專利名稱：一種新型降解農作物秸稈的復合菌劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物應用技術領域，涉及微生物復合菌劑生產農用肥料技術，特別 用于秸稈堆腐還田的一種降解農作物秸稈的真菌復合菌劑。
背景技術：
農作物秸稈是農作物生產中的一種富含有效成分的可再生生物資源和潛在的 非競爭資源。農作物光合作用的產物有一半以上存在于秸稈中，除了大部分的碳元素 外，含有的有機質有纖維素、半纖維素、木質素、蛋白質、脂肪和灰分等，礦物質元素有 氮(0. 5 % -1. 5 % )、磷(0. 1 % -0. 5 % )、鉀(0. 74 % -2. 4 % )、鎂(0. 01 % -0. 4 % )、鈣 (0.2%-0.5%)、硅(1% -5% )和硫(0. 11%-0. 35%)等，是具有多種用途的可再生生物 資源。農作物秸稈不僅富含有效成分，而且產量和總量很大，1公斤水稻或1公斤小麥可產 生1. 5公斤秸稈，1公斤玉米可產生4公斤玉米秸稈，我國每年各類農作物秸稈總產量達7 億噸以上，占世界總秸稈量的30%左右，其中稻草秸稈約2. 3億噸，玉米秸稈約2. 2億噸， 花生和薯類藤蔓、甜菜葉等秸稈約1.0億噸。據聯合國環境規劃署(UNEP)統計，全球每年 農作物秸稈產量近20億噸，大部分都沒得到有效利用，在我國，農作物秸稈約有不足10% 用做飼料，應用技術處理利用的秸稈不足3.0%，其余大多數秸稈采用焚燒處理，全國每年 約有2/3的秸稈被直接焚燒掉。秸稈在田間焚燒時的高溫可造成地表水分大量蒸發，破壞 土壤的抗旱保濕能力，土壤中的有益蟲體和微生物的存活受損，從而影響土壤耕層生態環 境的良性循環，不僅如此，焚燒時的高溫潛在誘發火災的危險，產生的煙霧對公路、鐵路以 至民航起降均有影響，同時秸稈焚燒后產生的C02、C0、S02、N02、N20等有害氣體，會造成嚴重 的大氣環境污染。20世紀90年代以來，隨著農作物單產的大幅度提高，秸稈總量在迅速增 加，如何把農作物秸稈這一豐富的、可再生的生物資源充分利用起來，已是全球所共同面臨 的農作物生產中的一個主要問題。在農作物秸稈資源利用的諸多研究領域中，秸稈堆腐還田的技術研究占有重要的 一席之地。秸稈堆腐的方法主要有物理、化學和生物三大類，其中以應用微生物學方法腐 解效果最好，也就是我們常說的秸稈微生物堆腐方法，這種方法是利用微生物分解作用，促 使農作物秸稈發酵腐熟，使秸稈中所含的有機質及氮、磷、鉀等元素成為植物生長所需的營 養，并繁殖大量的有益菌微生物，成為優良的綠色堆腐有機肥。利用微生物堆腐方法使秸 稈還田，不僅可以提供植物生長所需的營養和有益菌微生物，而且可提高土壤水分的保蓄 能力，改善土壤性狀，增加土壤團粒結構，促進土壤有機質及氮、磷、鉀等含量的增加，改善 植株性狀。有資料顯示，每畝還田玉米秸稈500kg，等于施用土雜肥2500kg、碳銨11. 7kg、 過磷酸鈣6. 2kg、硫酸鉀4. 75kg，一年后土壤有機質含量相對增加0. 05% 0. 23%、全磷 平均增加0. 03%、速效鉀增加31. 2mg/kg、土壤容重降低0. 03 0. 16g/cm3、土壤孔隙度增 加2% -4%。多年持續秸稈還田，可提高磷肥利用率、補充鉀肥不足，地力可提高0.5%
個等級，平均增產幅度10%以上。然而，多年來農作物秸稈堆腐還田并沒有得到充分的 應用，其中最關鍵的原因是不管是哪一種方法都存在秸稈降解腐熟時間較長和很難徹底的
3問題。目前，秸稈微生物降解的許多研究和投入應用的微生物菌劑大都以秸稈纖維素的降 解為主要目標。分解菌和酶的研究集中在纖維素酶菌株的篩選，如木酶、青酶、曲酶及白腐 真菌纖維素酶等，菌劑產品被認定的有腐桿靈，CM菌、催腐劑等。但是，農作物秸稈中纖維 素、半纖維素和木質素均占有較大比例，其纖維素占40 %，半纖維素和木質素各占20 %左 右，(Tengerdy R P, Szakacs G. Bioconversionof Iignnocellulose in solid substrate fermentation [J], Biochemical Engineering, 2003,13 (2-3) : 167—179)。