專利名稱：氧化微桿菌及其制備手性雙三氟甲基苯乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種氧化微桿菌以及利用該菌制備光學(xué)純(R) -1-[3，5-bis (trif luoromethyl) phenyl] ethanol 的方法。
背景技術(shù)：
光學(xué)活性(R)-l-[3, 5-bis (trif luoromethyl) phenyl] ethanol (中文名稱為(R)-1-3，5-雙三氟甲基苯乙醇，CAS號(hào)為127852-28-2，以下簡(jiǎn)寫為P)是Merck公司研發(fā)生產(chǎn)的手性藥物Aprepitant (阿瑞批坦，商品名Emend)、fosapr印itant dimeglumine的關(guān)鍵手性中間體，其中fosapr印itantdimeglumine是Apr印itant的注射劑形式。手性藥物Aprepitant屬于人P物質(zhì)/神經(jīng)激肽1 (NK-I)選擇性高親和性受體阻斷劑，具有全新的藥理作用機(jī)制，主要通過(guò)阻斷大腦惡心和嘔吐信號(hào)的新穎機(jī)理發(fā)揮作用，用于預(yù)防放化療引起的急性或延遲性嘔吐等具有很好的療效。分子結(jié)構(gòu)式如下圖所示
ο
F
(R)-1 -(3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl)ethanolAprepitant手性藥物中間體P可通過(guò)生物催化法和化學(xué)合成法制備。目前已經(jīng)發(fā)展了多種化學(xué)合成方法(如 Noyori R et al. ACC. Chem. Res. , 1997, 30,97-102 ；Hansen etal. Tetrahedron =Asymmetry, 2003，14，3581-3587)，但是這些方法往往存在一些不足，如對(duì)映體過(guò)量值不高，合成過(guò)程需要重金屬催化劑和許多有毒、腐蝕性試劑，或者產(chǎn)率低分離提純困難，因此較難應(yīng)用到工業(yè)原料藥生產(chǎn)中。化學(xué)合成方法中，Merck公司開(kāi)發(fā)的以(S，R)-l-amino-2-indanol手性配體與[Ru (p-cymene) C12] 2作用生成上述手性中間體的工藝具有很高的產(chǎn)率和ee值，已被Merck公司申請(qǐng)專利而受到保護(hù)，從而壟斷了該領(lǐng)域的醫(yī)藥市場(chǎng)。生物催化具有高選擇性、反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，作為化學(xué)催化過(guò)程的重要補(bǔ)充受到廣泛關(guān)注。發(fā)展高效的生物催化方法生產(chǎn)上述中間體也是避開(kāi)專利保護(hù)的重要途徑之一。該中間體可通過(guò)消旋體醇或酯的動(dòng)力學(xué)拆分和潛手性酮的不對(duì)稱還原獲得。其中，消旋體醇或酯的動(dòng)力學(xué)拆分是利用酯酶或脂肪酶對(duì)外消旋仲醇進(jìn)行對(duì)映選擇性酯化或轉(zhuǎn)酯化拆分，或者對(duì)外消旋酯進(jìn)行對(duì)映選擇性水解拆分(如Vankawala P J，etal. Synthetic Commun.，2007，37，3439_；3446)，這種方法的主要優(yōu)點(diǎn)在于商品化的脂肪酶種類多，酶源廣，容易篩選。但該方法目標(biāo)對(duì)映體產(chǎn)物的最高收率不超過(guò)50%，而且需事先合成外消旋的底物醇和酯，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)而言，既增加了操作步驟，也提高了生產(chǎn)成本。近年來(lái)，研究者開(kāi)始篩選商品化的氧化還原酶或者表達(dá)這類酶的微生物全細(xì)胞催化 3，5-bis-trif luoromethyl acetophenone (底物 S)還原成(R)-I-[3，5-bis (trif luoromethyl) phenyl] ethanol (產(chǎn)物P)。但由于絕大部分微生物所產(chǎn)生的氧化還原酶都遵守I^relog規(guī)則、催化酮生成(S)-構(gòu)型醇，而遵守anti-Prelog規(guī)則生成相應(yīng)的㈨-構(gòu)型醇的較少，因此目前該生物催化過(guò)程相關(guān)報(bào)道也較少。該生物催化過(guò)程中，商品化純酶具有高活力，高對(duì)映體選擇性(> 99% ee)，反應(yīng)體系較為簡(jiǎn)單，副產(chǎn)物少，產(chǎn)物易分離純化，已可以實(shí)現(xiàn)輔酶原位再生等優(yōu)點(diǎn)(Pollard D，et al. Tetrahedron =Asymmetry,2006,17，5M-559)，但酶的穩(wěn)定性和使用壽命有限，商品化酶本身價(jià)格昂貴，還需要添加較為昂貴的輔酶循環(huán)底物(NAD+或NADP+)，從而導(dǎo)致最終產(chǎn)品價(jià)格較高，后續(xù)工藝改造空間也較小。