專利名稱：一種產朊假絲酵母自溶物的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種產朊假絲酵母自溶物的制備方法，尤其是一種不外加蛋白酶和核酸水解酶，利用酵母和米曲霉共生培養產生的內源酶系制備酵母有效降解產物(如核苷酸、肽類和氨基酸等)的制備方法。
背景技術：
酵母富含蛋白質、氨基酸、多種維生素及微量元素，是食品工業中已長期使用的安全微生物。酵母菌分泌的蛋白酶、消化酶、核苷酸、B族維生素等生理活性物質；酵母自溶物含多種氨基酸、肽類物質、呈味核苷酸、B族維生素、獨特的芳香類物質和細胞壁的主成分如葡聚糖和甘露寡糖等，兼具營養與調味兩大功效。因此酵母自溶物具有廣泛的應用價值和開發利用潛力。
酵母提取物的制備，首先要進行酵母細胞的降解，方法可通過自溶、酶解和酸解法得到，但現在一般得到酵母提取物都是自溶。細胞自溶是由于在特定條件下觸發了細胞消化自身結構的自溶酶的分解作用所致，一般分為誘導自溶和自然自溶，只不過它是利用微生物(酵母)菌體所自身產生的酶系(酶類為蛋白酶、核酸酶和葡聚糖水解酶)，在一定的條件下被活化而將自身生物大分子降解的過程。影響酵母自溶的主要因素有溫度、pH、時間酵母種類和自溶促進劑，自溶促進劑可以使酵母細胞壁軟化、破碎，有助于酵母內容物的滲出。
前期相關研究中，酵母自溶方法有內源性酶降解和/或結合外加酶(或酸堿)輔助降解，但依其自身的內源性酶不能得到深度降解。
計瑞星(申請號92109254.7)相對同步法控制酵母自溶制取調味劑，采用二種復合酶參與酵母自溶，加強與控制菌體蛋白質、核酸的相對同步降解，并索求其高效的降解轉化率，其特征是加入J3010復合蛋白酶和J503復合磷酸酯酶。
孫金聲(申請號93110178.6)以酵母為原料制取高鮮露醬之工藝方法，涉及一種天然調味料制備方法，其工藝流程是酵母菌體(面包酵母、啤酒酵母、酒精酵母)為原料進行預處理，酵母自溶，但無自溶促進劑添加。
殷蔚申等(申請號94106392.5)酵母精及其制備方法和應用，該方法包括將啤酒酵母或面包酵母用食用堿和食鹽進行預處理，經水洗、調pH值及調整漿液稠度后進行自溶處理，自溶處理過程還可加促溶劑乙醇、丙酮，還采用了外加的蛋白酶及麥芽根酶。
陳景華(申請號01108427.8)利用啤酒酵母泥生產核酸氨基酸調味料的方法，用啤酒酵母泥作蛋白源，經過除雜、脫苦后，以食鹽和外加的復合酶作促進劑。宮衡等(申請號02157795.1)一種啤酒酵母粉的制備方法，涉及啤酒酵母粉的加工方法，其主要通過外加風味促進劑和改良劑，控制酵母的適度自溶。
鄭海東等(申請號02131213.3)用啤酒廢酵母液制備酵母精的工藝，把廢酵母液升溫到50～55℃并保溫一段時間，調整pH5.5～6.5，加入食鹽、磷酸二氫鉀、氯化鎂，促進細胞破壁和自溶，保溫攪拌，再外加蝸牛酶和中性蛋白酶作為酶制劑，繼續保溫25～30小時使細胞完全溶解。
蘭敬墨(申請號02139053.3)酵母提取物制造方法，先將酵母除雜，調漿研磨，用食用堿和食鹽脫苦除臭，清洗，在自溶罐中升溫至58～60℃，添加磷酸，調節pH7.0，添加水解蛋白酶和風味蛋白酶，然后保溫24～48小時自溶。
上述方法單一利用酵母自身酶系其蛋白質和核酸水解度不高，因此需添加外源性酶，同時由于無醇類物質添加，其自溶物的風味帶有一定的酵母異臭，因此有必要開發風味良好的酵母抽提物產品。
