專利名稱：基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法
技術領域：
本發明屬于分子遺傳領域，涉及一種基于磁分離與引物延伸的以化學發光檢測拷貝數多態性的方法。本發明可應用于遺傳異常的發現和識別，具體而言，本發明特別用于微觀和亞微觀基因組結構變異的發現，包括缺失、重復及大片段的多態性，以便計量與正常和疾病狀態相關的基因組變化。本發明也可應用于其他的基因定量研究。
背景技術：
遺傳變異是生命的基本特征，也是疾病的重要指征。目前，以第三代遺傳標記—— 單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)為基礎的全基因組關聯分析 (genome-wide association studies, GffAS)已經成為研究常見復雜疾病遺傳易感性的主要手段。隨著DNA芯片技術的逐步發展，研究者們發現，在人類基因組中存在大量大于1Kb 但小于3Mb的DNA片段多態，包括片段的插入、缺失和/或重復，及其互相組合衍生出的復雜染色體結構變異。這種現象被稱作拷貝數變異(copy number variation, CNV),或拷貝數多態(copy number polymorphism，CNP)?？截悢底儺愒谌祟惢蚪M中的存在最早于2004年分別由Iafrate和Sebat各自所在的研究小組報道。隨后，Redon等人于2006年在HapMap 計劃的270名健康供者中鑒定得到1447個CNV區域(CNV region, CNVR)，它們覆蓋了 1 (300Mb)的人類基因組，并且和疾病致病/易感基因位點相關。這些結果提示，CNVs可能像 SNPs 一樣影響著基因的表達、表型的變異和適應，也是一種重要的疾病易感變異，能引發疾病或增加復雜疾病的發病風險。因此，在隨后的幾年中，多種常見復雜疾病的全基因組CNVs 分析結果相繼出現，包括CNVs與自閉癥、CNVs與精神分裂癥、CNVs與癌癥等等。舉例而言， 已知胃癌的發生發展機制涉及多因素、多步驟，其中CNVs導致的抑癌基因的失活和癌基因的激活在胃癌的發生和演變過程中擔當重要角色。近年的研究表明，不同的CNVs與胃癌的分期、分型、淋巴結和血液轉移等存在一定相關性。從細胞遺傳學角度來解釋，出現高頻率丟失的部位很可能存在與胃癌密切相關的抑癌基因，而出現高頻率重復的部位則可能存在相關的癌基因，CNVs所導致的抑癌基因失活和癌基因過表達很可能對胃癌的發生具有啟動作用。這些研究結果提示研究人員更深入探尋CNVs與胃癌發生發展的關聯性，為胃癌的早期診斷、治療和預后提供新的判斷依據。對于CNVs與其他復雜疾病的關聯性研究也是立足于此。自CNVs于2004年被報道，隨即有研究者建立了 “基因組變異數據庫”(Database of Genomic Variants，DGV)，收錄人類基因組結構變異信息，為廣大遺傳學研究人員提供便捷的查詢基因組結構變異的渠道。根據DGV的統計，截至2010年11月2日，基于NCBI build 36參考基因組序列發現的CNVs總共為66，741個，由此形成的CNVR共12，963個，覆蓋35. 07%的人類基因組，覆蓋長度達1，000 Mb以上，這是目前任何一種遺傳標記都不能比擬的。尤其是，DGV收錄的信息每年呈倍數增長，說明對于人類基因組中>lKb之結構變異的研究越來越受到關注，該種變異的重要程度不言而喻。目前存在的研究CNVs的技術可劃分為兩類，一類是掃描全基因組以發現新CNVs 的技術，主要包括比較基因組雜交(comparative genomic hybridization, CGH)、代表性寡核苷酸微陣列分析(representational oligonucleotide microarray analysis, ROMA)、 SNP (single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態性)芯片；另一類是針對已知CNVs 進行高通量檢測的技術，主要包括實時熒光定量PCR (real-time quantitative PCR)、多重可擴增探針雜交技術(multiplex amplifiable probe hybridization，MAPH)、多重連接依賴的探針擴增技術(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)0 其中，MLPA是由荷蘭學者khouten等人于2002年建立。它利用簡單的雜交、連接、聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴增反應，于單一反應管內同時檢測最多40 個不同的核苷酸序列的拷貝數變化。其原理如下MLPA方法中的探針組由兩部分構成，一組探針由與靶基因特異性結合的序列和合成的通用引物序列構成，另一組探針則由與靶基因特異性結合的序列、來源于M13載體的通用引物序列以及填充于兩者之間的不同長度的寡核苷酸片段構成；兩組探針若與基因組DNA模板完全互補配對則能夠被連接酶連接，經過PCR擴增后根據毛細管電泳結果判讀基因組中拷貝數的變化。