìn)行應(yīng)用試驗(yàn),取得了非常理想效果。結(jié)果表明海參用球形紅假單胞菌能夠提高海參幼體的變態(tài)率和成活率，促進(jìn)海參生長(zhǎng)、并且可以增強(qiáng)海參的免疫力、抗病力和海參體色澤；能夠凈化養(yǎng)殖池的水質(zhì)、分解水中有機(jī)物，使硫化氫、氨氮等指標(biāo)下降，溶解氧提高，COD、BOD和pH值達(dá)到正常，無毒、無害、無任何毒副作用,是一種綠色的生物餌料和水質(zhì)凈化劑，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
發(fā)明內(nèi)容，本發(fā)明目的在于是提供一種海參用球形紅假單胞菌的培養(yǎng)方法。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，周期短、產(chǎn)品質(zhì)量高，產(chǎn)品在海參育苗和養(yǎng)成中應(yīng)用，可提高海參幼體各階段變態(tài)率、成活率，可促進(jìn)海參的生長(zhǎng)發(fā)育,可改善養(yǎng)殖池水體的生態(tài)環(huán)境,凈化水質(zhì)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案為以陳海水、螯合鐵、乙酸鈉等為主要原料，將常規(guī)的球形紅假單胞菌在厭氧罐平皿中，分離、純化、培養(yǎng)制種，經(jīng)液體一級(jí)種子培養(yǎng)、液體二級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)及三級(jí)大批量生產(chǎn)性培養(yǎng)，離心濃縮制成高濃度海參用球形紅假單胞菌產(chǎn)品。一種海參用球形紅假單胞菌的培養(yǎng)方法，包括如下步驟1)菌種活化將經(jīng)過活化的球形紅假單胞菌斜面菌種接種于液體培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)，得到球形紅假單胞菌種子母液；2)—級(jí)種子培養(yǎng)將步驟1)中得到的種子母液接種到一級(jí)種子培養(yǎng)基中，種子母液與一級(jí)種子培養(yǎng)液的重量百分比為20-25:75-80，經(jīng)培養(yǎng)得到一級(jí)種子液；3)二級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)將步驟2)中得到的一級(jí)種子液接種到二級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)基中，一級(jí)種子液與擴(kuò)繁液體培養(yǎng)液的重量百分比為20-25:75-80，經(jīng)培養(yǎng)得到二級(jí)種子液；4)三級(jí)大批量生產(chǎn)性培養(yǎng)將步驟3)中得到的二級(jí)種子液接種到三級(jí)大批量生產(chǎn)性培養(yǎng)基中，二級(jí)種子液與三級(jí)大批量生產(chǎn)性培養(yǎng)液的重量百分比為30-35:65-70;經(jīng)培養(yǎng)，即得到液體狀，呈粉色、紅色和紫紅色，菌體大小為1.01.5pm或1.01.1pm，含活菌數(shù)^20億個(gè)/ml的海參用球形紅假單胞菌的菌液；上述球形紅假單胞菌培養(yǎng)過程所采用的培養(yǎng)基組成均為氯化銨1.0-3.0g、乙酸鈉2.0-5.0g、硫酸鎂0.2-0.3g、碳酸氫鈉1.0-3.0g、磷酸氫二鉀0.2-0.5g、酵母膏1.0-3.0g、微量元素母液l-3ml、陳海水1000ml，其中含有螯合鐵5-10ppm、PH值自然；培養(yǎng)條件均為厭氧、光照1000—10000Lux、培養(yǎng)6-8天；所述陳海水為天然海水放置到陰涼處儲(chǔ)放1-2周，待雜質(zhì)沉淀后過濾而成，鹽度為2.0-3.0%。所述培養(yǎng)基組成具體可為，氯化銨l.Og、乙酸鈉3.0g、硫酸鎂0.2g、碳酸氫鈉2.0g、磷酸氫二鉀0.2g、酵母膏l(xiāng).Og、微量元素母液lml、陳海水1000ml，其中含有螯合鐵5ppm、PH值自然。