酵母自溶物可作為一種新型天然營養風味調味料，將廣泛應用于食品行業起到風味強化和增香的作用，如方便面調味粉包、各種調味湯料、香精基質、膨化食品、餐飲調味底料等，并在營養保健品、工業培養基等方面也廣泛應用。

發明內容本發明即是為了提供一種利用酵母和米曲霉共生培養產生的內源酶系、不外加蛋白酶和核酸水解酶，制得產物富含蛋白肽、氨基酸、維生素、礦物質和核苷酸的產朊假絲酵母自溶物的制備方法。
為達到發明目的本發明采用的技術方案是一種產朊假絲酵母自溶物的制備方法，所述方法如下將產朊假絲酵母與米曲霉的共生培養產物置于帶攪拌的保溫容器中，調節固形物濃度，得到固形物質量濃度10～30％的酵母液，于pH4.5～6.8、45℃～55℃下，添加質量為酵母液質量0.2～2.5％的氯化鈉，并加入質量為酵母液質量1～5％的黃酒或白酒，以及質量為酵母液質量0.1％的硫胺素和質量為酵母液質量2％的葡萄糖，攪拌下自溶24小時，得到所述的產朊假絲酵母自溶物，所述共生培養產物的內源酶活為60～100U/g干菌。U為酶活單位，定義為在pH7.2，40℃，1min內產生1μg酪氨酸的酶量(g)為一個單位。
所述共生培養產物由如下方法制備得到共生培養基終濃度組成為麩皮5～20g/L，豆粕20～40g/L，麥芽汁50～200g/L，酵母膏0.5～2g/L，KH2PO42～8g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2.0g/L；調pH7.0，滅菌，冷卻至室溫，以1/6～1/4×105個細胞/mL培養基的接種量接種米曲霉孢子懸液，20～40℃、100～150r/min振蕩培養36～72h后，再以1/15～1/10×106個細胞/mL培養基的接種量接種產朊假絲酵母種子液，20～40℃、100～200r/min振蕩培養18～36h，獲得所述共生培養產物。可將所述共生培養產物即發酵液直接用于酵母自溶物的制備，也可將發酵液過濾，離心收集得到的菌絲體用于酵母自溶物的制備。
產朊假絲酵母優選為產朊假絲酵母1422。米曲霉優選為米曲霉3042。
所述米曲霉孢子懸液由如下方法制備得到將米曲霉菌種轉接于斜面培養基，30℃下培養48～120h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于斜面培養基上，30℃下恒溫培養96h，用無菌生理鹽水洗下米曲霉孢子，充分振蕩使孢子混合均勻，即得所述米曲霉孢子懸液。所述斜面培養基可為常用適用于米曲霉的培養基，本發明中采用豆汁斜面培養基，配制方法如下稱取一定量的黃豆，加入質量約為黃豆10倍的水浸泡過夜，煮沸2小時，用紗布過濾即得豆汁(加入蔗糖至終濃度為30g/L，即為豆汁液體培養基)；往豆汁中加入蔗糖至終濃度為30g/L和瓊脂至終濃度為20g/L即為豆汁斜面培養基。
所述產朊假絲酵母種子液由如下方法制備得到將假絲酵母菌種轉接于斜面培養基上，于30℃下恒溫培養36～96h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于液體培養基，30℃下恒溫培養72h，即得所述產朊假絲酵母種子液。所述斜面培養基和液體培養基可為常見適用于產朊假絲酵母的斜面培養基和液體培養基，本發明中采用麥芽汁斜面培養基和麥芽汁液體培養基，配制稱取一定量的麥芽顆粒，加四倍的水浸泡過夜，打碎磨漿，在72℃的恒溫水浴鍋中糖化一個小時左右，用碘液試驗檢查糖化完全為止，煮沸30分鐘滅酶，離心，得上清液即為麥芽汁(可直接作為麥芽汁液體培養基)，再加入瓊脂至終濃度為20g/L即為麥芽汁斜面培養基。