雖然檢測之前經過了 PCR 擴增過程，但由于使用的是通用引物，不存在不同核酸序列之間擴增效率的差異，因此能夠定量基因組中目標核酸片段的拷貝數差異。最初的MLPA技術以片段長度來標記不同核酸序列，通過毛細管電泳解碼標記從而判讀基因組中目標核酸序列的拷貝數差異。之后更發展了多種基于MLPA之連接反應為根本原理檢測特定CNVs的技術，主要為提高檢測的通量， 而對于通量的提高則在于編碼與解碼技術的改進，如發展了序列標簽編碼解碼技術、質譜編碼解碼技術等。然而，目前基于MLPA技術檢測CNVs之方法的共同局限性在于其昂貴的價格，而造成其價格昂貴的主要原因之一便在于它的核心原理——獲取核苷酸序列拷貝數信息時需要使用特殊的連接酶(Ligase-65)對目標片段進行連接。基因組結構變異與疾病、藥物、環境易感性明顯相關，但是人類基因組將近3( 的核苷酸數量限制了全基因組測序作為常規檢測遺傳變異的手段。因此，需要發展便捷、經濟的檢測遺傳變異的技術為人類健康提供基因組信息。

發明內容
解決的技術問題CNVs研究的關鍵問題在于對基因拷貝數的真實定量，即對于基因組中核苷酸序列拷貝數信息的獲取。本發明的目的在于解決上述所提到的使用特殊連接酶而造成獲取核苷酸序列拷貝數信息時成本高昂的問題，提出了一種能大大降低成本的基于磁分離的獲取核苷酸序列拷貝數信息的方法，在獲取核苷酸序列拷貝數信息后檢測化學發光以分析基因拷貝數變異，從而為推廣CNVs檢測成為常規遺傳變異檢測項目奠定基礎。技術方案基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法，1)制備適合于獲取核酸序列拷貝數信息的磁性介質；2)設計能與目標核酸序列特異性結合的引物與探針，探針5’端的修飾對應1)所述磁性介質上所修飾之功能化基團，之后以產物捕獲方式獲取目標核酸片段的拷貝數信息，產物捕獲方式指先進行引物延伸反應，再利用磁性介質表面連接的特異性探針與延伸反應產物之間的堿基互補配對捕獲延伸得到的核酸片段；3)根據引物設計數據確定Tm值，根據Tm值確定退火溫度，加入雜交緩沖溶液，經過變性與退火過程，使引物與變性成單鏈的DNA模板充分結合；4)加入延伸反應緩沖溶液，進行一個循環后結束反應，再加入已制備的連接有特異性探針的磁性介質與延伸產物進行雜交反應，從而捕獲目標核酸片段至磁性介質；5)磁分離，對磁性介質進行清洗，即得到獲取了模板中目標核酸片段拷貝數信息的磁性介質；6)對反映至磁性介質上的模板中的目標基因與內參基因核酸片段進行化學發光檢測，比較目標基因/內參基因核酸片段化學發光比值在待測模板與對照模板中的差異從而得到目標基因在待測模板中相對于對照模板中的拷貝數變化信息。所述磁性介質為體現磁學性質的物體。所述體現磁學性質的物體為具有磁學性質的物質構成的物體或以具有磁學性質的物質為部件的物體。所述延伸反應體系為常規使用的PCR緩沖體系，所使用的酶為普通的Taq DNA聚合酶、Vent_DNA聚合酶或De印Vent_ DNA聚合酶。一種基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法，制備步驟為 a.磁性顆粒制備，采用溶劑熱法制備直徑在300nm左右的!^e3O4磁性顆粒稱取1.35 g
的狗(13*6!120、3.6 g的醋酸鈉以及1.0 g聚乙二醇溶解于40 mL乙二醇中，磁力攪拌溶解， 形成黃褐色膠體；將膠體轉移至四氟乙烯反應釜，密封，置于200°C烘箱中反應8小時；反應完成后以乙醇與去離子水清洗，烘干后得!^e3O4磁性顆粒；用100 mL 0. Imol鹽酸浸泡狗304 磁性顆粒1小時，超聲分散30分鐘；再重新分散于乙醇體積濃度80%的乙醇-水混合液中， 以25°C、280轉/分攪拌，同時加入200 μ L正硅酸乙酯(TE0S)，反應1小時；以乙醇、去離子水交叉洗滌；將顆粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化銨，超聲30分鐘，在25°C、300轉/分條件下攪拌，同時加入1 mL TE0S，反應3小時后，以乙醇、 去離子水交叉洗滌數次，最后以乙醇分散，于4°C保存；制備得到核-殼結構的!^e3O4OSiA 復合顆粒；磁性納米顆粒的氨基化；將上述制得的!^3O4OSiA復合納米磁性顆粒磁分離，加入至乙醇/水混合溶液中并超聲分散，然后將10 μ L 8-aminopyrene-l, 3，6-trisulfonic acid trisodium salt (APTS)滴加到以上混合溶液中，并在室溫下振蕩攪拌7小時，利用外加磁場將APTS修飾的磁性顆粒從反應介質中分離出來，用乙醇溶液對其清洗5次，磁分離，再用二甲基甲酰胺(N，N-dimethyl formamide, DMF)清洗5次，最后以5 mg/mL的濃度分散于DMF中，待用；氨基化磁性納米顆粒的羧基化；取分散于DMF溶液中的氨基化SiO2/ 狗304磁性納米顆粒(5 mg/mL)，逐滴加入到等體積丁二酸酐(Succinic anhydride, SA)濃度為0. 