而且，秸稈中纖 維素結構復雜，它與木質素結合形成難以水解的“木質纖維素”，使得微生物分解的纖維 素酶無法直接接觸纖維素，在堆肥物料中纖維素常與一些更難分解的物質相復合，難以被 大多數微生物轉化利用，加上半纖維素與木質素的緊密相連，單一微生物的降解效果就更 加不理想。(杭怡瓊等“白腐真菌對稻草秸稈的降解及有關酶活性的變化”-《菌物系統》 2001. 20)。目前分解木質素和纖維素的微生物以及酶的研究多集中在依靠傳統的“酶活” 篩選，制取的酶廣泛應用于洗滌、印染和食品加工等，一直未能解決木質纖維素的自然快速 分解，用于結稈堆腐的更少(Zhang YHP, Himmel ME, MielenzJR. Outlook for cellu-lase improvement :Screening and selection strategies. Biotechnology Advances,2006, 24(5) 452-481) 0近年來人們開始注意菌群和復合菌劑的研究，但很多僅局限于實驗室試 驗，而且在現有技術中，大部分只針對木質素和纖維素中的一種進行篩選用來降解秸稈，造 成秸稈降解中或是纖維素降解率高而木質素降解率低，或是木質素降解率高而纖維素降解 率低，遠遠不能滿足農作物秸稈堆腐的實際需求。充分利用自然界多種微生物的協同關系， 篩選出高效穩定菌株復合系，以達到農作物秸稈的纖維素、半纖維素和木質素在堆腐過程 中能同步、快速降解的目的，是人們的共同目標。

發明內容
本發明的目的是利用微生物之間的協同關系，篩選出適用于農作物秸稈堆腐的高 效降解秸稈木質素和纖維素的真菌復合菌劑。本發明是將土壤和植物體樣本加入富集培養基中，經分離純化得到不同的真菌菌 株，從中篩選出高產纖維素酶或木質素酶的真菌菌株，通過優化組合配比得到高效降解農 作物秸稈木質素的毛木耳 Auricularia polytricha 916-1 和香菇 Lentinula Iateritia 939，以及高效降解農作物秸稈纖維素的球孢枝孢菌Cladosporium sphaerospermum GC2-2，組配成一種新型降解農作物秸稈的真菌復合菌劑。真菌復合菌劑成分體積配比為球 孢枝孢菌20% 25%、毛木耳20% 25%、香菇50% 60%。本發明通過以下技術路線完成1、菌株的收集、分離純化從土壤和植物體上采集樣品，保濕運回實驗室，將樣品置于無菌水中30分鐘后， 加入真菌富集培養基(蛋白胨 log、CMC-Na 10g、K2HPO4Ig, Na2C035g、MgSO4 · 7H20 0. lg、 FeSO4 · 7H20 0. 015g、MnSO4O. 05mg、酵母膏IOg, pH 6. 0)中富集培養，得到混合菌液。采用逐級梯度稀釋的方法至10_6，取10_3_10_5于土豆培養基(去皮馬鈴薯200g，蔗 糖20g，瓊脂15-20g，pH自然)上，30°C條件下培養4-5d，得到不同的真菌菌落，進一步分離 純化獲得純培養，共獲得15株真菌菌株。2、菌株的篩選
采用剛果紅纖維素培養基(K2HPO4O. 50g、MgSO4O. 25g、纖維素粉1. 88g、剛果紅 0. 20g、瓊脂14. 00g、明膠2. 00g、土壤浸汁100ml、水900ml, ρΗ7· 0)篩選產纖維素酶的真 菌菌株，根據菌落在剛果紅纖維素培養基產透明圈的大小挑選，產纖維素酶活高的真菌透 明圈大。然后將選出的真菌加入到菌株純培養基(CMC-Na 10g、蛋白胨3.0g、KH2P044. 0g、 MgSO4 ·7Η20 0. 03g、水 1000ml，ρΗ 6)中搖床培養，28 30°C，180r/min，時間 3 4d，得到 菌液。吸取 4ml 菌液加入發酵培養基(CMC-Na 10g、(NH4) 28044g、KH2P042g、MgS04 ·7Η200. 5g、 蛋白胨10g、牛肉膏5g、水1000ml)培養48h，然后每24h采用濾紙酶活和CMC酶活的方法測 定一次纖維素酶活，共測6次。按上述方法反復三次，最終得到2株高產纖維素酶的真菌 一株為球孢枝孢菌Cladosporiumsphaerospermum GC2_2(簡稱球孢枝孢菌GC2-2，下同)、 另外一株為黑曲霉Aspergillus niger GC1-2 (簡稱黑曲霉GC1-2，下同)，其中球孢枝孢 菌GC2-2的基因序列已登入GenBank上，并得到登錄號分別為HM347335。