同時(shí)購(gòu)買商品化酶用于商業(yè)化生產(chǎn)還涉及知識(shí)產(chǎn)權(quán)問(wèn)題，對(duì)于想研發(fā)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新工藝必將會(huì)有局限。與之不同，全細(xì)胞催化具有酶穩(wěn)定性較高、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，并且能夠利用自身的輔酶和輔酶再生體系催化反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，使之易于規(guī)模化和工業(yè)化。然而，目前利用全細(xì)胞生物催化獲得該手性醇存在一些問(wèn)題如生產(chǎn)能力較低，且微生物體內(nèi)往往含有多種酮還原酶，導(dǎo)致最終酶選擇性較低、副產(chǎn)物較多(Homarm篩選的4株產(chǎn)物R-型微生物，ee 值最高 92%。Homann M J, et al. Tetrahedron，2004，60，789-797)。Gelo-Pujic等(Gelo-Pujic M, et al. Tetrahedron :Asymmetry,2006，17,2000-2005)通過(guò)篩選乙醇脫氫酶轉(zhuǎn)化底物S，得到來(lái)源于Lactobacillus kefir的乙醇脫氫酶可以得到P (ee > 99% )，但需要添加NAD (P)H用于輔酶循環(huán)且產(chǎn)率僅有15%。以該菌原始菌株作全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化，底物濃度為4. 8g/L時(shí)，16h也僅能轉(zhuǎn)化 31%。Kurbanoglu 等(Kurbanoglu et al. Tetrahedron =Asymmetry, 2009, 20,2759-2763)報(bào)道了以Penicilliumexpansum全細(xì)胞轉(zhuǎn)化底物S，經(jīng)5 轉(zhuǎn)化終產(chǎn)物濃度也僅有3. 35g/L，轉(zhuǎn)化率僅為76%，離實(shí)際應(yīng)用還有很大的距離。因此，篩選新型高效微生物酶源是發(fā)展底物S轉(zhuǎn)化生成產(chǎn)物P的生物催化過(guò)程的重要突破口之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新篩選的氧化微桿菌，該菌株是從果園土壤中富集、分離并經(jīng)過(guò)多輪篩選后獲得的，于2010年7月16日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCCM 2010179，并利用該菌具有生產(chǎn)高活力、對(duì)映選擇性強(qiáng)的羰基還原酶特性，還原底物 3，5-bis-trifluoromethyl acetophenone (底物 S)制備光學(xué)純(R)_l_[3，5-bis (trif luoromethyl) phenyl] ethanol (產(chǎn)物P)，從而以生物催化的方法制備高光學(xué)純度的手性藥物阿瑞吡坦的中間體P。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案氧化微桿菌(Microbacteriumoxydans C3, CCTCC M 2010179)。篩選方法于果園采集土樣，以苯乙酮為唯一碳源并添加無(wú)機(jī)鹽經(jīng)2輪富集樣品，涂布于平板上，經(jīng)分離單菌落初步篩選產(chǎn)羰基還原酶菌株；再將這些菌株轉(zhuǎn)接于含有營(yíng)養(yǎng)較為豐富的培養(yǎng)基的M孔板中，培養(yǎng)Mh，而后加入底物S進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化3 后，測(cè)定產(chǎn)物生成情況和產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值，篩選得到可轉(zhuǎn)化底物S生成目的產(chǎn)物P的菌株；并將產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值高的菌株進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化。經(jīng)篩選得到本發(fā)明涉及的氧化微桿菌C3。具體方案見(jiàn)實(shí)施例1和2。采用上述氧化微桿菌作催化劑制備光學(xué)純P的方法包括下列步驟
