專利名稱：一種以整合型重組枯草芽孢桿菌為菌種生產α-乙酰乳酸脫羧酶的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體是以整合型重組枯草芽孢桿菌為菌種生產CI “乙 酰乳酸脫羧酶的方法。
背景技術：
雙乙酰是啤酒發酵中的風味物質，但是啤酒中雙乙酰含量超過0. 15mg/L就能產 生令人不愉快的餿飯味，嚴重影響啤酒的風味，國家標準(GB4927-2008)規定優級啤酒中 雙乙酰含量不得高于0. 10mg/L。a -乙酰乳酸脫羧酶是一類可有效地降低啤酒中雙乙酰 含量，改善啤酒風味的酶類，它可以直接將啤酒發酵過程中產生的雙乙酰的前驅物-乙酰 乳酸轉化為乙偶姻，使其不經過形成不良風味物質雙乙酰階段，加快啤酒成熟，縮短生產周 期，提高設備利用率，具有很好的經濟和社會效益。利用大腸桿菌作為宿主菌表達a-乙酰乳酸脫羧酶已獲得成功，茍幫超等人 (2006年，四川師范大學學報)將來源于產氣大腸桿菌(Enterobacter aerogenes)的 a -乙酰乳酸脫羧酶基因插入到表達載體PBV220，轉化到大腸桿菌DH5 a，誘導培養后收集 細胞、破壁，酶活可達到240U/ml。但大腸桿菌表達系統存在一些缺陷，如含有內毒素、腸毒 素、難以分泌表達，產物需要破胞提取等，而且為了保持質粒的穩定性，在生產過程中一般 需要使用抗生素。為了避免重組微生物發酵過程中殘留的抗生素類物質對于食品安全的 影響，國際上對微生物來源的酶制劑的抗菌活性有嚴格限制，JECFA (Joint FAO/WHOExpert Committee on Food Additives，聯合國糧農組織和世界衛生組織下的食品添加劑聯合專家 委員會)和A0AC (Association of Analytical Communities，美國官方分析化學師協會) 等國際組織將抗菌活性列為食品用酶制劑的重要檢驗要求，這對酶制劑生產企業提出了更 高的要求。枯草芽孢桿菌有長期制備發酵食品的歷史，是非致病的，不產內毒素和致熱致敏 蛋白質，是一種食品安全的菌種。另外，枯草芽孢桿菌表達系統還具有以下優點1具有很 強的蛋白質分泌功能，不需要破碎細胞來提取蛋白質，只需要較簡單地處理發酵上清液即 可得到較純的目標蛋白質。2沒有明顯的密碼子偏愛性，同時表達產物也不容易形成包函 體。3發酵條件簡單。因此，開發利用枯草芽孢桿菌表達系統生產食品添加劑具有深遠的意 義和廣闊的市場前景。根據所采用載體類型不同，枯草芽孢桿菌表達模式可分為可復制質 粒表達和染色體整合表達。Diderichsen等(1990，Journal of Bacteriology)將來源于 短芽孢桿菌(Bacillus brevis)的a -乙酰乳酸脫羧酶基因克隆到質粒上并轉化到枯草芽 孢桿菌168衍生菌株，成功獲得表達。但復制質粒通常在枯草芽孢桿菌中不很穩定，這限制 了外源基因的高效表達。同時也存在著在生產過程中需要使用抗生素的問題。

發明內容
本發明的目的是提供一種以整合型重組枯草芽孢桿菌為菌種生產a -乙酰乳酸脫羧酶的方法。利用整合質粒將a-乙酰乳酸脫羧酶表達元件整合到枯草芽孢桿菌染色體 基因組中，構建整合型重組枯草芽孢桿菌，利用該菌在液體培養基中進行發酵，得到a -乙 酰乳酸脫羧酶。本發明解決上述技術問題的技術方案如下以整合型重組枯草芽孢桿菌為菌種生產a -乙酰乳酸脫羧酶的方法1.