001的DMF溶液中，室溫下反應M小時，用水洗滌數次后磁分離，加入雙蒸水定容至 10 mg/mL，即得到功能性的羧基化磁珠；將上述羧基化磁珠(10 mg/mL)用等體積2-N-嗎啉代乙磺酸水合物溶液(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid hydrate, MES, 25mM, pH 6)反復清洗，磁分離，加入以MES溶液稀釋的氨基化探針(100 μ Μ)至清洗過的磁珠中，混合均勻后室溫下溫和旋轉孵育30分鐘，立刻加入冷的以MES溶液溶解的1-(3-二甲基氨 SMS )-3-—MI^ci-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide, EDC, 10
mg/mL)至磁珠中混合均勻，再以MES溶液補足體積至50 μ L。在4°C條件下旋轉孵育2小時，每20分鐘搖勻一次，磁分離后吸去上清，將磁珠于Tris (50 mM,pH 7. 4)溶液中孵育15 分鐘以中和沒有反應的活化的羧基基團，再以Tris (50 mM,0. 1 % Tween-20)清洗磁珠，最后以溶于PBS中的BSA溶液(g/mL :0. 1%)封閉磁珠；即得到了連接有特異性探針的功能化磁珠；
b.設計一對能與GAPDH、GSTTl與GSTMl基因特異性結合的引物與探針，探針5’端以氨基修飾，通過氨基-羧基相互反應將探針固定至磁性顆粒表面；
c.延伸加入IOXBuffer 2 μ L.25 mM Mg2+ 2μ L,2. 5 mM dNTP 1.5 μ L、上下游引物各2. 5 μ L，人工合成的上述DNA模板2. 5 μ L、DNA聚合酶0. 5 μ L，加去離子水補足體積至20 μ L，將反應混合物置于PCR儀中；PCR參數94°C 5分鐘；95°C 30秒，54°C 30秒， 720C 1分鐘，1個循環；將得到的雙鏈延伸產物進行變性，通過堿基互補配對原則將變性后的單鏈延伸產物與連有特異性探針的磁性顆粒雜交，然后將連有單鏈DNA的磁性顆粒磁分離，進行清洗；從而得到反映了目標基因拷貝數信息的磁性介質；
d.對反映至磁性介質上的模板中的目標基因與內參基因核酸片段進行化學發光檢測， 比較目標基因/內參基因核酸片段化學發光比值在待測模板與對照模板中的差異從而得到目標基因在待測模板中相對于對照模板中的拷貝數變化信息。所述磁性顆粒表面包被一層SiA外殼。所述包被方法為用100 mL 0. Imol鹽酸浸泡!^e3O4顆粒1小時，超聲分散30分鐘；再重新分散于體積濃度80%的乙醇-水混合液中，以25°C、280轉/分攪拌，同時加入 200 μ L SiO2 28. 4%wt的TE0S，反應1小時，以乙醇、去離子水交叉洗滌數次；將顆粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化銨，超聲30分鐘，在25°C、300轉/ 分條件下攪拌，同時加入1 mL TE0S，反應3小時后，以乙醇、去離子水交叉洗滌數次，最后以乙醇分散，于4°C保存。所述化學發光檢測為進行化學反應過程中檢測得到的光信號，所使用的化學發光體系包括魯米諾、光澤精、過氧化草酸酯、1，2_ 二氧雜環丁烷類、吖啶酯或三(2，2’ -聯吡啶)釕(III )。具體而言，本發明通過引物延伸反應，將基因組中待測核酸片段的拷貝數信息反映至磁性介質，再利用磁性介質易于分離的特性，經過磁分離后檢測化學發光以分析待測模板中目標核酸片段的拷貝數變化情況。該方法具體技術過程如下
1)在本發明的一個較佳實施例中，以功能化的I^e3O4磁性顆粒作為磁性介質來獲取 DNA模板中目標核酸片段的拷貝數信息。具體而言，制備!^e3O4磁性顆粒，在其上包被功能化材料并修飾功能化基團。所述制備狗304磁性顆粒的方法包括共沉淀法、水熱法、高溫分解法、微乳液法、溶膠-凝膠法，以及其他物理或化學方法。所述包被于狗304磁性顆粒表面的功能化材料包括聚合物(葡聚糖及其衍生物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸甲酯等)、二氧化硅、金屬等。所述修飾于功能化材料表面的功能化基團包括羧基修飾、氨基修飾、鏈親和素修飾等。這些對于本領域的普通技術人員是顯然的。所列舉的制備、包被與修飾狗304磁性顆粒的材料和方法只是舉例說明本發明，不能以任何方式限制本發明的范圍。2)探針設計。設計一對能與目標核酸序列特異性結合的探針，探針的5’端修飾根據前述磁性顆粒上所修飾功能化基團的不同而不同。利用磁性顆粒與探針5’端修飾基團之間的反應將探針固定于磁性顆粒上。3)延伸。加入延伸反應溶液，成分包括常規使用的PCR緩沖體系，將反應混合物置于PCR儀中進行引物延伸反應。根據引物設計的相關數據確定Tm值，根據Tm值確定退火溫度，從而確定反應參數；根據反應產物的長度確定延伸反應時間。進行一個循環后結束反應，對雙鏈進行變性。所述常規使用的PCR緩沖體系中所使用的酶為普通的Taq DNA聚合酶、Vent_ DNA聚合酶、De印Vent_ DNA聚合酶等。