一種家蠶成品卵微孢子蟲(chóng)病光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種家蠶成品卵微抱子蟲(chóng)病光激化學(xué)發(fā) 光免疫檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 家蠶微抱子蟲(chóng)（Nosemabombycis，Nb)侵染家蠶引發(fā)的微粒子病是家蠶的毀滅性 傳染病，被確定為世界養(yǎng)蠶地區(qū)惟一的檢疫病害。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者在家蠶微粒子病的檢 測(cè)方面開(kāi)展了大量研究工作，取得較大進(jìn)展，但由于成本、實(shí)際靈敏度、操作的復(fù)雜性等方 面的影響，至今未能有一種技術(shù)能夠取代現(xiàn)行的光學(xué)顯微鏡檢測(cè)法。AlphaLISA技術(shù)是一種 基于微珠的化學(xué)發(fā)光的新型均相檢測(cè)技術(shù)，AlphaLISA的檢測(cè)原理類(lèi)似于雙抗夾心法，主要 依賴(lài)于Alpha供體微珠和受體微珠的相互作用，當(dāng)生物反應(yīng)使供體微珠和受體微珠相互接 近時(shí)，激光激發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而產(chǎn)生極大放大的信號(hào)，進(jìn)而被檢測(cè)到。
[0003] 近年來(lái)，該技術(shù)已在醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，但針對(duì)家蠶微 抱子蟲(chóng)的AlphaLISA檢測(cè)試劑盒，目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。與傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)相比， AlphaLISA檢測(cè)試劑盒具有更高的敏感性、精確性、均一性、背景低、廣泛的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍， 而且無(wú)需洗漆及樣本需求量極少等特點(diǎn)。該技術(shù)已在醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的 應(yīng)用。但是，針對(duì)家蠶微抱子蟲(chóng)AlphaLISA檢測(cè)國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種家蠶成品卵微抱子蟲(chóng)病 光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法。
[0005] 實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種家蠶成品卵微抱子蟲(chóng)病光激化學(xué) 發(fā)光免疫檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0006] 1)家蠶微抱子蟲(chóng)抱壁蛋白抗原的制備；先將微抱子蟲(chóng)的抱子用玻璃珠破碎12~ 13小時(shí)后，進(jìn)行DAPI染色觀察，并進(jìn)行篩選，視野里沒(méi)有看到發(fā)出藍(lán)光的抱子核，通過(guò)觀察 多個(gè)視野統(tǒng)計(jì)，所制備抱殼的純度為99 %W上，得到微抱子蟲(chóng)抱殼；然后，將所述微抱子蟲(chóng) 抱殼再用玻璃珠破碎12~13小時(shí)，得到抱殼碎片蛋白，即家蠶微抱子蟲(chóng)抱壁蛋白抗原；
[0007] 2)鼠抗家蠶微抱子蟲(chóng)抱壁蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立；W步驟1)制得 的抱殼碎片蛋白為抗原，免疫BALB/C小鼠，采用PEG1500細(xì)胞融合技術(shù)，并經(jīng)過(guò)亞克隆篩 選，得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0008] 3)家蠶微抱子蟲(chóng)抱壁蛋白單克隆抗體的腹水制備及純化；復(fù)蘇步驟2)制得的家 蠶微抱子蟲(chóng)抱壁蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，腹腔注射BALB/C小 鼠，收集腹水，并采用辛酸-硫酸錠法進(jìn)行抗體的純化；將純化的家蠶微抱子蟲(chóng)抱壁蛋白單 克隆抗體分為兩份，一份用生物素標(biāo)記，另一份與受體微球偶聯(lián)；
[0009] 4)家蠶微抱子蟲(chóng)AlphaLISA檢測(cè)方法的建立：采用雙抗體夾屯、法檢測(cè)微抱子蟲(chóng)；