整合型重組枯草芽孢桿菌的構建方法，是將a -乙酰乳酸脫羧酶表達元件克 隆到質粒PMLK83或其衍生質粒上，得到的重組質粒轉化宿主枯草芽孢桿菌，在含新霉素 20ug/ml的LB固體培養基上，挑選出新霉素抗性以及a _淀粉酶缺失的菌株，即為外源基因 通過雙交換整合到染色體中的重組枯草芽孢桿菌；所述的a -乙酰乳酸脫羧酶表達元件，包含1)能夠在枯草芽孢桿菌中高效啟動基因表達的啟動子，例如來源于枯草芽 孢桿菌(Bacillus subtilis)重疊啟動子P43，或來源于地衣芽孢桿菌(Baclicus lincheniformis)麥芽糖淀粉酶基因amyM的啟動子；2)能在枯草芽孢桿菌中高效分泌表達蛋白的信號肽DNA片斷，例如來源于短芽 孢桿菌(Bacillus brevis)的a -乙酰乳酸脫羧酶基因信號肽DNA片斷，或枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) AmyX基因信號肽DNA片斷，或枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因SacB 信號肽DNA片斷；3)來源于克雷伯氏土壤菌(Klebsiella terrigena)的a -乙酰乳酸脫羧酶基因 的單順反子或多順反子，或來源于短芽孢桿菌(Bacillus brevis)的a -乙酰乳酸脫羧酶 基因的單順反子或多順反子，也可以是來源于其它菌的a -乙酰乳酸脫羧酶基因的單順反 子或多順反子；所述的宿主枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌168衍生菌株，例如1A751，WB600，或 WB800 ；2.以整合型重組枯草芽孢桿菌為菌種生產a -乙酰乳酸脫羧酶的方法是，以整 合型重組枯草芽孢桿菌為菌種在營養培養基中發酵生產a-乙酰乳酸脫羧酶，生產步驟如 下1)所述整合型重組枯草芽孢桿菌，是將a -乙酰乳酸脫羧酶表達元件整合到宿主 枯草芽孢桿菌染色體中，經過篩選得到的整合型重組枯草芽孢桿菌；2)所述的營養培養基，為包含0. 1-5%胰化蛋白胨，0. 1-5%酵母提取物，0.5-2% NaCl的液體培養基，或相同蛋白質含量的水解酪蛋白代替胰化蛋白胨的液體培養基；3) a -乙酰乳酸脫羧酶的生產方法，包括接種、培養、分離、濃縮和包裝，具體操作 是以構建的重組枯草芽孢桿菌菌株為菌種，在溫度30 40°C，pH6. 0 8. 0，好氧條件下 按0. 5% 15%接種量擴增菌種和發酵，好氧發酵18-48小時，發酵液在400 16000g離 心力離心或在孔徑0. 2 0. 6um過濾除菌，上清液在截留分子量5000 10000超濾膜濃縮 后，得到成品a -乙酰乳酸脫羧酶，4 10°C低溫保存。本發明首次將a -乙酰乳酸脫羧酶表達元件整合到枯草芽孢桿菌染色體中，以該 菌作為菌種，常規的生產工藝，發酵生產a -乙酰乳酸脫羧酶。本發明的優點是本發明利用食品安全的表達系統生產a -乙酰乳酸脫羧酶，整 合型表達的菌株所含的外源基因能夠穩定傳代和表達，產品達到食品要求，產品無抗菌活性。
具體實施例方式避免表達系統中質粒不穩定的最有效途徑是使用枯草芽孢桿菌整合質粒，將外源 基因整合到枯草芽孢桿菌染色體中，外源基因隨染色體的復制而復制和表達，這樣外源基 因在宿主中可保持較好的穩定性。本發明用到的整合質粒PMLK83購自美國俄亥俄州立大 學Bacillus遺傳保藏中心(BGSC，http://www. bgsc. org)，該質粒有兩段與枯草芽孢桿菌 淀粉酶基因同源的DNA序列(同源臂)，在這兩段同源臂中有新霉素抗性基因；另外該質粒 有大腸桿菌復制子而無枯草芽孢桿菌復制子，因此能在大腸桿菌中復制而不能在枯草芽孢 桿菌中復制。質粒轉化到枯草芽孢桿菌時，通過新霉素抗性選擇，只有整合到枯草芽孢桿菌 染色體中的重組菌才能生長，這樣就篩選出重組子。下面結合實施例對本發明作進一步描述。但需要說明的是，實施例并不構成對本 發明要求保護范圍的限制。實施例1本實例將包含來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)重疊啟動子P43啟動 子，來源于短芽孢桿菌(Bacillus brevis)的a -乙酰乳酸脫羧酶基因信號肽DNA片斷和 來源于克雷伯氏土壤菌(Klebsiella terrigena)的a -乙酰乳酸脫羧酶基因單順反子的 a -乙酰乳酸脫羧酶表達元件克隆到整合質粒PMLK83，然后轉化宿主菌1A751構建整合型 重組枯草芽孢桿菌，最終在LB液體培養基中發酵生產a -乙酰乳酸脫羧酶。