所述螯合鐵母液的配制過程為，在500ml去離子水中，加入乙二胺四乙酸二鈉13.1g、硫酸亞鐵12.5g、1個(gè)當(dāng)量的氫氧化鉀134ml，在堿性條件下進(jìn)行通氣反應(yīng)，反應(yīng)完全后液體呈棕紅色，將PH值調(diào)至5.5，即為螯合鐵母液；如果每升溶液中加入螯合鐵母液0.2ml，溶液中的螯合鐵濃度為lppm。所述微量元素母液組成為，硼酸1.40g、硫酸錳0.14g、鉬酸銨0.26g、硫酸鋅0.06g、硫酸銅0.20g、氯化鈷0.01g、去離子水1000ml。所述步驟l)和2)所采用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)液經(jīng)高溫高壓滅菌，接種后屬純培養(yǎng)；步驟3)和4)所采用的培養(yǎng)液為化學(xué)滅菌，陳海水采用次氯酸鈉與硫代硫酸鈉中和法處理；陳海水、次氯酸鈉與硫代硫酸鈉的容量與重量比例為It:100ml:8-10g;具體為1噸陳海水加入含量為8%的次氯酸鈉100ml，充分反應(yīng)6-8小時(shí)后，用8-10g硫代硫酸鈉中和，碘化鉀指示劑反應(yīng)呈無色，再加入其它營養(yǎng)成份就是二級(jí)或三級(jí)液體培養(yǎng)基。所述的海參用球形紅假單胞菌的大批量生產(chǎn)菌液可作為海珍品育苗或養(yǎng)成的優(yōu)質(zhì)生物餌料，也可作為海水水質(zhì)凈化劑。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.菌種來源廣泛，繁殖快速。本發(fā)明采用的菌種為常規(guī)的海參用球形紅假單胞菌,并以陳海水、螯合鐵、乙酸鈉等為主要原料,在厭氧、光照、15"C32'C條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在相同生長(zhǎng)條件下，應(yīng)用本發(fā)明培養(yǎng)方法，能使海參用球形紅假單胞菌繁殖速度較一般通用培養(yǎng)基快2-3天，菌濃度提高50%以上。2.培養(yǎng)基原料組成簡(jiǎn)單、來源廣泛、成本低。本發(fā)明采用的海參用球形紅假單胞菌培養(yǎng)原料簡(jiǎn)單普遍，大批量生產(chǎn)時(shí)，可以采用城市工業(yè)產(chǎn)品下腳料、農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物，經(jīng)綜合處理，培養(yǎng)后可制成高濃度的海參用球形紅假單胞菌產(chǎn)品。3.海參用球形紅假單胞菌的產(chǎn)品質(zhì)量高。以海參用球形紅假單胞菌為種源，制成的產(chǎn)品中菌體類胡蘿卜素和賴氨酸含量高，并且耐鹽性好。液體一級(jí)種子培養(yǎng)、液體二級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)、大批量生產(chǎn)性培養(yǎng)和離心濃縮等生產(chǎn)工藝操作簡(jiǎn)便,周期短、產(chǎn)品質(zhì)量高。4.本發(fā)明具有低溫型海參用等特點(diǎn),海參用球形紅假單胞菌，適應(yīng)性廣泛、營養(yǎng)成份全、安全性好，對(duì)生態(tài)環(huán)境友好，在海參育苗中應(yīng)用可以提高幼體各階段變態(tài)率和成活率，并且能夠加快海參幼體生長(zhǎng)發(fā)育，改善養(yǎng)殖池水體的生態(tài)環(huán)境,凈化水質(zhì),提高海參的品質(zhì)和產(chǎn)量。深受海參養(yǎng)殖用戶歡迎,易于推廣應(yīng)用。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1:一種海參用球形紅假單胞菌的培養(yǎng)方法，可按下列步驟操作(1)斜面種母活化將球形紅假單胞菌的種母，接到新配制的種母活化用固體培養(yǎng)基的平皿、試管或克氏瓶斜面上，放入?yún)捬豕拗校跍囟?5'C條件下，在室內(nèi)自然光1000-3000Lux范圍內(nèi)，厭氧培養(yǎng)6—8天，進(jìn)行種母活化。