專利名稱：一種atc消旋酶和編碼基因及其重組表達(dá)蛋白質(zhì)的應(yīng)用的制作方法
一種ATC消旋酶和編碼基因及其重組表達(dá)蛋白質(zhì)的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及來(lái)源于假單胞菌的一種ATC消旋酶的編碼基因， 以及重組蛋白質(zhì)的表達(dá)與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
ATC消旋酶(ATC racemase)是一種催化拆分DL-ATC (DL-2-氨基Δ 2_噻唑啉-4-羧酸，DL-2-amino-A2-thiazoline-4-carboxylic acid)生成 L_ATC(L_2-氨基厶2-噻唑啉-4-羧酸，1^-2-&11^110-八2-讓1&20111^-4-0&計(jì)0171化 acid)的酶。L-ATC 可作為底物，經(jīng)過(guò)以S-氨甲酰-L-半胱氨酸(S-carbamyl-L-cysteine, L-SCC)或N-氨甲酰-L-半胱氨酸(N-carbamyl-L-cysteine，L-NCC)為中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化途徑，生成終產(chǎn)物 L-半胱氨酸，所以ATC消旋酶也是參與酶法轉(zhuǎn)化DL-ATC生產(chǎn)L-半胱氨酸的重要成員之一， 具體過(guò)程參見附圖1。L-半胱氨酸(L-cysteine)是組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸之一，是一種α氨基酸， 它的存在可以保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，同一條或不同多肽鏈兩個(gè)L-半胱氨酸殘基間以二硫鍵(-S-S-)連接，使蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定的空間立體結(jié)構(gòu)。L-半胱氨酸在醫(yī)藥、食品、飼料、化妝品等行業(yè)具有廣泛的用途，日益受到重視。目前L-半胱氨酸的生產(chǎn)方法主要有毛發(fā)水解后還原法、化學(xué)合成法、發(fā)酵法和酶法合成法等。微生物為酶源，采用酶法制備氨基酸的技術(shù)有了快速的發(fā)展。微生物酶法具有特異性強(qiáng)、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、副反應(yīng)和副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。特別是近年來(lái)，以酶法合成替代難于用發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸，有了顯著的進(jìn)步。目前，有3種微生物酶法轉(zhuǎn)化合成L-半胱氨酸的工藝路線(1)以3-氯L-丙氨酸為前體物的L-半胱氨酸酶法合成；(2)以0-乙酰絲氨酸為前體物的酶法合成L-半胱氨酸；(3)以DL-ATC為前體物的酶法生產(chǎn)L-半胱氨酸。DL-ATC是以丙烯酸甲酯為前體物合成的化工產(chǎn)品。對(duì)以DL-ATC為前體酶法合成 L-半胱氨酸轉(zhuǎn)化途徑的研究最早開始于1979年，日本學(xué)者Sano提出了完成該轉(zhuǎn)化過(guò)程的兩種假設(shè)一種是以L-SCC為中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化途徑；另一種是以L-NCC為中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化途徑。Sano在研究嗜硫氮雜環(huán)戊烯假單胞菌AJ38M菌株時(shí)，以不能利用D-ATC但可利用L-ATC合成L-半胱氨酸的菌株I^seudomonas desmolytica AJ3872為對(duì)照菌株，二者細(xì)胞懸液中均加入DL-ATC為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AJ3872細(xì)胞對(duì)DL-ATC利用率不超過(guò)50%，而AJ38M細(xì)胞對(duì)DL-ATC的轉(zhuǎn)化率卻達(dá)到90%以上，由此證明了 AJ38M細(xì)胞中有 ATC消旋酶的存在，可催化從D-ATC到L-ATC的消旋化反應(yīng)。目前，有關(guān)酶法合成L-半胱氨酸相關(guān)酶系的報(bào)道不多。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的ATC消旋酶及其編碼基因，獲得活力較高的重組蛋白質(zhì)，并且這種ATC消旋酶可應(yīng)用于酶法拆分DL-ATC進(jìn)一步酶法生產(chǎn)L-半胱氨酸。