1.構建重組質粒pMLK83-P43根據Genbank中注釋的啟動子P43序列，設計上游引物為 5‘attgctggacgcttatggac 3，和下游弓|物為 5，cgggatccattcctctcttacctataat 3，。PCR 反 應體系 lOOul :DNA模板(枯草芽孢桿菌 1A751 總 DNA)lul (約 20ng)，5XPrimeSTAR Buffer 20ul, 10pmol/ul dNTP 2ul，lOpmol/ul 正反向引物各為 2ul，2. 5U/ul PrimeSTAR HSDNA 聚 合酶 lul，添加 ddH20 至 100ul。PCR 反應程序94°C 5min ；94°C 30s，60°C 30s，72°C lmin，30 個循環；72°C 10min;4°C保存。PCR片段和質粒pMLK83用限制性內切酶BamH I、Hind III 分別進行雙酶切后用T4連接酶進行連接，轉化到大腸桿菌DH5 a中，經篩選鑒定獲得重組 質粒 pMLK83-P43。2.構建重組質粒 pMLK83-P43-ALDC以公司保存的pETGAU-1為模板，設計上游引物5，cgggatccatgaaaaaaaatatcatca cttct 3，和下游弓|物 5，tccccgcggagcaccaattaccaggcaga 3，。PCR 反應體系 100ul :DNA 模板 pETGAU-llul (約 20ng)，5XPrimeSTAR Buffer 20ul, lOpmol/ul dNTP 2ul, lOpmol/ ul 正反向引物各為 2ul，2. 5U/ul PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 lul，添加 ddH20 至 100ul。PCR 反應程序94°C 5min ；94°C 30s,60°C 30s，72°C 2min，30 個循環；72°C lOmin ；4°C保存。PCR 片段和質粒PMLK83-P43用限制性內切酶BamH I和Sac II進行雙酶切后用T4連接酶進行 連接，轉化到大腸桿菌DH5 a中，經篩選鑒定獲得重組質粒pMLK83-P43-ALDC。3.整合型質粒pMLK83-P43-ALDC在枯草芽孢桿菌中的轉化取一滿環枯草芽孢桿菌1A751甘油菌劃LB平板，37°C培養箱培養過夜。轉化前 一天晚間挑單菌落至3ml LB培養基中，37°C，250rpm培養過夜，第二天上午取160 yl培養液轉接至8ml SPI培養基中(SPI培養基SP鹽加體積濃度為50% (W/V)葡萄糖溶 液，體積 100XCAYE 溶液；SP 鹽溶液0. 2% (NH2)S04，1. 4% K2HP04，0. 6% KH2P04，0. 02% MgS047H20,0. 1 %檸檬酸鈉)，37°C，250rpm培養至對數生長末期(約4 5小時)；取0. 2ml 生長至對數末期的培養液至2ml SPII培養基中(SPII培養基SPI培養基加入體積 50mmol/L CaCl2 溶液，體積 250mmol/L MgCl2 溶液)，37°C，lOOrpm 培養 90 分鐘；在上 述SPII培養基的菌體中加入20ul 10mmol/L EGTA，再于37°C，lOOrpm培養10分鐘；將上 述處理后的菌液分裝成0. 5ml每管，加入5ul質粒pMLK83-P43-ALDC(50ng/ul)，再于37°C， 250rpm培養90分鐘，取菌液涂布新霉素(20ug/ml) LB平板，篩選淀粉酶缺失轉化子即是枯 草芽孢桿菌基因工程菌株1A751 [ALDC]。4. a-乙酰乳酸脫羧酶的生產，操作步驟如下1) 一級種的制備從含新霉素20ug/ml的LB平板(LB培養基蛋白胨1%，酵母膏 0. 