具體的，所述方法包括如下步驟(1)將米曲霉3042菌種轉接于豆汁斜面培養基，30℃下培養48～120h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于豆汁斜面培養基上，30℃下恒溫培養96h，用無菌生理鹽水洗下米曲霉孢子，充分振蕩使孢子混合均勻，獲得米曲霉孢子懸液；(2)將產朊假絲酵母1422菌種轉接于麥芽汁斜面培養基上，于30℃下恒溫培養36～96h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于麥芽汁液體培養基，30℃下恒溫培養72h，獲得產朊假絲酵母種子液；(3)共生培養基終濃度組成為麩皮10g/L，豆粕30g/L，麥芽汁100g/L，酵母膏1.5g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 1.1g/L；調pH7.0，滅菌，冷卻至室溫，以1/5×105個細胞/mL培養基的接種量接種步驟(1)所得米曲霉孢子懸液，30℃、120r/min振蕩培養48h后，再以1/12×106個細胞/mL培養基的接種量接種步驟(2)所得產朊假絲酵母種子液，30℃、180r/min振蕩培養24h，發酵結束后，過濾，離心收集菌絲體；(4)將步驟(3)所得菌絲體(內源酶活85U/g干菌)置于帶攪拌的保溫容器中，調節固形物濃度，得固形物質量濃度20％的酵母液，于pH4.5～6.8、45℃～55℃下，添加質量為酵母液質量0.2～2.5％的氯化鈉，并加入質量為酵母液質量1～5％的黃酒或白酒，以及質量為酵母液質量0.1％的硫胺素和質量為酵母液質量2％的葡萄糖，攪拌下自溶24小時，得到所述的產朊假絲酵母自溶物。
本發明所述酵母自溶物的制備方法的有益效果主要體現在無需外加蛋白酶和核酸水解酶，制得產物富含蛋白肽、氨基酸、維生素、礦物質，核苷酸，具有重大應用前景。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例1培養基配制豆汁斜面培養基組成稱取一定量的黃豆，加10倍質量的水浸泡過夜，煮沸2小時，用紗布過濾得豆汁；加入蔗糖終濃度為30g/L，瓊脂終濃度為20g/L即為豆汁斜面培養基。
麥芽汁斜面培養基組成稱取一定量的麥芽顆粒，加4倍質量的水浸泡過夜，打碎磨漿，在72℃的恒溫水浴鍋中糖化一個小時左右，用碘液試驗檢查糖化完全為止，煮沸30分鐘滅酶，離心，得麥芽汁，再加入終濃度20g/L的瓊脂即為麥芽汁斜面培養基。
麥芽汁液體培養基組成稱取一定量的麥芽顆粒，加4倍質量的水浸泡過夜，打碎磨漿，在72℃的恒溫水浴鍋中糖化一個小時左右，用碘液試驗檢查糖化完全為止，煮沸30分鐘滅酶，離心，得上清液即為麥芽汁，即麥芽汁液體培養基。
米曲霉3042以無菌操作方式，將米曲霉3042菌種(由杭州食品釀造有限公司提供)轉接于豆汁斜面培養基上，于30℃下培養96h，獲得斜面活化菌種；再以無菌操作方式，將活化菌種轉接于茄子瓶豆汁斜面培養基上，于30℃下恒溫培養96h，用50毫升無菌生理鹽水洗下米曲霉孢子，充分振蕩使孢子混合均勻，制成孢子懸液，細胞濃度為1.2×105個/mL；產朊假絲酵母1422以無菌操作方式，將產朊假絲酵母1422菌種(由中國工業微生物菌種保藏中心提供)轉接于麥芽汁(50Bê)斜面培養基上，于30℃下恒溫培養72h，獲得斜面活化菌種；再以無菌操作方式，將斜面活化菌種轉接于麥芽汁液體培養基，30℃下恒溫培養72h，即得所述產朊假絲酵母種子液，細胞濃度為2.3×106個/mL。