這對于本領域的普通技術人員是顯然的， 所列舉的酶與PCR反應體系只是舉例說明本發明，不能以任何方式限制本發明的范圍。4)雜交。將3)中得到的延伸反應產物與2)中制備的連接有特異性探針的磁性顆?；旌?，加入雜交緩沖溶液，使兩者充分結合。上述例舉的方法只對待測核酸片段進行了一次延伸，在真實反應基因組中待測核酸序列拷貝數水平的同時，對于低豐度基因的拷貝數檢測可能靈敏度不夠，因此可結合PCR 方法，設計通用接頭與通用引物對延伸產物進行擴增、得到一定豐度的目標核酸片段后再進行檢測。此為對本發明核心原理“延伸反應”的技術發展，對于本領域的普通技術人員是顯然的，不能以任何方式限制本發明的范圍。通過前述四個步驟得到了已獲取DNA模板中目標核酸片段拷貝數信息的磁性顆粒，即對DNA模板中目標核酸片段的拷貝數信息進行了預處理。接下來可對磁性顆粒采用不同的檢測方法進行檢測，根據此時檢測方式的不同，前述步驟幻、；3)和4)在實驗設計與實驗步驟方面都有相應調整。本發明以化學發光檢測方式，對拷貝數變異進行定量分析。步驟3)在延伸反應緩沖體系中加入經過標記的核苷酸單體，通過延伸反應將其摻入至產物鏈，磁分離后，加入對應標記的酶，使酶與核苷酸單體充分結合，加入化學發光底物后，經過酶催化反應產生化學光，再進行檢測。所述化學發光體系包括魯米諾 (Luminol )、光澤精(Lucigenin)、過氧化草酸酯(Peroxyoxalates)、1，2- 二氧雜環丁烷類 (Adamantyl Dioxtanes)、吖啶酯(Acridinium Exter)、三(2，2，-聯吡啶)釕(III) (tris (2，2’ -bipyridyl) ruthenium(III))等。這對于本領域的普通技術人員是顯然的，所列舉的化學發光反應體系只是舉例說明本發明，不能以任何方式限制本發明的范圍。有益效果與現有技術相比，本發明具有以下特點
通過延伸引物反應將基因組中待測核酸片段的拷貝數信息反映至磁性顆粒，再利用磁性顆粒易于分離的特性在分離后通過檢測延伸片段的化學發光強度確定待測核酸片段的拷貝數變化情況。該方法能真實再現待測核酸片段在基因組中的拷貝數變化情況，不同于經過PCR擴增后檢測終點產物的方法，也避免了實時熒光定量PCR方法檢測CNVs時需要優先考慮的待測核酸片段與內參核酸片段在引物擴增效率方面的一致性；反映至磁性顆粒的檢測信號經過了富集，同時還避免了雜交過程中其他核酸片段對于待測核酸片段信號的干擾，能夠有效降低本底，提高分辨率。


圖1為通過引物延伸后經磁性顆粒捕獲產物再以化學發光檢測目標核酸片段的實驗流程示意圖。
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圖2為功能化的狗304磁性顆粒。A.溶劑熱法制備的狗304磁性顆粒；B. SiO2包被的核殼結構的復合磁性顆粒。圖3以GAPDH基因為例示以人工合成DNA片段為模板進行引物延伸反應的結果。 A.不同退火溫度條件下GAPDH基因片段的延伸結果；泳道0 :DNA分子量標志DL2000 ；泳道1 引物對照；泳道2 模板對照；泳道3 :52°C為退火溫度的引物延伸結果；泳道4 為退火溫度的引物延伸結果；泳道5 :56°C為退火溫度的引物延伸結果；泳道6 :58°C為退火溫度的引物延伸結果；泳道7 :60°C為退火溫度的引物延伸結果。B.以人工合成的GAPDH 基因片段為模板進行引物延伸反應、再以連接有特異性探針之磁性納米顆粒捕獲延伸產物的電泳結果；泳道0 :DNA分子量標志DL2000 ；泳道1 引物對照；泳道2-4 過程中所使用之洗脫緩沖液的電泳結果；泳道5 以人工合成的GAPDH基因片段為模板進行引物延伸之產物經磁分離再經變性后的電泳結果；泳道6 模板對照。圖4以GAPDH基因為例示以人類基因組DNA為模板進行引物延伸的結果。泳道 0 :DNA分子量標志DL2000 ；泳道1 以人類基因組DNA為模板進行引物延伸之產物的電泳結果；泳道2 人類基因組DNA模板對照；泳道3 引物對照。圖5為化學發光檢測目標基因核酸片段的結果。A. GAPDH基因延伸產物及其空白對照的化學發光強度值；B. GSTTl基因延伸產物及其空白對照的化學發光強度值；C. GSTMl基因延伸產物及其空白對照的化學發光強度值。
具體實施例方式以下結合實例對本發明作進一步的描述
本發明利用磁性顆粒易于分離的特性結合引物延伸反應的方法，采用化學發光檢測技術，公布了一種能夠低成本地獲取核酸序列拷貝數信息并進行檢測的技術。在本發明的一個較佳實施例中，以Fe53O4磁性顆粒作為媒介、以常規使用的PCR緩沖體系進行核苷酸序列拷貝數信息的獲取，之后以化學發光技術進行檢測。其實驗流程如圖1所示；延伸引物獲取核酸序列拷貝數信息后，經連接有特異性探針的磁性顆粒捕獲摻入了標記性核苷酸的產物片段，再加入對應標記的化學發光的酶與底物進行反應而檢測化學發光強度。以下特定的實施例旨在更詳細地描述本發明。這些實施例目的在于解釋本發明，而不應理解為限定本發明的范圍。