[0010] ①家蠶微抱子蟲(chóng)抱壁蛋白單克隆抗體與生物素連接；取步驟3)制備的純化抗體 Img加入帶有濾膜的離屯、管中，W9000r/min離屯、8min;用標(biāo)記緩沖液（0.Imol/LNagCOg/NaHC〇3, pH9.5)重復(fù)洗漆6次；收集抗體，配制成50yL的抗體溶液，所述抗體溶液中包括家 蠶微抱子蟲(chóng)抱壁蛋白單克隆抗體、標(biāo)記緩沖液和5yL22mg/mL的生物素（用DMS0配制）； 將所述抗體溶液于室溫振動(dòng)解育化，利用帶有濾膜的離屯、管去除多余生物素，得到生物素 化抗體，并將生物素化抗體用IxAphaLISA緩沖溶液調(diào)整濃度為0. 5mg/mL;
[0011] ②家蠶微抱子蟲(chóng)抱壁蛋白單克隆抗體與受體微球偶聯(lián)；取步驟3)制備的純化 抗體0. 2mg加入帶有濾膜的離屯、管中，W9000r/min離屯、8min，用緩沖液（；0. 13mol/L， pH8.0PB巧重復(fù)洗漆6次后收集抗體，在抗體溶液中加入Img受體微球、lOyL25mg/ mLNaB&CN(用PBS緩沖液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用）、1. 25yL質(zhì)量濃度為10%的Tween-20,而后用 緩沖液將總體積補(bǔ)充到200yL，于37°C避光振蕩反應(yīng)4她；最后加入10yL65mg/mL駿甲 基哲胺鹽酸鹽溶液（用0. 8mol/L化OH配制，現(xiàn)配現(xiàn)用），于37°C避光解育比封閉未結(jié)合 位點(diǎn)，離屯、洗漆，得到已連接抗體的受體微球，用IxAphaLISA緩沖液調(diào)整受體微球濃度為 5mg/mL；
[0012] ⑨方法的建立；將步驟②制得的已連接抗體的受體微球與IxAphaLISA緩沖液按 照1:50~1:100的體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)襟E①制得的生物素化抗體與IxAphaLISA緩沖液按 照1:200~1:400的體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)辉谖⒖装逯蟹謩e加入標(biāo)準(zhǔn)品或待檢測(cè)樣品、連接抗體 的受體微球和生物素化抗體各25y以于37°C振動(dòng)解育20min，然后避光條件下加入鏈霉親 和素化的供體微球175yL于37°C振動(dòng)解育20min后，在A1地aScreen/Lisa檢測(cè)儀上檢測(cè) 信號(hào)值。
[0013] 進(jìn)一步，所述步驟⑨方法的建立具體步驟包括：
[0014] (1)將所述已連接抗體的受體微球與IxAphaLISA緩沖液按照1:50~1:100的體 積比進(jìn)行稀釋?zhuān)鳛樵噭? ;
[001引 （2)將所述生物素化抗體與IxAphaLISA緩沖液按照1:200~1:400的體積比進(jìn)行 稀釋?zhuān)鳛樵噭?;
[001 引（3)將10 XA1地aLISA assay Buffer用超純水稀釋成1 XA1地aLISA assay Buffer,將所述鏈霉親和素化的供體微球用IX A1地aLISA assay Buffer稀釋至終濃度為 40 yg/mL，作為試劑3;
[0017] (4)將家蠶蠶卵用PBS緩沖液化Olmol/l，抑7. 4)研磨后，用紗布過(guò)濾，取濾液于 500~GOOr/min離屯、2~3min，收集上清液，并將上清液再于3000~3500r/min離屯、10~llmin，收集沉淀，沉淀用PBS緩沖液化Olmol/l,抑7. 4)稀釋到5mU作為蠶卵研磨液；
[001引 妨向步驟（4)制備的蠶卵研磨液中加入家蠶微抱子蟲(chóng)，使家蠶微抱子蟲(chóng)在蠶 卵研磨液中的濃度依次為 107spores/mL、l06spores/血、l05spores/mL、104spores/血和 lO^spores/mL；
[0019] (6)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立；取步驟（5)各濃度含有家蠶微抱子蟲(chóng)的蠶卵研磨液、步驟 (1)制備的試劑1和步驟（2)制備的試劑2各25 ^以混合均勻，組成標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)組；取步 驟（4)制備的蠶卵研磨液、步驟（1)制備的試劑1和步驟（2)制備的試劑2各25UL，混 合均勻，作為陰性對(duì)照；將所述標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照的樣品均于37°C振動(dòng)解育20min， 然后于避光條件下加入175yL步驟（3)制備的試劑3,再于37°C振動(dòng)解育20min后，在 A1地aScreen/Lisa檢測(cè)儀上615皿處，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)組的各信號(hào)值；W標(biāo)準(zhǔn)品組各濃度 的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的信號(hào)值與陰性對(duì)照的信號(hào)值的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線；