5%，NaCll%，平板加1. 5% Agar)上接1A751 [ALDC]單菌落在4ml LB液體培養基37°C、 220rpm培養過夜，所得的菌種為一級種。2) 二級種的制備一級種接種于800ml LB液體培養基，于37°C，220rpm培養至 0D600為0. 6左右(約4 5小時)。3)三級種的制備將二級種接種到80L LB液體發酵罐中，37°C，以檸檬酸、NaOH 控pH 7. 0左右，通風攪拌，溶氧控制在20 30 %，培養至0D600為0. 6左右(約5 6小 時)。4)生產罐發酵將三級種接種到3T發酵罐中，LB液體培養基，36 38°C，通風攪 拌，溶氧控制在20 30%，以檸檬酸、NaOH控pH 6 8，培養約26小時，10000g離心力離 心除菌，用截留分子量5000 10000超濾膜濃縮上清液后，即得a -乙酰乳酸脫羧酶濃縮 原液。a -乙酰乳酸脫羧酶酶活的測定按國家標準GB 20713-2006進行。經測定，發酵原 液離心后，上清液的酶活為120 130U/ml左右。實施例2本實例將包含來源于地衣芽孢桿菌(Baclicus lincheniformis)麥芽糖淀粉酶基 因amyM的啟動子和來源于短芽孢桿菌(Bacillus brevis)的a -乙酰乳酸脫羧酶基因(包 括信號肽)單順反子的乙酰乳酸脫羧酶表達元件克隆到整合質粒PMLK83，然后轉化宿 主菌1A751構建整合型重組枯草芽孢桿菌，最終在LB液體培養基中發酵生產a -乙酰乳酸 脫羧酶。1.構建重組質粒 pMLK83_amyM根據Genbank中注釋的啟動子amyM序列，設計上游引物為 5，CCCAAGCTTCTGTACACTTGCGTCCTCCA 3，和下游引物為 5，cgggatccTCTCCTCCCCTTTCAATGTG 3，。PCR 反應體系 100ul :DNA 模板(Bacillus licheniformis ATCC 14580 總 DNA) lul (約 20ng), 5XPrimeSTARBuffer 20ul, lOpmol/ul dNTP 2ul，lOpmol/ul 正反向引物各為 2ul， 2. 5U/ul PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 lul，添加 ddH20 至 100ul。PCR 反應程序94°C 5min ; 94°C 30s,60°C 30s，72°C 30s，30 個循環；72°C lOmin ；4°C保存。PCR 片段和質粒 pMLK83 用 限制性內切酶BamHI、Hind III分別進行雙酶切后用T4連接酶進行連接，轉化到大腸桿菌 DH5 a中，經篩選鑒定獲得重組質粒pMLK83_amyM。
2.構建重組質粒 pMLK83-amyM_ALDB設計上游弓丨物5，CGGGATCCATGAAAAAAAATATCATCAC 3，和下游引物 5‘ tccccgcggAGCACCAATTACCAGGCAGA 3，。PCR 反應體系 lOOul :DNA 模板(Bacillus brevis ATCC 11031 總 DNA)lul (約 100ng)，5XPrimeSTAR Buffer 20ul, lOpmol/ul dNTP 2ul, lOpmol/ul 正反向引物各為 2ul，2. 5U/ul PrimeSTARHS DNA 聚合酶 lul，添加 ddH20 至 lOOul。PCR反應程序:94°C 5min ；94°C 30s，60°C 30s，72°C 2min，30 個循環；72°C lOmin ；4°C 保存。PCR片段和載體pMLK83-amyM用限制性內切酶BamH I和SacII進行雙酶切后用T4 連接酶進行連接，轉化到大腸桿菌DH5C中，經篩選鑒定獲得重組載體pMLK83-amyM-ALDB.3.整合型質粒pMLK83-amyM-ALDB在枯草芽孢桿菌中的轉化以及用獲得的重組 菌株進行a-乙酰乳酸脫羧酶的生產同實例一。此菌株發酵原液離心后，上清液的酶活為 70 80U/ml左右。