實施例1以人工合成的GAPDH基因片段為模板進行核酸序列拷貝數信息的獲取以人工合成的GAPDH基因片段為模板進行核酸序列拷貝數信息獲取的實驗過程如下 1)磁性顆粒制備。采用溶劑熱法制備直徑在300 nm左右的!^e3O4磁性顆粒。稱取1. 35 g 的!^eCl3 ·6Η20、3. 6 g 的醋酸鈉(NaAc)以及 1. 0 g聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG), 溶解于40 mL乙二醇中，磁力攪拌溶解，形成黃褐色膠體。將膠體轉移至四氟乙烯反應釜， 密封，置于200°C烘箱中反應8小時；反應完成后以乙醇與去離子水清洗，烘干后得!^e3O4磁性顆粒樣品，如圖2A示。在制備的!^e3O4磁性顆粒表面包被一層幾十納米厚的二氧化硅(SiO2)外殼，可以得到具有更高穩定性和生物相容性的核-殼結構復合顆粒。具體過程如下用100 mL0.1 mol鹽酸(HCl)浸泡!^e3O4顆粒1小時，超聲分散30分鐘。再重新分散于體積濃度80%的乙醇-水混合液中，以25°C、280轉/分攪拌，同時加入200 μ L正硅酸乙酯 (TetraethyIorthosi 1 icate, TEOS, SiO2 28. 4%wt)，反應 1 小時。以乙醇、去離子水交叉洗滌數次。將顆粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)，超聲 30 分鐘，在 25°C、300 轉 / 分條件下攪拌，同時加入1 mL TE0S，反應3小時后，以乙醇、去離子水交叉洗滌數次，最后以乙醇分散，于4°C保存。制備得到的核-殼結構的!^3O4OSiA復合顆粒如圖2B示。如上所述制備的!^3O4OSiA復合顆粒不僅磁效應好，而且利用SW2包被后的顆粒表面存在大量羥基(-0H)，可以方便地修飾上各種功能化基團。在本實施例中選擇在顆粒表面修飾羧基(-C00H)。具體修飾過程如下①磁性納米顆粒的氨基化；將上述制得的 Fe304iSi02復合納米磁性顆粒磁分離，加入至乙醇/水混合溶液中并超聲分散，然后將10 μ L 8-aminopyrene-l, 3, 6-trisulfonic acid trisodium salt (APTS)滴加到以上混合溶液中，并在室溫下振蕩攪拌7小時，利用外加磁場將APTS修飾的磁性顆粒從反應介質中分離出來，用乙醇溶液對其清洗5次，磁分離，再用二甲基甲酰胺(N，N-dimethyl formamide, DMF)清洗5次，最后以5 mg/mL的濃度分散于DMF中，待用；②氨基化磁性納米顆粒的羧基化；取分散于DMF溶液中的氨基化Si02/Fe304磁性納米顆粒(5 mg/mL)，逐滴加入到等體積丁二酸酐(Succinic anhydride, SA)濃度為0. 001M的DMF溶液中，室溫下反應M小時，用水洗滌數次后磁分離，加入雙蒸水定容至10 mg/mL。③將上述羧基化磁珠(10 mg/ mL)用等體積2-N-嗎啉代乙磺酸水合物溶液(2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid hydrate，MES，25mM，pH 6)反復清洗，磁分離，加入以MES溶液稀釋的氨基化探針(100 μ M) 至清洗過的磁珠中，混合均勻后室溫下溫和旋轉孵育30分鐘，立刻加入冷的以MES溶液溶解的 I- (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(1-(3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylca rbodiimide，EDC，10 mg/mL)至磁珠中混合均勻，再以MES溶液補足體積至50 μ L。在4°C 條件下旋轉孵育2小時，每20分鐘搖勻一次，磁分離后吸去上清，將磁珠于Tris (50 mM, PH 7. 4)溶液中孵育15分鐘以中和沒有反應的活化的羧基基團，再以Tris (50 mM,0. 1 % wt Tween-20)清洗磁珠，最后以溶于PBS中的BSA溶液(g/mL :0. 1%)封閉磁珠。2)引物與探針設計。由于谷胱甘肽轉移酶(Glutathione S-transferases，GSTs) 的解毒與抗氧化活性，研究認為此家族成員是重要的癌癥易感基因，在胃癌、結腸癌等消化系統癌癥的研究中受到了廣泛地重視。其中GST θ 1 (GSTTl)，GST μ (GSTMl)基因由于同源序列的等位交換造成缺失、重復引起基因拷貝數的變化而導致酶活性的改變與癌癥的發生具有顯著相關性GSTT1與GSTMl缺失的基因型相較正?；蛐途哂邪┌Y發生的高風險性。3-磷酸甘油酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)作為管家基因，是基因定量研究中常用的內參基因。因此我們選用GSTTl與GSTMl基因作為目標基因、GAPDH基因作為內參基因進行CNVs分析平臺的開發研究。設計一對能與GAPDH (ID: 2597)、GSTTl (ID:四52)與 GSTMl (ID: 2944) 基因特異性結合的引物與探針，探針5’端以氨基修飾。引物序列如下。GAPDH: GGAAGATGGTGATGGGATTT ；GSTTl GTCCCAGTTACCTCTCCGTCA ；GSTMl :TCACTGGGGACACTCACAAA。 探針序列如下。GAPDH: TCAAGGCTGAGAACGGGAAG ；GSTTl :AGCCTTGAAGGACGGGGACT ；GSTMl TGGGCATGATCTGCTACAAT。
