專利名稱：：一種蠟蚧輪枝菌菌株及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種蠟階輪枝菌菌株及其在防治害蟲方面的應用。
背景技術：
：在煙粉虱、溫室白粉虱、蚜蟲和薊馬等害蟲的防治上，多采用傳統的化學防治方法。蠟階輪枝菌(V^rric"/z'"/w(Zimmermann)Viegas)是一禾中昆蟲病原真菌，作為一種活體生物農藥，具有不同于現有化學殺蟲劑的全新作用機理、對環境無污染、無殘留的特征，可以作為防治某些對蘇云金桿菌(Bt)產生抗藥性的昆蟲，替代傳統化學防治藥物，以大力發展生物農藥防治技術。
發明內容本發明的一個目的是克服現有技術的不足，提供一種蠟蚧輪枝菌菌株。本發明的另一個目的是提供所述蠟蚧輪枝菌菌株的應用。本發明的目的通過下述技術方案來實現提供一種蠟蚧輪枝菌菌株，所述菌株是從廣州地區被蟲生真菌自然侵染的煙粉虱蟲體上分離獲得，并回接于煙粉虱蟲體上復壯獲得蠟蚧輪枝菌菌株，對該菌株采用單孢子分離獲得純化菌株。該菌株為VL-N6，菌株保藏號為CCTCCNo:M208086，2008年6月10日在中國典型培養物保藏中心保藏。所述蠟蚧輪枝菌菌株屬絲孢目，輪枝孢屬。所述蠟蚧輪枝菌菌株菌落白色至奶油色，薄絮狀，背面無色至深淺不一的黃色。分生孢子梗不發達，似營養菌絲，其上有單生、對生或34個輪生的瓶梗，瓶梗纖細，大小因菌株及菌齡不同而差異較大，8.5—40x0.8—2.2nm;分生孢子橢圓形至圓柱形，兩端圓，單生，在瓶梗頂部聚集成頭狀，大小因菌株及而變異較大，2.3—10xl—2.6萍。本發明同時提供了所述蠟蚧輪枝菌菌株在制備防治煙粉虱、溫室白粉虱、蚜蟲或薊馬的藥物方面的應用，本發明的蠟蚧輪枝菌對防治十字花科蔬菜上的煙粉虱、溫室白粉虱、蚜蟲或薊馬等多種害蟲有效。本發明與現有技術相比，具有以下優點和有益效果(l)本菌株是從廣東省廣州地區被侵染的煙粉虱蟲體上分離獲得，為中國本土的菌株，并非從國外引進，能較好地適應本地的自然環境。(2)本發明所述的蠟蚧輪枝菌菌是一種昆蟲病原真菌，作為一種活體生物農藥，具有不同于現有化學殺蟲劑的全新的作用機理、對環境無污染、無殘留的特征，適應有機食品生產的要求。(3)本發明的蠟蚧輪枝菌對防治十字花科蔬菜上的煙粉虱、溫室白粉虱、蚜蟲和薊馬等多種害蟲有效。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一歩詳細說明本發明。下述實施例為本發明較佳的實施方式，本發明主要闡述所述菌株的發明思想，實施方式不一一在實施例中追述，但并不因此限制本發明，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，應為等效的置換方式，包含在本發明內。實施例11.1材料來源在廣州地區的蔬菜黃瓜上采集到一種被蟲真菌侵染的煙粉虱Sem/w."蟲尸。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA):將200g馬鈴薯煮熟取汁，然后在所取的汁液中加入20g葡萄糖和1720g瓊脂粉，加入水使總體積為1000ml并煮沸，經高壓滅菌，滅菌條件121。C，30min。無菌操作條件所有器皿和用具須經高壓滅菌，滅菌條件121°C，30min，接種等操作均在實驗室常規規定的超凈工作臺內進行。