1、菌株培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g/L，蛋白胨3g/L，牛肉膏1. 5g/L，酵母粉4g/L，NaCl1. 2g/L, K2HPO4O. 6g/L, KH2PO4O. 4g/L, MgSO4O. 6g/L。培養(yǎng)方法挑取少許斜面種子接種于上述組分培養(yǎng)基中，30°C，200 250rpm培養(yǎng)16 Mh，制備種子液。將此種子液以0. 5% 2%的接種量轉(zhuǎn)接至上述相同組分培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件27 33°C，200 ^Orpm，24 48h。2、生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化經(jīng)上述培養(yǎng)過(guò)程，可以獲得的菌體濃度以濕重計(jì)為5 7g/L。在上述菌體培養(yǎng)體系中加入底物S，并加入輔酶循環(huán)底物。本發(fā)明的輔酶底物為體積百分比濃度為4% 20%的異丙醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% 6%的葡萄糖。繼續(xù)培養(yǎng)菌體并同時(shí)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，時(shí)間M 88h。培養(yǎng)條件27 33°C，200 ^Orpm，培養(yǎng)的溫度、轉(zhuǎn)速可以與第1步的菌體生長(zhǎng)階段相同，也可以不同。底物S直接加入轉(zhuǎn)化體系中或者先以助溶劑溶解后，配成質(zhì)量濃度為30 % 60 %的母液后再加入到反應(yīng)體系，助溶劑為二甲亞砜或者二甲基甲酰胺或者異丙醇中的一種或一種以上的混合物。加入到轉(zhuǎn)化體系中的底物終濃度為1 30g/L。3、休止細(xì)胞轉(zhuǎn)化將第1步培養(yǎng)的菌體以10，OOOrpm離心收集，用pH值為6 8、0. IM濃度的磷酸鉀緩沖溶液或者磷酸鈉緩沖液或者Tris-HCl緩沖液洗滌2次，而后以上述緩沖液配制成以菌體濕重計(jì)為50 300g/L濃度的菌懸液，加入底物和輔酶循環(huán)底物(方法同第2步)。加入到轉(zhuǎn)化體系中的底物終濃度為1 30g/L，轉(zhuǎn)化溫度為20 40°C，轉(zhuǎn)速為200 280rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為5 48h。4、產(chǎn)物萃取和測(cè)定向第2和第3步的轉(zhuǎn)化結(jié)束體系中加入1 3倍體積的乙酸乙酯萃取，用普通氣相色譜柱(SGE，澳大利亞，AC-5,30mX0. 22)測(cè)定轉(zhuǎn)化率，手性氣相柱(CHIRASIL-DEX CB,瓦里安，25mX0. 25)測(cè)定產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值。本發(fā)明采用篩選的氧化微桿菌作為催化劑對(duì)底物S進(jìn)行對(duì)映選擇性不對(duì)稱還原反應(yīng)制備得到高光學(xué)純度的手性藥物阿瑞吡坦的中間體P，此方法為該手性中間體生物催化合成提供了新的可供選擇的路徑。同時(shí)，該生物催化過(guò)程利用微生物全細(xì)胞自身的酶系，添加廉價(jià)的輔酶循環(huán)底物即可實(shí)現(xiàn)輔酶循環(huán)。該生物催化劑易于制備，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少，成本低，且可獲得的產(chǎn)物濃度較高，易于提取分離，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用開(kāi)發(fā)價(jià)值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1菌株篩選產(chǎn)羰基還原酶菌株篩選于果園采集土壤樣品，富集于含有苯乙酮(濃度為ImM)的MSM培養(yǎng)基中，30°C，220rpm培養(yǎng)7天。從富集液中取出加入到含有苯乙酮(濃度為ImM)的MSM培養(yǎng)基中進(jìn)行再次富集，30°C，220rpm繼續(xù)培養(yǎng)7天。MSM培養(yǎng)基配方為Na2HP042g/L，KH2P041g/L，NH4C1 0. 4g/L，MgC120. 4g/L。將第二次富集培養(yǎng)液稀釋至合適濃度，并涂布至篩選平板上(MSM+苯乙酮ImM+酵母粉0. lg/L+瓊脂粉15g/L)，30°C培養(yǎng)1 3天，每支平板上可見(jiàn)許多微生物單菌落，這些菌株可能為產(chǎn)羰基還原酶菌株。進(jìn)一步進(jìn)行底物3，5-bis-trif luoromethyl acetophenone (底物幻生物催化篩選，以期獲得高對(duì)映選擇性轉(zhuǎn)化該底物的微生物菌株。以底物S進(jìn)行生物催化篩選將富集平板中的單菌落用無(wú)菌牙簽逐一接入M孔篩選板各孔(Costar，美國(guó))進(jìn)行培養(yǎng)(每孔裝有培養(yǎng)基lml)，3(TC，240rpm培養(yǎng)Mh。培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏1.5g/L，酵母粉1.5g/L，NaCl 5g/L。6000rpm離心收集菌體，用磷酸鉀緩沖液(pH 7.0,0. 1M)洗滌2次，再加入Iml緩沖液重懸菌體，而后加入底物5mg，3(TC，270rpm進(jìn)行生物催化篩選試驗(yàn)。