3)產物捕獲方式獲取DNA模板中目標核酸片段的拷貝數信息。具體實驗過程如下加入 IOXBuffer 2 μ L、Mg2+ (25 mM) 2 μ L、dNTP (2. 5 mM) 1.5 μ L、引物 2.5 μ L, 人工合成的DNA模板2. 5 yL、DNA聚合酶0. 5 μ L，加去離子水補足體積至20 yL，將反應混合物置于PCR儀中。PCR參數94°C 5分鐘；95°C 30秒，退火30秒，72°C 1分鐘，1個循環。圖3以GAPDH基因為例示引物延伸結果。圖3A為不同退火溫度的條件下GAPDH基因的延伸結果，可以看出以為退火溫度時電泳條帶最清晰單一，因此確定作為GAPDH 基因延伸時的退火溫度(泳道4)。由于羧基修飾的磁性納米顆粒表面連接有5 ’端經氨基修飾的特異性探針、通過堿基互補配對即能夠將延伸產物捕獲至磁性納米顆粒表面，從而將其與模板分離開來。因此在上述經過延伸反應后的體系中加入步驟1)中制備得到之羧基修飾的!^3O4OSiO2磁性納米顆粒100 μ g，加入雜交緩沖溶液100 μ L，室溫雜交1小時，磁分離，棄上清，以清洗緩沖液將顆粒洗滌三次，磁分離，即得到連有目標核酸片段的磁性納米顆粒；加入洗脫緩沖液于 95°C水浴10分鐘，保留洗脫液。以洗脫液進行1%瓊脂糖凝膠電泳。圖:3B示以人工合成的 GAPDH基因片段為模板進行引物延伸反應、再以磁性納米顆粒捕獲延伸產物的結果泳道 1為引物對照，泳道6為模板對照，兩者均無明顯條帶；泳道2-4為過程中所使用之洗脫緩沖液的電泳結果，亦無明顯條帶；泳道5為產物，電泳條帶單一且明顯，說明經過引物延伸反應后得到了 GAPDH基因的目標片段，而連接有特異性探針的磁性納米顆粒能夠通過堿基互補配對將延伸產物捕獲至顆粒表面，從而將延伸得到的核酸片段與DNA模板片段分離開來，再經過磁分離，即通過引物延伸與磁分離結合的方法獲取了 DNA模板中目標核酸片段的拷貝數信息。GSTTl與GSTMl基因同樣得到了類似結果(為免重復，電泳圖未列出)。
實施例2以基因組DNA為模板進行核酸序列拷貝數信息的獲取 1)磁性顆粒制備。如實施例1所述制備磁性顆粒待用。2)引物與探針設計。使用實施例1所述的GAPDH、GSTT1與GSTMl的引物與探針。3)產物捕獲方式獲取人類基因組DNA模板中目標核酸片段的拷貝數信息。加入 5 μ L基因組DNA模板，98°C變性，加入雜交緩沖液與引物，雜交，使引物與基因組DNA模板充分結合。再如實施例1所述之反應體系與具體實驗步驟而獲取基因組DNA模板中目標核酸片段的拷貝數信息。結果如圖4所示。泳道2為人類基因組DNA模板對照，泳道3為引物對照。泳道1為引物延伸產物的電泳結果，電泳條帶單一且明顯，說明以人類基因組DNA 為模板、經過引物延伸反應后得到了 GAPDH基因的目標片段，而連接有特異性探針的磁性納米顆粒能夠通過堿基互補配對將延伸產物捕獲至顆粒表面，經過磁分離后即獲取了基因組DNA模板中目標核酸片段的拷貝數信息。GSTTl與GSTMl基因同樣得到了類似結果。_
實施例3對GAPDH、GSTTl和GSTMl進行延伸產物的化學發光檢測實施例1與實施例2證實以人工合成的DNA為模板或以基因組DNA為模板通過引物延伸反應都能夠得到目的核酸片段，可以進行以下的檢測工作。1)磁性顆粒制備。如實施例1所述制備磁性顆粒待用。
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2)引物與探針設計。使用實施例1所述的GAPDH、GSTT1與GSTMl的引物與探針。3)生物素標記的核酸片段的延伸形成。具體實驗過程如下加入IOXBuffer 2 μ L^Mg2+ (25 mM) 2μ L.dNTP (2. 5 mM) 1.5 μ L(其中 Biotin-dUTP/dTTP :4/21 )、引物2· 5 μ L，人工合成的DNA模板2. 5 yL、DNA聚合酶0. 5 μ L，加去離子水補足體積至20 μ Ldf 反應混合物置于PCR儀中。PCR參數94°C 5分鐘；95°C 30秒，退火30秒，72°C 1分鐘，1 個循環。4)化學發光檢測。取連接有特異性探針的羧基修飾的磁性納米顆粒(10 mg/mL) 磁分離后吸去上清，在反應體系中分別加入雜交液和步驟1)得到的延伸產物，以雙蒸水補足體積，混勻后以95 °C變性10分鐘，以退火溫度雜交1小時，每20分鐘混勻一次。經洗滌緩沖液振蕩、清洗，最后磁分離吸去上清。加入封閉緩沖液混勻后室溫放置30分鐘，期間不斷混勻。