培養條件置于25X:光照(14L:IOD)恒溫箱中培養，待菌落形成后，轉移到PDA斜面，再轉入4。C冰箱貯存。1.2病原菌的分離、鑒定(一)病原菌的分離與純化(1)分離從采回的被蟲生真菌感染的煙粉虱蟲尸樣品上分離病原菌。利用5%的次氯酸鈉溶液對樣品進行表面消毒，消毒后的樣品在滅菌水中洗滌3次，并放入PDA平板中，倒置于25'C恒溫箱中培養，待菌落形成后，轉移到PDA斜面，再轉入4"C冰箱貯存。(2)復壯將分離到的菌株在PDA平板上培養15天，待產生分生孢子后加入0.03%吐溫一80的無菌水收集孢子，將孢子懸浮液在磁力攪拌器上攪拌20分鐘，用小型手動噴霧器將稀釋成lxl(^孢子/ml的孢子懸浮液均勻地噴于帶有煙粉虱的黃瓜葉片上，保溫90%以上，24小時。15天后挑取被感染的煙粉虱，按前面所述的方法分離到A分離株。(3)純化對A分離株在PDA平板上培養15d，待形成分生孢子后，挑取孢子制成lxl(f孢子/ml的孢子懸液，將懸液滴于放有蓋玻片的載玻片上，在生物顯微鏡下觀察，將一個液滴中只有一個分生孢子的玻片插入PDA培養基上，放在培養箱中培養，獲得B、C、D、E、F、G共6個分離株。(4)病原菌的鑒定根據病原菌的培養性狀、菌絲、分生孢子和產孢器的形態進行初歩鑒定。1、菌落形態描述將獲得的6個分離株接種到PDA平板上，于25C條件下培養。23天可見到長出白色的菌絲，菌落長絨狀、白色、中部隆起，第7天后開始產生分生孢子。菌落背面無色或黃色。2、菌絲和孢子形態描述菌絲白色，分生孢子梗不發達，似營養菌絲，單生、對生或34個輪生的瓶梗，瓶梗纖細，大小因菌株及菌齡不同而差異較大，8.5一40X0.8—2.2拜。分生孢子橢圓形至圓柱形，兩端圓，單生，在瓶梗頂部聚集成頭狀，大小因菌株及而變異較大，2.3—10X1—2.6,。(二)蠟蚧輪枝菌分離株的篩選蟲生真菌在遺傳、生態及生物學等方面具有多樣性，又存在有準性生殖現象，同種真菌的不同菌株對目標害蟲的致病力差異顯著，菌株不同，其LDm、LT5。可相差數倍至數十倍。高產優質菌株的篩選與獲得，是取得較好防治效果的首要前提。菌株篩選常用的4個指標分別為致病力、產孢量、孢子萌發率、菌落生長速率。本發明以這些指標為依據，篩選蠟蚧輪枝菌的優勢菌株。(1)供試菌株的處理經純化后獲得的蠟蚧輪枝菌B、C、D、E、F、G共6個分離株，在PDA平板于25:h0.5"C的恒溫箱(14L:10D)中培養。(2)供試昆蟲與寄主植物煙粉虱，將網室中飼養在黃瓜上的煙粉虱成蟲，接種到無蟲的黃瓜幼苗上，產卵12h后，清除成蟲，將黃瓜幼苗置于25:t0.5。C的光照培養箱中，待煙粉虱發育至2齡若蟲時待用。黃瓜(C"c"m/H如VwL.)，品種為萬吉青瓜，購自廣東省農科院蔬菜研究所，試驗苗均采用23片展開葉的盆栽苗。(3)菌落生長速率和產孢量的測定將6個分離株分別配制成lxlC^孢子/ml的分生孢子懸液，分別取lml懸液滴入PDA培養基上，用三角玻璃棒涂勻，待23d長出菌絲后用直徑為13mm的打孔器新鮮菌落，接種于PDA平板上，然后置于培養箱中培養(L:D=14:10)。每個菌株5次重復。第15d測定菌落直徑并收集分生孢子用血球計數板記數測定產孢量。具體操作如下用直尺測量菌落直徑，并用直徑為5mm的滅菌打孔器在培養皿中取菌絲生長均勻的菌塊，然后放入加有20ml0.03%吐溫一80無菌水中，在磁力攪拌器上攪拌20分鐘，使孢子充分分散，制成孢子懸浮液，用血球記數板記數測定產孢量。