(2)種母活化獲取種子母液將活化好的斜面種母，用接種環(huán)挑1-2環(huán)斜面種母菌苔，接種到已滅過菌的體積為500ml透明的內(nèi)裝液體培養(yǎng)基的玻璃瓶?jī)?nèi)(培養(yǎng)條件同上)，得到種子母液。球形紅假單胞菌種母活化過程所采用的培養(yǎng)基組成為氯化銨l.Og、乙酸鈉3.0g、硫酸鎂0.2g、碳酸氫鈉1.0g、磷酸氫二鉀0.2g、酵母膏1.0g、微量元素母液lml、螯合鐵母液lml、陳海水1000ml、瓊脂22-25g、PH=自然；1個(gè)大氣壓,20min滅菌。種母活化用的液體培養(yǎng)基組成同上，但不加瓊脂。(3)液體種子一級(jí)培養(yǎng)接種與培養(yǎng)條件液體種子一級(jí)培養(yǎng)基的配制與滅菌。液體種子一級(jí)培養(yǎng)，其培養(yǎng)基組成及配制同上述(2)液體培養(yǎng)基。將配置好的液體培養(yǎng)基裝入體積為500毫升透明的玻璃瓶?jī)?nèi)(培養(yǎng)基裝量為75-80%，余量為種子量)，1個(gè)大氣壓，20min滅菌，待用。將上述(2)已活化好的海參用球形紅假單胞菌液體種子母液，在無菌室內(nèi)倒入已滅過菌的體積為500毫升液體種子一級(jí)培養(yǎng)基的透明的玻璃瓶?jī)?nèi)，放置在自然太陽光下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為15°C32°C，時(shí)間為6-8天，種子培養(yǎng)成熟，含活菌數(shù)^5億個(gè)/ml，培養(yǎng)液呈鮮紅或深紅色，顯微鏡下檢查菌體運(yùn)動(dòng)活潑，整齊，即可供擴(kuò)繁培養(yǎng)用；(4)液體種子二級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)滅菌與培養(yǎng)條件液體種子二級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)基配制同上述(2)液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)液采用化學(xué)滅菌，陳海水采用次氯酸鈉與硫代硫酸鈉中和法處理，陳海水、次氯酸鈉與硫代硫酸鈉的容量與重量比例為It:100ml:8-10g;具體為1噸陳海水加入含量為8%的次氯酸鈉100ml，充分反應(yīng)6-8小時(shí)后，用8-10g硫代硫酸鈉中和，用碘化鉀一淀粉指示劑檢測(cè)，至呈現(xiàn)無色透明時(shí)即可。此法可以將水生生物、海洋小動(dòng)物及菌殺死(芽孢殺不死)。將海參用球形紅假單胞菌培養(yǎng)好的二級(jí)擴(kuò)繁液體種子以20-25%接種量接種，接到盛裝于5000毫升透明的玻璃瓶?jī)?nèi)(培養(yǎng)基量為75-80%，余量為接入的液體種子量)。在自然太陽光下，溫度為15°C32°C，培養(yǎng)時(shí)間為68天，培養(yǎng)成熟后，含活菌數(shù)^10億個(gè)/ml，培養(yǎng)液呈鮮紅或深紅色，顯微鏡下檢查菌體運(yùn)動(dòng)活潑，健壯，無污染、無異味、無異常現(xiàn)象。即可供大批量生產(chǎn)培養(yǎng)用。(5)液體大批量生產(chǎn)接種與培養(yǎng)條件液體大批量生產(chǎn)的培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)基配制同上述(2)液體培養(yǎng)基。滅菌采用次氯酸鈉一硫代硫酸鈉中和法，方法同上述(4)。液體大批量生產(chǎn)培養(yǎng)主要是盛裝容器和海水的滅菌處理，選擇盛裝容器為50公斤透明的塑料袋，培養(yǎng)液裝量為65-70%，再將二級(jí)種子液以30-35%接種量接入到塑料袋內(nèi)，用封口機(jī)將口密封，放置到塑料大棚內(nèi)吊置培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上述(4)，擴(kuò)繁培養(yǎng)成熟含活菌數(shù)^20億個(gè)/ml，培養(yǎng)液呈鮮紅或深紅色，顯微鏡下檢查將海參用球形紅假單胞菌運(yùn)動(dòng)活潑，菌體健壯，無污染、無異味、無異常現(xiàn)象，即可在生產(chǎn)中應(yīng)用。