權利要求
一種以整合型重組枯草芽孢桿菌為菌種生產α 乙酰乳酸脫羧酶的方法，其特征在于1)整合型重組枯草芽孢桿菌的構建方法，是將α 乙酰乳酸脫羧酶表達元件克隆到質粒pMLK83或其衍生質粒上，得到的重組質粒轉化宿主枯草芽孢桿菌，在含新霉素20ug/ml的LB固體培養基上，挑選出新霉素抗性以及α 淀粉酶缺失的菌株，即為外源基因通過雙交換整合到染色體中的重組枯草芽孢桿菌；所述的α 乙酰乳酸脫羧酶表達元件，包含(1)能夠在枯草芽孢桿菌中高效啟動基因表達的啟動子，例如來源于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)重疊啟動子P43，或來源于地衣芽孢桿菌(Baclicus lincheniformis)麥芽糖淀粉酶基因amyM的啟動子；(2)能在枯草芽孢桿菌中高效分泌表達蛋白的信號肽DNA片斷，例如來源于短芽孢桿菌(Bacillus brevis)的α 乙酰乳酸脫羧酶基因信號肽DNA片斷，或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)AmyX基因信號肽DNA片斷，或枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因SacB信號肽DNA片斷；(3)來源于克雷伯氏土壤菌(Klebsiella terrigena)的α 乙酰乳酸脫羧酶基因的單順反子或多順反子，或來源于短芽孢桿菌(Bacillus brevis)的α 乙酰乳酸脫羧酶基因的單順反子或多順反子，也可以是來源于其它菌的α 乙酰乳酸脫羧酶基因的單順反子或多順反子；所述的宿主枯草芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌168衍生菌株，例如1A751，WB600，或WB800；2)以整合型重組枯草芽孢桿菌為菌種生產α 乙酰乳酸脫羧酶的方法是，以整合型重組枯草芽孢桿菌為菌種在營養培養基中發酵生產α 乙酰乳酸脫羧酶，生產步驟如下(1)所述整合型重組枯草芽孢桿菌，是將α 乙酰乳酸脫羧酶表達元件整合到宿主枯草芽孢桿菌染色體中，經過篩選得到的整合型重組枯草芽孢桿菌；(2)所述的營養培養基，為包含0.1 5％胰化蛋白胨，0.1 5％酵母提取物，0.5 2％NaCl的液體培養基，或相同蛋白質含量的水解酪蛋白代替胰化蛋白胨的液體培養基；(3)α 乙酰乳酸脫羧酶的生產方法，包括接種、培養、分離和濃縮，具體操作是以構建的重組枯草芽孢桿菌菌株為菌種，在溫度30～40℃，pH 6.0～8.0，好氧條件下按0.5％～15％接種量擴增菌種和發酵，好氧發酵18 48小時，發酵液在400～16000g離心力離心或在孔徑0.2～0.6um過濾除菌，上清液在截留分子量5000～10000超濾膜濃縮后，得到成品α 乙酰乳酸脫羧酶，4～10℃低溫保存。
全文摘要
本發明公開了一種以整合型重組枯草芽孢桿菌為菌種生產α-乙酰乳酸脫羧酶的方法。具體是將α-乙酰乳酸脫羧酶表達元件整合到枯草芽孢桿菌染色體中構建整合型重組枯草芽孢桿菌，以此重組枯草芽孢桿菌為菌種，在營養培養基中發酵生產α-乙酰乳酸脫羧酶。本發明的優點是本發明利用食品安全的表達系統生產α-乙酰乳酸脫羧酶，整合型表達的菌株所含的外源基因能夠穩定傳代和表達，產品達到食品要求，產品無抗菌活性。
文檔編號C12N9/88GK101948821SQ201010271749
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月3日 優先權日2010年9月3日
發明者岳田芳, 廖東慶, 張云光, 李叢, 李曉明, 林海鵬, 梁蓮華, 王子龍, 王青艷, 羅兆飛, 蒙健宗, 陳發忠, 馬少敏, 黃日波 申請人:南寧邦爾克生物技術有限責任公司