實施例2共生培養基終濃度組成為麩皮10g/L，豆粕30g/L，麥芽汁100g/L，酵母膏1.5g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 1.1g/L；1.5L三角瓶中裝液量300mL，調pH7.0，滅菌，冷卻至室溫，接入實施例1所得米曲霉孢子懸液60mL，30℃、120r/min振蕩培養48h后，再接入實施例1所得產朊假絲酵母種子液25mL，30℃、180r/min振蕩培養24h，發酵結束后，過濾，離心收集菌絲體，內源蛋白酶酶活為85U/g干菌。
實施例3取實施例2所得菌絲體20g(內源酶活82U/g干菌)置于帶攪拌的保溫容器中，調節固形物濃度為20％，調節pH5.8、溫度保持50±2℃，添加2.5g氯化鈉，并加入5g黃酒(市售含16％酒精的紹興黃酒)，以及0.1g的硫胺素和2g葡萄糖，攪拌下自溶24小時，得到所述的產朊假絲酵母自溶物，其中蛋白肽含量為38％、游離氨基酸含量為8.5％。四種核苷酸總含量為3.1％，分別為鳥苷酸(G)＝1.4％，肌苷酸(I)＝1.2％，腺嘌呤核苷酸(A)＝0.3％，胞嘧啶核苷酸(C)＝0.19％。
實施例4取實施例2所得菌絲體20g(內源酶活87U/g干菌)置于帶攪拌的保溫容器中，調節固形物濃度為20％，調節pH4.8、溫度保持48±2℃，添加2.0g氯化鈉，并加入1g白酒(北京紅星股份有限公司生產的56度白酒)，以及0.1g的硫胺素和2g葡萄糖，攪拌下自溶24小時，得到所述的產朊假絲酵母自溶物，其中蛋白肽含量為35％、游離氨基酸含量為8.1％。四種核苷酸總含量為3.4％，分別為鳥苷酸(G)＝1.6％，肌苷酸(I)＝1.3％，腺嘌呤核苷酸(A)＝0.3％，胞嘧啶核苷酸(C)＝0.20％。
權利要求
1.一種產朊假絲酵母自溶物的制備方法，其特征在于所述方法如下將產朊假絲酵母與米曲霉的共生培養產物置于帶攪拌的保溫容器中，調節固形物濃度，得到固形物質量濃度10～30％的酵母液，于pH4.5～6.8、45℃～55℃下，添加質量為酵母液質量0.2～2.5％的氯化鈉，并加入質量為酵母液質量1～5％的黃酒或白酒，以及質量為酵母液質量0.1％的硫胺素和質量為酵母液質量2％的葡萄糖，攪拌下自溶24小時，得到所述的產朊假絲酵母自溶物，所述共生培養產物的內源酶活為60～100U/g干菌。
2.如權利要求1所述的產朊假絲酵母自溶物的制備方法，其特征在于所述共生培養產物由如下方法制備得到共生培養基終濃度組成為麩皮5～20g/L，豆粕20～40g/L，麥芽汁50～200g/L，酵母膏0.5～2g/L，KH2PO42～8g/L，MgSO4·7H2O 0.5～2.0g/L；調pH7.0，滅菌，冷卻至室溫，以1/6～1/4×105個細胞/mL培養基的接種量接種米曲霉孢子懸液，20～40℃、100～150r/min振蕩培養36～72h后，再以1/15～1/10×106個細胞/mL培養基的接種量接種產朊假絲酵母種子液，20～40℃、100～200r/min振蕩培養18～36h，獲得所述共生培養產物。
3.如權利要求1或2所述的產朊假絲酵母自溶物的制備方法，其特征在于所述產朊假絲酵母為產朊假絲酵母1422。
4.如權利要求1或2所述的產朊假絲酵母自溶物的制備方法，其特征在于所述米曲霉為米曲霉3042。