6個分離株的菌落生長速率和產孢量見表1，菌落生長速率B與C差異不顯著，B、C與其余的分離株之間差異顯著。生長15天后，分離株C與B、的產孢量差異不顯著，B、C與其它分離株之間的產孢量差異顯著，其中B、C分離株為較優的分離株。表1蠟蚧輪枝菌6個分離株生長速率和產孢量(15d)分離株菌落生長速率M±SE(cm)產孢量(分生孢子/mL)B4.85±0.06a2.08x10saC4.69±0.12a1.88xi08aD4.23±0.17b040xl08beE3.31±0.05c0.15xi08cF3.48±0.13c035X108beG4.25±0.04b0.75xl08b注表中同列數字后字母相同者表示差異不顯著(DMRT法)。(4)孢子萌發率的測定將6個分離株分別培養15天后，用無菌水收集孢子并制成懸液，用載玻片萌發法試驗。將孢子懸液滴在無菌載玻片上，置于底部鋪有濾紙的培養皿內，在皿內滴加34滴無菌水保濕(100，RH)，培養36h后鏡檢。每個處理3個重復。6個分離株中，B、E分離株與其它分離株之間的分生孢子萌發率差異顯著，結果見表2，其中B分離株的孢子平均萌發率最高，D分離株的孢子萌發率最低。表2蠟蚧輪枝菌6個分離株的分生孢子萌發率G6h)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注表中同列數字后字母相同者表示差異不顯著(DMRT法)。(5)分離株對煙粉虱若蟲致病力的測定將6個分離株培養15d后，用無菌水收集孢子，配制成濃度為lxl(^分生孢子/mL的孢子懸液。將帶有2齡煙粉虱若蟲的黃瓜葉片浸入懸液中，對照浸入無菌水中，20秒后取出，自然晾干。每處理為34片葉，每葉50100頭若蟲，3次重復。摘下處理過的葉片，插于盛有無菌水的花泥中，置于透明的保鮮盒內。再置于25K).5'C的光照培養箱中(L:D=14:10)。每日鏡檢并記錄感染死亡率，連續觀察14d。上述所有試驗數據均在數據處理軟件SAS系統上處理完成。致病力研究結果表明，所有分離株的侵染率與對照相比差異顯著。6個分離株在第34天開始表現出侵染癥狀，從第7d的侵染率可看出B、C分離株顯著高于D、F、H、G分離株，第14d時B分離株與其它分離株的侵染率差異顯著。從總體而言，分離株B的致病力較強，平均為89.23%(14d)，G分離株的侵染率較低，為45.22%(14d)，見表3所示。表3蠟蚧輪枝菌6個分離株對煙粉虱的致病力<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注表中同列數字后字母相同者表示差異不顯著(DMRT法)。(6)蠟蚧輪枝菌分離株的篩選在篩選優良分離株時，致病性和產孢量是重要的參考指標，孢子萌發率和菌落生長速率次之。在本發明中，菌落生長速率和產孢量分離株B、C與D、E、F、G差異顯著。從孢子萌發率和致病性上看，分離株B較為優良，具有致病性強、產孢量高等特點，由表1和表3可見。綜合比較各方面的因素，B分離株為最佳菌株，將其命名為VL-N6菌株，經貴州大學劉愛英教授鑒定為蠟蚧輪枝菌(論Wd歷"m^^m'KZimmermann)Viegas)，其菌株保藏號CCTCCNo:M208086,2008年6月10日在中國典型培養物保藏中心保藏。該蠟階輪枝菌(旨ft'"'ZZ/wn(Zimmermann)Viegas)菌株VL-N6，屬絲抱目，輪枝孢屬。