轉(zhuǎn)化3 后，以200 μ 1乙酸乙酯萃取。以氣相手性柱(CHIRASIL-DEX CB，瓦里安，25mX 0. 25)分析產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量值，得到產(chǎn)00-仲醇菌株8株。其中1株為本發(fā)明涉及的氧化微桿菌菌株C3，產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值大于99%。實(shí)施例2篩選菌株的鑒定為確定該菌株分類地位并詳細(xì)了解其性能，對(duì)該菌株進(jìn)行了初步鑒定。該菌株具有以下特征菌落淺黃色或黃色菌落，表面光滑，邊緣整齊，不透明。生理生化特征革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，桿狀，好氧，產(chǎn)羰基還原酶。16S rRNA鑒定基因組DNA為模板，以細(xì)菌通用引物27f和1492r擴(kuò)增16S rRNA序列。其序列如下(1486bp)AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGTGAACACGGAGCTTGCTCTGTGGGATCAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCGCTGGAAACGGCGTCTAATACTGGATATGCGACGTGATCGCATGGTCTGCGTCTGGAAAGAATTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAAAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGCTGTGAAATCCGGAGGCTCAACCTCCGGCCTGCAGTGGGTACGGGCAGACTAGAGTGCGGTAGGGGAGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGATCTCTGGGCCGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGGGTGGGGAGCAAACAGGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACCCCGTAAACGTTGGGAACTAGTTGTGGGGTCCATTCCACGGATTCCGTGACGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGCGGAGGCATGCGGATTAATTCGATGTAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACGAGAACGGGCCAGAAATGGTCAACTCTTTGGACACTCGTAAACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCATGGGATACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCAATACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCAAAAAGCCGGTCCCAGTTCGGATTGAGGTCTGCAACTCGACCTCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTCGGTAACACCTGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTCGAAGGTGGGATCGGTAATTAGGACTAAGTCGTAACAAGGTAGCC經(jīng)NCBI的blast比對(duì)，該菌與氧化微桿菌(Microbacterium oxydans)同源性為99%。結(jié)合菌落和生理生化特征，初步可確定為氧化微桿菌，實(shí)驗(yàn)室自編號(hào)為Microbacterium oxydansC3。2010年7月16日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC M 2010179。實(shí)施例3 5CCTCC M 2010179生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化底物S生成產(chǎn)物P。實(shí)施例3培養(yǎng)基配方和種子液制備方法如前所述。將種子液以的接種量轉(zhuǎn)接至50ml培養(yǎng)基中O50ml培養(yǎng)搖瓶裝液50ml)。培養(yǎng)條件30°C，240rpm，Mh。此時(shí)菌體濃度以濕菌體計(jì)約為5 7g/L(每批次培養(yǎng)菌生長(zhǎng)狀況會(huì)略有差異)。加入底物S (底物S溶解于DMS0，預(yù)先配置成50%的母液)至培養(yǎng)體系中，終濃度為lg/L，并加入異丙醇2. 5ml (5% )和葡萄糖IgO ，再次置于搖床上轉(zhuǎn)化(30°C，220rpm)48h。以IOOml乙酸乙酯萃取，取有機(jī)相氣相色譜(SGE，澳大利亞，AC_5，30mX 0. 22)測(cè)定轉(zhuǎn)化率為94%，氣相手性柱(CHIRASIL-DEX CB，瓦里安25mX0. 25)測(cè)定產(chǎn)物ee值大于 99%。