(6)液體離心濃縮及其產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)得到的液體狀，呈粉色、橙色、紅色、褐色和紫紅色，菌體大小為1.01.5pm或1.01.1pn，含活菌數(shù)^20億個(gè)/ml的海參用球形紅假單胞菌的大批量菌液，可作為海參的餌料和水質(zhì)凈化劑。離心濃縮過程為將海參用球形紅假單胞菌的大批量菌液在離心機(jī)上進(jìn)行5000rpm,20-25min離心,離心后用已處理的陳海水將海參用球形紅假單胞菌菌體稀釋至所要求的標(biāo)準(zhǔn)。產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)分別定為含活菌數(shù)為100億個(gè)/ml、150億個(gè)/ml、200億個(gè)/ml。海參用球形紅假單胞菌產(chǎn)品可以在常溫下可保存。保質(zhì)期為12個(gè)月。使用時(shí)可在海水中根據(jù)計(jì)算的用量進(jìn)行定量稀釋,在容器中搖勻，分散潑灑到養(yǎng)殖池中進(jìn)行應(yīng)用。海參用球形紅假單胞菌生產(chǎn)工藝為斜面菌種—液體種子母液—液體種子一級(jí)培養(yǎng)—液體種子二級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)—液體大批量生產(chǎn)培養(yǎng)—液體離心濃縮—紅假單胞菌產(chǎn)品。實(shí)施例2:海參用球形紅假單胞菌的培養(yǎng)因子優(yōu)選試驗(yàn)，按下列步驟操作種母活化同實(shí)施例1(1)、(2)。在實(shí)驗(yàn)室條件下，進(jìn)行培養(yǎng)因子的優(yōu)選試驗(yàn)，培養(yǎng)因子為乙酸鈉、酵母膏、微量元素母液、螯合鐵母液。試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用4因素5水平；5個(gè)處理編號(hào)為1、2、3、4、5。在500ml試劑瓶中，裝350ml經(jīng)次氯酸鈉處理的海水和其他營養(yǎng)成分，再按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入其它培養(yǎng)因子，然后每瓶接種球形紅假單胞菌種子液150ml，放在自然太陽光照下15t:32'C下，厭氧培養(yǎng)120小時(shí)以上，測(cè)定球形紅假單胞菌數(shù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)、菌數(shù)測(cè)定結(jié)果如表1所示，試驗(yàn)以不添加培養(yǎng)因子的培養(yǎng)基作為對(duì)照組。其他營養(yǎng)成分培養(yǎng)基含量配方組成如下1000ml無菌水中含氯化銨l.Og、硫酸鎂0.2g、碳酸氫鈉1.0g、、磷酸氫二鉀0.2g。表l.海參用球形紅假單胞菌培養(yǎng)基配方組合試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)處理2中培養(yǎng)因子的加入量為最佳組合(即1000ml培養(yǎng)液中含乙酸鈉2.0g、酵母膏l(xiāng)g、微量元素母液1ml、螯合鐵母液1ml)。本發(fā)明應(yīng)用時(shí)，組成培養(yǎng)基選取培養(yǎng)因子的順序?yàn)殛惡Ｋ⒁宜徕c、酵母膏、螯合鐵、微量元素母液。實(shí)施例3一種海參用球形紅假單胞菌的實(shí)施效果，可按下列步驟操作(1)種母活化同實(shí)施例1(1)，(2);(2)液體種子一級(jí)培養(yǎng)接種與培養(yǎng)條件同實(shí)施例1(3);(3)液體種子二級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)接種與培養(yǎng)條件同實(shí)施例l(4);(3)液體大批量生產(chǎn)接種與培養(yǎng)條件同實(shí)施例l(5);將海參用球形紅假單胞菌，按上述步驟擴(kuò)繁后，活菌數(shù)^20億個(gè)/ml，按500ml/666.7m2的用量，分散均勻的潑灑到50x666.7m2(水深2-2.5m)海參養(yǎng)殖池中，經(jīng)過20天繁殖，其技術(shù)指標(biāo)可達(dá)到如下表2所示表2.