磁分離后吸去上清，加入1:1000以封閉液稀釋的鏈親和素標記的堿性磷酸酶(alkalin印h0Sphatase，ALP)溶液，混勻后室溫孵育30分鐘。磁分離后以洗滌緩沖液清洗。加入化學發光底物3-(2’ -螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3”_羥基)苯-1，2-二氧雜環丁舞酸(3_(2，-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3“ -phosphoryloxy) phenyl-1, 2-dioxetane, AMPPD)。充分混勻后，測定化學發光強度值至其穩定。結果如圖5所示。測得的化學發光強度值至70分鐘時達到穩定，GAPDH、GSTT1和 GSTMl基因延伸產物與空白對照的化學發光強度均值差值分別為871、10觀、1256，目標基因與內參基因化學發光強度均值差值的比值分別為1. 18 (GSTT1/GAPDH)和1.44 (GSTM1/ GAPDH)。重復三次獨立實驗，結果穩定，化學發光強度均值差值及其比值無顯著的批間差異，說明經過引物延伸反應能獲得待測模板中目標核酸片段的拷貝數信息、再經磁性介質分離后檢測延伸產物的化學發光強度值即能檢測模板中目標與內參核酸片段的含量，通過二者的比值即可計算得到待測模板與對照模板中目標核酸片段相對于內參核酸片段的變化，即檢測得到了目標核酸片段在待測模板中的拷貝數變化情況。
權利要求
1.基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法，其特征在于1)制備適合于獲取核酸序列拷貝數信息的磁性介質；2)設計能與目標核酸序列特異性結合的引物與探針，探針5’端的修飾對應1)所述磁性介質上所修飾之功能化基團，之后以產物捕獲方式獲取目標核酸片段的拷貝數信息，產物捕獲方式指先進行引物延伸反應，再利用磁性介質表面連接的特異性探針與延伸反應產物之間的堿基互補配對捕獲延伸得到的核酸片段；3)根據引物設計數據確定Tm值，根據Tm值確定退火溫度，加入雜交緩沖溶液，經過變性與退火過程，使引物與變性成單鏈的DNA模板充分結合；4)加入延伸反應緩沖溶液， 進行一個循環后結束反應，再加入已制備的連接有特異性探針的磁性介質與延伸產物進行雜交反應，從而捕獲目標核酸片段至磁性介質；5)磁分離，對磁性介質進行清洗，即得到獲取了待測模板中目標核酸片段拷貝數信息的磁性介質；6)對反映至磁性介質上的模板中的目標基因與內參基因核酸片段進行化學發光檢測，比較目標基因/內參基因核酸片段化學發光比值在待測模板與對照模板中的差異從而得到目標基因在待測模板中相對于對照模板中的拷貝數變化信息。
2.根據權利要求1所述基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法， 其特征在于所述磁性介質為體現磁學性質的物體。
3.根據權利要求2所述基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法， 其特征在于所述體現磁學性質的物體為具有磁學性質的物質構成的物體或以具有磁學性質的物質為部件的物體。
4.根據權利要求1所述基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法， 其特征在于所述延伸反應體系為常規使用的PCR緩沖體系，所使用的酶為普通的Taq DNA 聚合酶、Vent" DNA聚合酶或De印Vent_ DNA聚合酶。
5.一種基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法，其特征在于制備步驟為a.磁性顆粒制備，采用溶劑熱法制備直徑在300 nm的四氧化三鐵磁性顆粒稱取1.35 g的FeCl3 · 6H20、3. 6 g的醋酸鈉以及1. 0 g聚乙二醇溶解于40 mL乙二醇中，磁力攪拌溶解，形成黃褐色膠體；將膠體轉移至四氟乙烯反應釜，密封，置于200°C烘箱中反應8小時； 反應完成后以乙醇與去離子水清洗，烘干后得狗304磁性顆粒；用IOOmL 0. Imol鹽酸浸泡狗304磁性顆粒1小時，超聲分散30分鐘；再重新分散于體積濃度80%的乙醇中，以25°C、280 轉/分攪拌，同時加入200 μ L正硅酸乙酯，反應1小時；以乙醇、去離子水交叉洗滌；將顆粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化銨，超聲30分鐘，在25°C、 300轉/分條件下攪拌，同時加入1 mL正硅酸乙酯，反應3小時后，以乙醇、去離子水交叉洗滌數次，最后以乙醇分散，于4°C保存；制備得到核-殼結構的!^3O4OSiA復合顆粒；磁性納米顆粒的氨基化，將上述制得的!