5.如權利要求2所述的產朊假絲酵母自溶物的制備方法，其特征在于所述米曲霉孢子懸液由如下方法制備得到將米曲霉菌種轉接于斜面培養基，30℃下培養48～120h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于斜面培養基上，30℃下恒溫培養96h，用無菌生理鹽水洗下米曲霉孢子，充分振蕩使孢子混合均勻，即得所述米曲霉孢子懸液。
6.如權利要求2所述的產朊假絲酵母自溶物的制備方法，其特征在于所述產朊假絲酵母種子液由如下方法制備得到將假絲酵母菌種轉接于斜面培養基上，于30℃下恒溫培養36～96h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于液體培養基，30℃下恒溫培養72h，即得所述產朊假絲酵母種子液。
7.如權利要求1所述的產朊假絲酵母自溶物的制備方法，其特征在于所述方法包括如下步驟(1)將米曲霉3042菌種轉接于豆汁斜面培養基，30℃下培養48～120h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于豆汁斜面培養基上，30℃下恒溫培養96h，用無菌生理鹽水洗下米曲霉孢子，充分振蕩使孢子混合均勻，獲得米曲霉孢子懸液；(2)將產朊假絲酵母1422菌種轉接于麥芽汁斜面培養基上，于30℃下恒溫培養36～96h，獲得斜面活化菌種，再將斜面活化菌種轉接于麥芽汁液體培養基，30℃下恒溫培養72h，獲得產朊假絲酵母種子液；(3)共生培養基終濃度組成為麩皮10g/L，豆粕30g/L，麥芽汁100g/L，酵母膏1.5g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O 1.1g/L；調pH7.0，滅菌，冷卻至室溫，以1/5×105個細胞/mL培養基的接種量接種步驟(1)所得米曲霉孢子懸液，30℃、120r/min振蕩培養48h后，再以1/12×106個細胞/mL培養基的接種量接種步驟(2)所得產朊假絲酵母種子液，30℃、180r/min振蕩培養24h，發酵結束后，過濾，離心收集菌絲體；(4)將步驟(3)所得菌絲體置于帶攪拌的保溫容器中，調節固形物濃度，得固形物質量濃度20％的酵母液，于pH4.5～6.8、45℃～55℃下，添加質量為酵母液質量0.2～2.5％的氯化鈉，并加入質量為酵母液質量1～5％的黃酒或白酒，以及質量為酵母液質量0.1％的硫胺素和質量為酵母液質量2％的葡萄糖，攪拌下自溶24小時，得到所述的產朊假絲酵母自溶物。
全文摘要
本發明提供了一種產朊假絲酵母自溶物的制備方法，將產朊假絲酵母與米曲霉的共生培養產物(內源酶活為60～100U/g干菌)置于帶攪拌的保溫容器中，調節固形物濃度，得到固形物質量濃度10～30％的酵母液，于pH4.5～6.8、45℃～55℃下，添加質量為酵母液質量0.2～2.5％的氯化鈉，并加入質量為酵母液質量1～5％的黃酒或白酒，以及質量為酵母液質量0.1％的硫胺素和質量為酵母液質量2％的葡萄糖，攪拌下自溶24小時，得到所述的產朊假絲酵母自溶物。酵母自溶物可作為一種新型天然營養風味調味料，將廣泛應用于食品行業起到風味強化和增香的作用，并在營養保健品、工業培養基等方面也廣泛應用。
文檔編號C12R1/72GK101050427SQ20071006748
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月14日 優先權日2007年3月14日
發明者丁玉庭, 聶小華, 劉書來 申請人:浙江工業大學