海參用球形紅假單胞菌的實(shí)施效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>使用時(shí)間2006年5月8日；分析時(shí)間2006年5月28日從測(cè)試分析結(jié)果可以看出使用球形紅假單胞菌后，海參養(yǎng)殖池中，溶解氧提高，銨鹽有所下降，COD、BOD值和pH值等項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到正常。本發(fā)明實(shí)施例中所采用的球形紅假單胞菌種母均可市購獲得，對(duì)其并無特殊要求。申請(qǐng)人采用了中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所分離、純化、鑒定的海參用球形紅假單胞菌^/zo4wwcfomo"似^/raera/cfeyi5T96J,在大連五島海珍品公司養(yǎng)殖基地的生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)行馴化、提純,獲得高濃度的海參用球形紅假單胞菌。其應(yīng)用效果非常好,已在大連地區(qū)的旅順、長(zhǎng)興島、交流島等沿海地區(qū)廣泛應(yīng)用,并且可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的商品化生產(chǎn)。經(jīng)馴化、提純的高濃度海參用球形紅假單胞菌革蘭氏染色呈陰性，無芽孢，能夠較好利用H2S，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)為:卵球形或球形,卵球狀直徑大小為1.0x15或10x1.lpm。極生單鞭毛或雙鞭毛，有光合膜系統(tǒng)。厭氧光照培養(yǎng)有光合膜生成，好氧，無光照培養(yǎng)不生成光合膜。在平皿培養(yǎng)基上觀察,菌落形態(tài)為圓形凸起或扁平，菌落直徑為2.0-5.0mm，邊緣整齊有規(guī)則,表面濕潤光滑、不透明。顏色為粉紅或紅色。海參用球形紅假單胞菌在海參育苗中應(yīng)用,可使海參成活率提高20%;在幼參養(yǎng)殖中應(yīng)用,可加快生長(zhǎng)發(fā)育增強(qiáng)免疫功能,提高抗病能力,促進(jìn)消化吸收,能明顯增加海參體色澤，從試驗(yàn)結(jié)果可以看出,海參用球形紅假單胞菌對(duì)海參變態(tài)、幼參和成參養(yǎng)殖都具非常理想的效果，受到當(dāng)?shù)睾B(yǎng)殖戶的歡迎。權(quán)利要求1.一種海參用球形紅假單胞菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟1)菌種活化將經(jīng)過活化的球形紅假單胞菌斜面菌種接種于液體培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)，得到球形紅假單胞菌種子母液；2)一級(jí)種子培養(yǎng)將步驟1)中得到的種子母液接種到一級(jí)種子培養(yǎng)基中，種子母液與一級(jí)種子培養(yǎng)液的重量百分比為20-25∶75-80，經(jīng)培養(yǎng)得到一級(jí)種子液；3)二級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)將步驟2)中得到的一級(jí)種子液接種到二級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)基中，一級(jí)種子液與擴(kuò)繁液體培養(yǎng)液的重量百分比為20-25∶75-80，經(jīng)培養(yǎng)得到二級(jí)種子液；4)三級(jí)大批量生產(chǎn)性培養(yǎng)將步驟3)中得到的二級(jí)種子液接種到三級(jí)大批量生產(chǎn)性培養(yǎng)基中，二級(jí)種子液與三級(jí)大批量生產(chǎn)性培養(yǎng)液的重量百分比為30-35