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本發(fā)明申請(qǐng)人從污泥中分離得到了一株新的假單胞菌I^seudomonas sp. QR-101， 于2011年10月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)CGMCC No. 5315，經(jīng)驗(yàn)證它進(jìn)行以L-NCC為中間產(chǎn)物的L-半胱氨酸合成代謝途徑，涉及ATC-消旋酶、L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶3個(gè)酶的協(xié)同催化作用。本發(fā)明提供的ATC消旋酶，來(lái)源于假單胞菌I^seudomonas sp. QR-101，是序列表中 SEQ ID No. 1的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID No. 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的缺失、替代或添加且具有與SEQ ID No. 1相同活性的由SEQ ID No. 1衍生的蛋白質(zhì)。序列表中SEQ ID No. 1的氨基酸殘基序列是由248個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的ATC消旋酶的編碼基因，是下列核苷酸序列之一序列表中SEQ ID No. 2的DNA序列，由744個(gè)堿基組成；編碼序列表中SEQ ID No. 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列。含本發(fā)明基因的表達(dá)載體及細(xì)胞體系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述的細(xì)胞體系為原核細(xì)胞體系。本發(fā)明重組ATC消旋酶蛋白可以通過(guò)以下方法獲得培養(yǎng)含有ATC消旋酶表達(dá)載體的宿主菌E. coli BL21/pET-21a(+)-atcA，該細(xì)胞體系為原核細(xì)胞體系，在所規(guī)定的蛋白質(zhì)表達(dá)條件下，獲得表達(dá)產(chǎn)物ATC消旋酶。本發(fā)明的ATC消旋酶及其編碼基因可在酶法拆分DL-ATC及進(jìn)一步微生物酶法生產(chǎn)L-半胱氨酸中應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明從一株假單胞菌中成功地克隆到一個(gè)新的ATC消旋酶基因并進(jìn)行了表達(dá)/ 重組酶的制備和轉(zhuǎn)化等研究，本發(fā)明涉及的ATC消旋酶的氨基酸序列通過(guò)GenBank Blast 發(fā)現(xiàn)，與來(lái)自 Pseudomonas sp. StrainBS 的 atcA (GenBank :BAD15357. 1)的同源性為 85%， 它們的核苷酸序列同源性為83%。利用高效表達(dá)ATC消旋酶的大腸桿菌E. coli BL21/ pET-21a (+) -atcA,催化拆分DL-ATC生成L-ATC，催化效率高，發(fā)酵成本低，且反應(yīng)液中成分單一，后續(xù)分離純化方便，生成的L-TAC可作為酶法生產(chǎn)L-半胱氨酸的底物，因此本發(fā)明在 L-半胱氨酸和L-胱氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)領(lǐng)域具有良好的產(chǎn)業(yè)化價(jià)值。

圖1 是酶法轉(zhuǎn)化DL-ATC合成L-半胱氨酸的代謝途徑示意圖；圖2 是I^seudomonas sp. QR-IOl的ATC消旋酶與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列ATC消旋酶 (GenBank :BAD15357. 1)的核苷酸序列比對(duì)。圖3 是重組質(zhì)粒pET-21a(+)/atCA的圖譜。圖4 是基因工程菌E. coliBL21/pET-21a(+)-atcA的酶切鑒定圖。其中泳 it M =DNAMarker 15000 ；泳道 1 =EcoR I 單酶切質(zhì)粒 pET_21a (+)-atcA (+)；泳道 2 =EcoR I 和Hind III雙酶切質(zhì)粒pET-21a(+)-atcA(+)；泳道3:EcoR I和HindIII雙酶切質(zhì)粒 pET-21a(+)；泳道4 以I^seudomonas sp. QR-IOl的基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物；以質(zhì)粒 pET-21a(+) -atcA 為模板的 PCR 產(chǎn)物。
圖 5:是基因工程菌 E. coli BL21/pET-21a(+)_atcA 表達(dá)蛋白的 SDS-PAGE 電泳圖。其中，泳道1 :Pseudomonas sp. QR-IOl ；泳道2 基因工程菌Ε. coli BL21/ pET-21a(+)-atcA ；泳道 3 :Ε· coli BL21/pET_21a(+)。圖6 重組ATC消旋酶活性的驗(yàn)證，其中A為不添加任何酶的D，L-ATC對(duì)照組，B為添加L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶組，C為添加重組ATC消旋酶、L-ATC水解酶和L-NCC 酰胺水解酶組，D為只添加重組ATC消旋酶組。
具體實(shí)施方式實(shí)施例1ATC消旋酶的克隆及一級(jí)結(jié)構(gòu)特征本發(fā)明人從假單胞菌I^seudomonas sp. QR-101中提取基因組DNA，然后用Hind III酶切基因組DNA，用膠回收試劑盒從1. 2%的瓊脂糖凝膠上分別回收2-91Λ的HindIII 酶切片段，將回收的酶切片段連接在經(jīng)相同酶切處理的PUC18載體上，轉(zhuǎn)入E. coli JM109 中，在涂有X-gal和IPTG的平板上進(jìn)行藍(lán)白初篩。將含有插入片段的重組白色單菌落，分別挑入每孔含50 μ L LB培養(yǎng)基，37°C過(guò)夜培養(yǎng)后，加入100 μ L0. 6% D，L-ATC作為底物，同時(shí)加入L-ATC水解酶(其基因序列見序列表SEQ ID No. 3)和L-NCC酰胺水解酶(其基因序列見序列表SEQ ID No. 4)各0. 