該蠟蚧輪枝菌菌落背面無色或黃色，分生孢子梗單生或聚集成孢梗束，100xl.52,，壁光滑，透明，大多由著生46個瓶梗組成輪生體的輪狀分枝組成。瓶梗基部球形，或擬橢圓形膨大，上部細長，5.78xl2,。分生孢子柱形至梭形，光滑，透明至微淡紅色，34xl2,，無厚垣孢子。上述所有試驗數據均在數據處理軟件SAS系統上處理完成。實施例2蠟蚧輪枝菌VL-N6菌株對煙粉虱的致病力測定生物測定是檢測蟲生真菌對目標害蟲的致死程度和致死速率的有效手段之一，能為綜合評價該真菌的生物防治潛力提供重要的參考依據。本發明就蠟蚧輪枝菌VL-N6菌株對煙粉虱的致病力進行測定，以篩選出在防治時所用的最佳濃度。供試昆蟲與寄主植物煙粉虱，將溫室中飼養在黃瓜上的煙粉虱成蟲，接種到無蟲的黃瓜幼苗上，產卵12h后，清除成蟲，將黃瓜幼苗置于25±0.5"的光照培養箱中，待煙粉虱發育至2齡若蟲時待用。黃瓜(C"c"m"MrimsL.)，品種為萬吉青瓜，購自廣東省農科院蔬菜研究所，試驗苗均采用23片展開葉的盆栽苗。(1)供試菌株的處理經純化后獲得的蠟蚧輪枝菌VL-N6菌株，采用PDA平板，于25:b0.5。C的恒溫箱(14L:10D)中培養15天，加入0.3%吐溫一80的無菌水收集孢子，將孢子懸浮液在磁力攪拌器上攪拌20分鐘，待孢子被打散均勻后，用醫用紗布過濾去雜質，獲得孢子懸浮液，用血球記數板記數確定孢子濃度后，再配成lxl04、lxl05、lxl06、lxi07、lxl08孢子/ml5個濃度梯度待用。(2)分離株對煙粉虱若蟲的致病力測定將帶有煙粉虱2齡若蟲的黃瓜葉片浸入5個梯度的孢子懸浮液中，對照浸入含0.03%吐溫一80的無菌水中，20秒后取出，自然晾干。每處理為34片葉，每葉50100頭若蟲，3次重復。處理過的葉片連同黃瓜苗一起放置于25±0.5°C的光照培養箱中(L:D=14:10)。每日鏡檢并記錄感染死亡率，連續觀察14d。上述所有試驗數據均在數據處理軟件SAS系統上處理完成。(3)蠟蚧輪枝菌株對煙粉虱2齡的累計死亡率接種后的第34天，各處理區的若蟲開始表現出發病癥狀，隨后可觀察到蟲體上有少量白色的菌絲長出，幾天后蟲體表面出現孢子，接著煙粉虱死亡。表4為蠟蚧輪枝菌處理后2齡若蟲第7d、14d的累計死亡率，結果表明隨著濃度的增加煙粉虱2齡的死亡率也增加，同一濃度下隨著時間的增加，煙粉虱2齡的死亡率也增加。其中lxl(^和lxl()S處理區，煙粉虱的累計死亡率差異不顯著。表4蠟蚧輪枝菌對煙粉虱2齡若蟲的累計死亡率濃度7d14dlxl04O息l.(Bc0.55±4.23clxl050.34±0.98bc0.61±3.35bclxl060.42士1.64b0.70±2.38blxl070.57±2.45a0.89±3.06alxl080.63±2.31a0.94±3.15aCK0.06±0.87c0.08±0.68d注表中同列數字后字母相同者表示差異不顯著(DMKT法)。上述所有試驗數據均在數據處理軟件SAS系統上處理完成。實施例3蠟階輪枝菌VL-N6菌株對蚜蟲的致病力測定供試昆蟲與寄主植物蚜蟲，將網室中飼養在小白菜上的蚜蟲成蟲，接種到無蟲的小白菜幼苗上，產卵12h后，清除成蟲，將小白菜幼苗置于2510.5t:的光照培養箱中，待蚜蟲發育至3齡若蟲時待用。小白菜c"m/7&s7r/j1L.ssp.chinensis)，購自廣東省農禾斗院蔬菜研究所，試驗苗均采用68片展開葉的盆栽苗。