采用PDA-Bavendamm顯色培養基(去皮馬鈴薯200g，蔗糖20g，0. 4mmol · Γ1 鞣酸，瓊脂15_20g，ρΗ自然)篩選能產木質素酶的真菌菌株。能產木質素酶的真菌在 PDA-Bavendamm培養基上產棕褐色環，酶活活性越大產生得到褐色環越大。根據褐色環 的大小篩選，得到4株高產木質素酶的真菌。將挑選的真菌加入到菌株純培養基(玉米 粉2%，麥麩2%，葡萄糖1%，酵母膏0.3%，磷酸二氫鉀0. 1%，硫酸鎂0. 1% )中搖床培 養，25-28°C，180r/min，時間5 6d，得到菌液，取4_6ml菌液加入到發酵培養基(去皮馬 鈴 200g, KH2P043g, MgSO4 · 7Η203· lg，酒石酸銨 5g，稻草粉(過 60 目)20g，微量元素 50ml, pH5. 0 (用H2SO4調))，培養30d，每隔兩天采用木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶酶 活的方法測定木質素酶活，按上述方法反復三次，最終得到2株產木質素酶的真菌菌株，均 屬于白腐菌，一株為毛木耳Auricularia polytricha916_l (簡稱毛木耳916-1，下同)，另 一株為香菇Lentinula Iateritia 939 (簡稱香菇939，下同)，其中毛木耳916-1和香菇 939的基因序列均已登入GenBank上，登錄號分別為HM347336和HM347337。3、真菌復合菌劑配比球孢枝孢菌GC2-2和黑曲霉GC1-2分別加入到菌株純培養基(CMC_Nal0g、蛋白胨 3. 0g、KH2P044. 0g、MgS04 ·7Η20 0. 03g、水 1000ml，pH 6)中搖床培養，28°C 30°C，180r/min， 時間3 4d，得到球孢枝孢菌GC2-2菌液和黑曲霉GC1-2菌液。毛木耳916-1和香菇939分別加入到菌株純培養基(玉米粉2%，麥麩2%，葡萄 糖1%，酵母膏0.3%，磷酸二氫鉀0. 1%，硫酸鎂0. 1% )中搖床培養，25-28°C，180r/min， 時間5 6d，得到毛木耳916-1菌液和香菇939菌液。將上述4種菌液進行配比組合培養，按照不同組合處理將每組菌液充分混合均 勻，分別接入發酵產酶培養基(5%蛋白胨、0.5%纖維素、0.5% NaCUO. 2% CaC03、0. 酵 母粉、PH自然)中培養，每隔2天測定一次酶活，確定最佳的復合菌劑組成。4種菌液的9 組組合如表1.表1.配比組合表
權利要求
一種新型降解農作物秸稈的復合菌劑，其特征在于，所述的復合菌劑由球孢枝孢菌、毛木耳、香菇菌株配比獲得，其中球孢枝孢菌∶毛木耳∶香菇的體積比為20％～25％∶20％～25％∶50％～60％。
2.權利要求1的新型降解農作物秸稈的復合菌劑，其特征在于，所述的毛木耳、香菇、 球孢枝孢菌分另1J為毛木耳 Auricularia polytricha 916-1,香 Lentinula Iateritia 939,球抱枝抱菌 Cladosporium sphaerospermum GC2-2。
3.權利要求2所述的新型降解農作物秸稈的復合菌劑，其特征在于，所述的毛木 耳、香菇、球孢枝孢菌為將土壤和植物體樣本加入真菌富集培養基，經分離純化篩選得 到的真菌菌株，真菌富集培養基的組成為蛋白胨10g、CMC-Na 10g、K2HPO4Ig, Na2C035g、 MgSO4 · 7Η200· lg、FeSO4 · 7Η20 0. 015g、MnSO4O. 05mg、酵母膏 IOg, pH 值為 6。
全文摘要
從土壤和植物體樣本中分離純化得到不同的真菌菌株，篩選出高產纖維素酶和木質素酶的真菌菌株，通過優化組合配比得到高效降解秸稈木質素或纖維素的球孢枝孢菌、毛木耳和香菇，組配成真菌復合菌劑。用于農作物秸稈堆腐，不需要高溫條件，10-15天即可使農作物秸稈達到腐熟。
文檔編號C12N1/00GK101948753SQ201010264890
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月27日 優先權日2010年8月27日
發明者劉瑩瑩, 周伏忠, 李冠杰, 王繼雯, 甄靜, 謝寶恩, 陳國參 申請人:河南省科學院生物研究所有限責任公司