權(quán)利要求
1.氧化微桿菌Microbacterium oxydans C3，保藏號(hào)為 CCTCC M 2010179。
2.以權(quán)利要求1所述氧化微桿菌制備光學(xué)純(R)-l-[3,5-bis (trifluoromethyl)phenyl] ethanol的方法，其特征在于27 33 °C培養(yǎng)氧化微桿菌C3M 48h，加入底物3，5-bis-trif luoromethyl acetophenone進(jìn)行生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化；或者收集該培養(yǎng)菌，重懸于緩沖液中，再加入底物進(jìn)行休止細(xì)胞轉(zhuǎn)化，生成目的產(chǎn)物光學(xué)純(R)-l_[3，5-bis(trifluoromethyl)phenyl]ethanol。
3.權(quán)利要求2所述的氧化微桿菌制備光學(xué)純(R)-l-[3,5-bis (trifluoromethyl)phenyl] ethanol 白勺方法，其特征是所述底物 3，5_bis_trifluoromethyl acetophenone ^t反應(yīng)體系中的終濃度為1 30g/L，底物直接加入轉(zhuǎn)化體系中，或者先以助溶劑溶解后，配成質(zhì)量濃度為30 % 60 %的母液后再加入到反應(yīng)體系，助溶劑為二甲亞砜或/和二甲基甲酰胺或/和異丙醇。
4.權(quán)利要求2所述的氧化微桿菌制備光學(xué)純(R)-l-[3,5-bis (trifluoromethyl)phenyl]ethanol的方法，其特征是生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)細(xì)胞濃度以菌體濕重計(jì)是5 7g/L，轉(zhuǎn)化溫度為27 33°C，轉(zhuǎn)速200 ^Orpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為M 88h。
5.權(quán)利要求2所述的氧化微桿菌制備光學(xué)純(R)-l-[3,5-bis (trifluoromethyl)phenyl] ethanol的方法，其特征是休止細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)細(xì)胞濃度以菌體濕重計(jì)是50 300g/L,轉(zhuǎn)化溫度為20 40°C，轉(zhuǎn)速200 280rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間為5 48h，緩沖液為pH值為6 8且濃度為0. IM的磷酸鉀緩沖溶液或者磷酸鈉緩沖液或者Tris-HCl緩沖液。
6.權(quán)利要求2 5所述的氧化微桿菌制備光學(xué)純(R)-I-[3，5-bis(trif luoromethyl)phenyl] ethanol的方法，其特征是轉(zhuǎn)化體系中加入體積百分比濃度為4% 20%的異丙醇和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% 6%的葡萄糖以提高反應(yīng)效率。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種氧化微桿菌以及利用該菌制備光學(xué)純(R)-1-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]ethanol的方法。本發(fā)明氧化微桿菌MicrobacteriumoxydansC3，保藏號(hào)為CCTCC M2010179。本發(fā)明氧化微桿菌在27~33°C培養(yǎng)24~48h，加入底物3,5-bis-trifluoromethylacetophenone進(jìn)行生長(zhǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化；或者收集該培養(yǎng)菌，重懸于緩沖液中，再加入底物進(jìn)行休止細(xì)胞轉(zhuǎn)化，生成目的產(chǎn)物光學(xué)純(R)-1-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]ethanol。本發(fā)明易于工業(yè)化，其催化劑易于制備、反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化效率高。
文檔編號(hào)C12P41/00GK102382780SQ201010271579
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者劉艷, 吳中柳, 張超, 湯傳根, 田小亮, 裴小瓊 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所