^3O4OSiO2復合納米磁性顆粒磁分離，加入至乙醇/水混合溶液中并超聲分散，然后將10 μ L APTS滴加到以上混合溶液中，并在室溫下振蕩攪拌7 小時，利用外加磁場將APTS修飾的磁性顆粒從反應介質中分離出來，用乙醇溶液對其清洗 5次，磁分離，再用二甲基甲酰胺清洗5次，最后以5 mg/mL的濃度分散于DMF中，待用；氨基化磁性納米顆粒的羧基化，取分散于DMF溶液中的氨基化Si02/Fe304磁性納米顆粒，濃度為5 mg/mL,逐滴加入到等體積丁二酸酐濃度為0. OOlM的DMF溶液中，室溫下反應M小時， 用水洗滌數次后磁分離，加入雙蒸水定容至10 mg/mL ；即得到功能性的羧基化磁珠；將上述羧基化磁珠用等體積2-N-嗎啉代乙磺酸水合物溶液反復清洗，磁分離，加入100 μ M以 MES溶液稀釋的氨基化探針至清洗過的磁珠中，混合均勻后室溫下旋轉孵育30分鐘，立刻加入冷的以MES溶液溶解的1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺至磁珠中混合均勻， 再以MES溶液補足體積至50 μ L，在4°C條件下旋轉孵育2小時，每20分鐘搖勻一次，磁分離后吸去上清，將磁珠于50 mM,pH 7.4 Tris溶液中孵育15分鐘以中和沒有反應的活化的羧基基團，再以50 mM，含0. 1 %wt Tween-20的Tris清洗磁珠，最后以溶于PBS中的BSA溶液封閉磁珠；即得到了連接有特異性探針的功能化磁珠；b.設計一對能與GAPDH、GSTTl與GSTMl基因特異性結合的引物與探針，探針5’端以氨基修飾，通過氨基-羧基相互反應將探針固定至磁性顆粒表面；c.延伸加入IOXBuffer 2 μ L、25 mM Mg2+ 2μ L,2. 5 mM dNTP 1.5 μ L、上下游引物各2. 5 μ L，DNA模板2. 5 μ L、DNA聚合酶0. 5 μ L，加去離子水補足體積至20 yL，將反應混合物置于PCR儀中；PCR參數94°C 5分鐘；95°C 30秒，54°C 30秒，72°C 1分鐘，1個循環；將得到的雙鏈延伸產物進行變性，通過堿基互補配對原則將變性后的單鏈延伸產物與連有特異性探針的磁性顆粒雜交，然后將連有單鏈DNA的磁性顆粒磁分離，進行清洗；從而得到反映了目標基因拷貝數信息的磁性介質；d.對反映至磁性介質上的模板中的目標基因與內參基因核酸片段進行化學發光檢測， 比較目標基因/內參基因核酸片段化學發光比值在待測模板與對照模板中的差異從而得到目標基因在待測模板中相對于對照模板中的拷貝數變化信息。
6.根據權利要求5所述的基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法，其特征在于所述磁性顆粒表面包被一層二氧化硅外殼。
7.根據權利要求5所述的基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法，其特征在于所述引物序列如下GAPDH GGAAGATGGTGATGGGATTT ；GSTTl GTCCCAGTTACCTCTCCGTCA ；GSTMl TCACTGGGGACACTCACAAA ；探針序列如下GAPDH: TCAAGGCTGAGAACGGGAAG ；GSTTl :AGCCTTGAAGGACGGGGACT ；GSTMl :TGGGCATGATCTGCTACAAT。
8.根據權利要求6所述的基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法，其特征在于所述包被方法為用100 mL 0. Imol鹽酸浸泡!^e3O4顆粒1小時，超聲分散 30分鐘；再重新分散于乙醇體積濃度80%的乙醇-水混合液中，以25°C、280轉/分攪拌， 同時加入200 μ L SiO2的正硅酸乙酯，反應1小時，以乙醇、去離子水交叉洗滌數次；將顆粒重新分散于100 mL乙醇中，加入1.0 g十六烷基三甲基溴化銨，超聲30分鐘，在 25°C、300轉/分條件下攪拌，同時加入1 mL正硅酸乙酯，反應3小時后，以乙醇、去離子水交叉洗滌數次，最后以乙醇分散，于4°C保存。
9.根據權利要求1或5所述基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法，其特征在于所述化學發光檢測為進行化學反應過程中檢測得到的光信號，所使用的化學發光體系包括魯米諾、光澤精、過氧化草酸酯、1，2_ 二氧雜環丁烷類、吖啶酯或三(2， 2’ -聯吡啶)釕(III )。
全文摘要
基于磁分離與引物延伸的化學發光檢測拷貝數多態性的方法，制備適合于獲取核酸序列拷貝數信息的磁性介質；設計能與目標核酸序列特異性結合的引物與探針；根據引物設計數據確定Tm值，使引物與變性成單鏈的DNA模板充分結合；加入延伸反應緩沖溶液，捕獲目標核酸片段至磁性介質；磁分離；對反映至磁性介質上的模板中的目標基因與內參基因核酸片段進行化學發光檢測，比較目標基因/內參基因核酸片段化學發光比值在待測模板與對照模板中的差異從而得到目標基因在待測模板中相對于對照模板中的拷貝數變化信息。
文檔編號C12Q1/68GK102358910SQ20111034379
公開日2012年2月22日 申請日期2011年11月3日 優先權日2011年11月3日
發明者何農躍, 曾新, 柳明 申請人:東南大學