(1)供試菌株的處理經純化后獲得的蠟蚧輪枝菌VL-N6菌株，在PDA平板上于25:b0.5。C的恒溫箱(14L:10D)中培養15天，加入0.03%吐溫一80的無菌水收集孢子，將孢子懸浮液在磁力攪拌器上攪拌20分鐘，待孢子被打散均勻后，用醫用紗布過濾去雜質，獲得孢子懸浮液，用血球記數板記數確定孢子濃度后，再配成lxl04、lxl05、lxl06、lxl07、lxl08孢子/ml5個濃度梯度待用。(2)分離株對蚜蟲的致病力測定將帶有蚜蟲3齡若蟲的小白菜葉片浸入5個梯度的孢子懸浮液中，對照浸入無菌水中，20秒后取出，自然晾千。每處理為34片葉，每葉10頭若蟲，3次重復。處理過的葉片放入滅菌的托盤中(25cmx35cm)，并放置于25:t0.5。C的光照培養箱中(L:D=14:10)。每日鏡檢并記錄感染死亡率，并更換新鮮的白菜葉片，連續觀察10天。上述所有試驗數據均在數據處理軟件SAS系統上處理完成。(3)蠟階輪枝菌菌株對蚜蟲3齡的累計死亡率接種后的第34天，各處理區的幼蟲開始表現出發病癥狀，如蟲體行動遲緩，隨后可觀察到蟲體上有少量白色的菌絲長出，幾天后蟲體表面出現孢子，煙粉虱逐漸死亡。表5為蠟蚧輪枝菌處理3齡若蟲后第7d、14d的累計死亡率，結果表明隨著濃度的增加，蚜蟲3齡的死亡率也增加，同一濃度下隨著時間的增加，蚜蟲3齡的死亡率也增加。其中lxl(^和lxl()S處理區，蚜蟲的累計死亡率差異不顯著。表5蠟蚧輪枝菌對蚜蟲3齡若蟲的累計死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注表中同列數字后字母相同者表示差異不顯著(DMRT法)。上述所有試驗數據均在數據處理軟件SAS系統上處理完成。權利要求1、一種蠟蚧輪枝菌菌株，其特征在于所述菌株為蠟蚧輪枝菌VL-N6，菌株保藏號CCTCCNoM208086，2008年6月10日在中國典型培養物保藏中心保藏。2、根據權利要求1所述蠟蚧輪枝菌菌株，其特征在于所述蠟階輪枝菌菌株屬絲孢目，輪枝孢屬。3、根據權利要求1所述蠟蚧輪枝菌菌株，其特征在于所述蠟階輪枝菌菌株菌落白色至奶油色，薄絮狀，背面無色至深淺不一的黃色。分生孢子梗不發達，似營養菌絲，其上有單生、對生或34個輪生的瓶梗，瓶梗纖細，大小因菌株及菌齡不同而差異較大，8.5—40x0.8一2.2pm;分生孢子橢圓形至圓柱形，兩端圓，單生，在瓶梗頂部聚集成頭狀，大小因菌株及而變異較大，2.3—10xl—2.6拜。4、一種權利要求l所述蠟蚧輪枝菌菌株的應用，其特征在于應用于制備防治煙粉虱、溫室白粉虱、蚜蟲或薊馬的藥物中。全文摘要本發明公開了一種蠟蚧輪枝菌菌株，所述菌株為蠟蚧輪枝菌VL-N6，菌株保藏號CCTCCNoM208086，2008年6月10日在中國典型培養物保藏中心保藏，所述菌株屬絲孢目，輪枝孢屬，是從廣州地區被蟲生真菌自然侵染的煙粉虱蟲體上分離獲得，將野生菌株回接于煙粉虱蟲體上復壯獲得蠟蚧輪枝菌菌株，對該菌株采用單孢子分離獲得純化菌株。經長期的侵染生物學研究和室內生物測定，蠟蚧輪枝菌對粉虱、蚜蟲等多種刺吸式口器害蟲和薊馬等害蟲具有很強的侵染殺蟲效果。文檔編號C12N1/14GK101319193SQ20081002916公開日2008年12月10日申請日期2008年7月1日優先權日2008年7月1日發明者任順祥,振黃申請人:華南農業大學