[0020] (7)待測(cè)樣品的檢測(cè)；待測(cè)樣品采用與步驟（4)相同的方法進(jìn)行處理，得到待測(cè)樣 品研磨液；取待測(cè)樣品研磨液、步驟（1)制備的試劑1和步驟（2)制備的試劑2各25y以混 合均勻，于37°C振動(dòng)解育20min，然后于避光條件下加入175yL步驟3)制備的試劑3,再于 37°C振動(dòng)解育20min后，在A1地aScreen/Lisa檢測(cè)儀上615皿處，檢測(cè)待測(cè)樣品的信號(hào)值， 并根據(jù)步驟（6)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行計(jì)算，得到待測(cè)樣品研磨液中微抱子蟲(chóng)的濃度，進(jìn)而 檢測(cè)出家蠶蠶卵中的微抱子蟲(chóng)含量。
[0021] 進(jìn)一步，所述受體微球和供體微球均為納米級(jí)微粒；所述受體微球表面包被有化 學(xué)發(fā)光劑和銅系元素館；所述供體微球表面包被有鏈酶親和素和光敏劑。
[0022] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0023] 1、本發(fā)明方法先采用雜交瘤技術(shù)建立鼠抗家蠶微抱子蟲(chóng)抱壁蛋白單克隆抗體雜 交瘤細(xì)胞株；通過(guò)腹水純化制備鼠抗家蠶微抱子蟲(chóng)抱壁蛋白單克隆抗體；并通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證 了制得的單克隆抗體穩(wěn)定性良好，對(duì)家蠶微抱子蟲(chóng)具有特異性，可用于家蠶微抱子蟲(chóng)病原 的檢測(cè)。
[0024] 2、本發(fā)明將制得的鼠抗家蠶微抱子蟲(chóng)抱壁蛋白1G5單克隆抗體包被于AlphaLISA 法的受體微球上，并用生物素標(biāo)記制得的鼠抗家蠶微抱子蟲(chóng)抱壁蛋白2D9單克隆抗體，與 供體微球一并組成用于檢測(cè)微抱子蟲(chóng)的檢測(cè)試劑盒；采用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，A1地a 供體微珠和受體微珠相互作用，在680nm的激光照射下，供體微珠上的光敏劑將周?chē)h(huán)境 中的氧氣轉(zhuǎn)化為更為活躍的單體氧，單體氧擴(kuò)散至受體微珠，產(chǎn)生一系列的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)， 最后將能量傳遞到受體微珠上的館上，發(fā)射波長(zhǎng)為615nm，進(jìn)而進(jìn)行檢測(cè)。
[0025] 3、采用本發(fā)明用于檢測(cè)微抱子蟲(chóng)的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，在生物分子不存在特異的 相互作用時(shí)，單體氧無(wú)法擴(kuò)散到受體微珠，則不會(huì)有信號(hào)的產(chǎn)生，進(jìn)而帶來(lái)了更高的敏感性 和精確性，檢測(cè)結(jié)果更加精確。
[0026] 4、本發(fā)明用于檢測(cè)微抱子蟲(chóng)的試劑盒具有較高的均一性，且背景干擾少、背景低， 具有廣泛的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍；使用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)樣本需求量極少，且在檢測(cè)過(guò)程 中無(wú)需洗漆，簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程，具有良好的市場(chǎng)前景。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為破碎抱子總蛋白、破碎抱殼碎片、發(fā)芽抱子總蛋白和發(fā)芽抱殼碎片的 SDS-PAGE圖；
[0028] 圖2為鼠抗家蠶微抱子蟲(chóng)抱壁蛋白單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞融合后第8天的生長(zhǎng)情況 (10X10)；
[0029] 圖3為家蠶微抱子蟲(chóng)胞壁蛋白1G5單克隆抗體腹水純化前后SDS-PAGE電泳鑒定；
[0030] 圖4為自制試劑劑量一反應(yīng)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，實(shí)施例中所用原料如無(wú) 特殊說(shuō)明，即為普通市售；所采用的生物學(xué)試驗(yàn)如無(wú)特殊說(shuō)明，即為常規(guī)方法。
[0032] -、一種家蠶成品卵微