∶65-70；經(jīng)培養(yǎng)，即得到液體狀，呈粉色、紅色和紫紅色，菌體大小為1.0～1.5μm或1.0～1.1μm，含活菌數(shù)≥20億個(gè)/ml的海參用球形紅假單胞菌的菌液；上述球形紅假單胞菌培養(yǎng)過程所采用的培養(yǎng)基組成均為氯化銨1.0-3.0g、乙酸鈉2.0-5.0g、硫酸鎂0.2-0.3g、碳酸氫鈉1.0-3.0g、磷酸氫二鉀0.2-0.5g、酵母膏1.0-3.0g、微量元素母液1-3ml、陳海水1000ml，其中含有螯合鐵5-10ppm、PH值自然；培養(yǎng)條件均為厭氧、光照1000-10000Lux、培養(yǎng)6-8天；所述陳海水為天然海水放置陰涼處儲(chǔ)放1-2周，待雜質(zhì)沉淀后過濾而成，鹽度為2.0-3.0％。2.按照權(quán)利要求1所述培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)基組成均為，氯化銨1.0g、乙酸鈉3.0g、硫酸鎂0.2g、碳酸氫鈉2.0g、磷酸氫二鉀0.2g、酵母膏1.0g、微量元素母液lml、陳海水1000ml，其中含有螯合鐵5ppm、PH值自然。3.按照權(quán)利要求1所述培養(yǎng)方法，其特征在于所述螯合鐵母液的配制過程為，在500ml去離子水中，加入乙二胺四乙酸二鈉13.1g、硫酸亞鐵12.5g、1個(gè)當(dāng)量的氫氧化鉀134ml，在堿性條件下進(jìn)行通氣反應(yīng)，反應(yīng)完全后液體呈棕紅色，將PH值調(diào)至5.5，即為螯合鐵母液；如果每升溶液中加入螯合鐵母液0.2ml，溶液中的螯合鐵濃度為lppm。4.按照權(quán)利要求1所述培養(yǎng)方法，其特征在于所述微量元素母液組成為，硼酸1.40g、硫酸錳0.14g、鉬酸銨0.26g、硫酸鋅0.06g、硫酸銅0.20g、氯化鈷0.01g、去離子水1000ml。5.按照權(quán)利要求1所述培養(yǎng)方法，其特征在于所述步驟1)和2)所采用的培養(yǎng)基和培養(yǎng)液經(jīng)高溫高壓滅菌，接種后屬純培養(yǎng)；步驟3)和4)所采用的培養(yǎng)液為化學(xué)滅菌，陳海水采用次氯酸鈉與硫代硫酸鈉中和法處理；陳海水、次氯酸鈉與硫代硫酸鈉的容量與重量比例為It:100ml:8-10g;具體為1噸陳海水加入含量為8%的次氯酸鈉100ml，充分反應(yīng)6-8小時(shí)后，用8-10g硫代硫酸鈉中和，碘化鉀指示劑反應(yīng)呈無色，再加入其它營養(yǎng)成份就是二級(jí)或三級(jí)液體培養(yǎng)基。全文摘要本發(fā)明涉及海洋微生物，是一種海參用球形紅假單胞菌的培養(yǎng)方法。將球形紅假單胞菌，經(jīng)過液體一級(jí)種子培養(yǎng)、液體二級(jí)擴(kuò)繁培養(yǎng)和三級(jí)大批量生產(chǎn)性培養(yǎng)，再經(jīng)離心濃縮制成高濃度的海參用球形紅假單胞菌產(chǎn)品。培養(yǎng)液含球形紅假單胞菌≥20億個(gè)活菌/ml；濃縮制成的產(chǎn)品含球形紅假單胞菌≥100億個(gè)活菌/ml。本發(fā)明采用菌種為常規(guī)的海參用球形紅假單胞菌，并以陳海水、螯合鐵、乙酸鈉等為主要原料，在厭氧、光照1000-10000Lux、15℃～32℃條件下進(jìn)行液體培養(yǎng)，該生產(chǎn)工藝操作簡(jiǎn)便，周期短、產(chǎn)品質(zhì)量高。在海參育苗和養(yǎng)成中應(yīng)用，可提高海參幼體各階段變態(tài)率、成活率，能促進(jìn)海參的生長(zhǎng)發(fā)育，并改善養(yǎng)殖池水體的生態(tài)環(huán)境，凈化水質(zhì)。文檔編號(hào)C12N1/20GK101353631SQ200710012288公開日2009年1月28日申請(qǐng)日期2007年7月27日優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日發(fā)明者麗劉,張仲良,王書錦,王向陽,王國安,胡江春,薛德林申請(qǐng)人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所