5U，于 35°C振蕩30min，分別加入150 μ L酸性茚三酮試劑(稱取250mg茚三酮，溶于6mL乙酸和 4mL濃鹽酸的混合液中)進(jìn)行顯色反應(yīng)，以不加培養(yǎng)液的空白作為對(duì)照。通過(guò)微孔板復(fù)篩較高活性的重組子，并抽提質(zhì)粒，然后進(jìn)行DNA序列測(cè)定，結(jié)果顯示陽(yáng)性重組子PU025中含有插入片段為4539bp，在其中位于335-1078bp間有一個(gè)完整的讀碼框，為744bp(SEQ ID No. 2)，G+C含量為60. 48 %，編碼M8aa，其計(jì)算分子量為 26. 22kD。將該 DNA 序列通過(guò) GenBankBlast 發(fā)現(xiàn)，與來(lái)自 Pseudomonas sp. StrainBS 的 atcA(GenBank :BAD15357. 1)的同源性為85%，它們的核苷酸序列同源性為83%。因此，本發(fā)明的ATC消旋酶基因序列不同于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的類似酶的序列，它是一個(gè)新基因。實(shí)施例2大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建及重組ATC消旋酶的表達(dá)根據(jù)測(cè)序結(jié)果，按照該蛋白質(zhì)編碼基因的兩末端序列設(shè)計(jì)引物Pl和P2，其中上游 Pl :5，-CCGGAA TTC ATG AAG CAT CAT CAG ACG GGC AT-3，含有 EcoR I 酶切位點(diǎn)；下游引物 P2 :5，-CCC AAGCTT CTA GCC CAA CAG TTT TCC CAGGC-3，含有 HindIII 酶切位點(diǎn)。以菌株I^seudomonas sp. QR-IOl的基因組為模板，按如下PCR程序進(jìn)行DNA擴(kuò)增94°C變性lmin，66°C復(fù)性lmin，72°C延伸Imin，擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切后，連接到經(jīng)相同酶切后的載體 pET-21a(+)，構(gòu)建重組子 pET21-a(+) /atcA。獲得的重組子pET-21a(+)/atCA采用&(12法轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)鑒定后獲得BL21 (pET-21a(+)/atcA)工程菌。將BL21(pET_21a(+)/atcA)工程菌于37°C活化過(guò)夜，按1 100轉(zhuǎn)接到IOOmL含 100μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；加入終濃度為ImM的IPTG， 37°C繼續(xù)培養(yǎng)池；4°C，6，000r/min離心lOmin，收集菌體，加入0. lmol/L磷酸鉀緩沖液(pH8.0)懸浮洗滌后，6，000r/min離心lOmin，收集菌體，重復(fù)洗滌一次，加入磷酸鉀緩沖液制成酶源細(xì)胞懸液。實(shí)施例3重組ATC消旋酶活性的驗(yàn)證取實(shí)施例2中的酶源細(xì)胞懸液，調(diào)整終濃度至20g/L，于5mL反應(yīng)管中，依次加入 3mL 0. 5%的底物DL-ATC和1. 5mL的混合酶液，其中，各組中混合酶液的成分如表1示。表一混合酶液的成分
組號(hào)重組ATC消 Si源顏胞 (20級(jí))LATC水編 (100U/mL)I^NCC EIM^SI (100U/mL)0.1mol/L 緩賺 (pH8.0)A(對(duì)照)0001.5 mlB00.5 mL0.5 mL0.5 mLC0.SmL0.5 mL05 mL0D0.5 mL001.0 mL35°C水浴池，各個(gè)反應(yīng)液冷凍干燥，然后溶解于300 μ L異丙醇中，采用高效液相色譜方法測(cè)定其中D-ATC和L-ATC的含量。高效液相色譜采用CHIRALPAK IC 柱(0. 46cm I. D. X 25cm L) (Daicel chiral technologies CO.，LTD.，Sianghai，CHINA)，該液相條件為紫外檢測(cè)器 SPD-10A，檢測(cè)波長(zhǎng)是220nm，流動(dòng)相為正己烷-異丙醇(85 15)，含0. 2 %三氟乙酸和0. 1 %二乙胺，室溫條件下分析，進(jìn)樣量為10 μ L。結(jié)果如圖6所示，D-ATC和L-ATC的保留時(shí)間分別為11. Omin和18. 5min。在不添加任何酶的對(duì)照組中，D-ATC和L-ATC的含量各占約50%，且隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，濃度不變 (圖6A).當(dāng)反應(yīng)液中同時(shí)加入L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶時(shí)，因?yàn)長(zhǎng)-ATC作為底物能被L-ATC水解酶作用，生成的中間產(chǎn)物L(fēng)-NCC又在L-NCC酰胺水解酶的作用下生成L-半胱氨酸，所以，最終反應(yīng)液中L-ATC的濃度下降至12%，但由于沒(méi)有ATC消旋酶的作用，因此 D-ATC的濃度不變(圖6B)。當(dāng)反應(yīng)液中同時(shí)加入重組ATC消旋酶、L-ATC水解酶和L-NCC 酰胺水解酶酶源細(xì)胞時(shí)(C組)，在L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶的作用下，L-ATC被轉(zhuǎn)化生成L-半胱氨酸，隨著L-ATC的濃度下降，打破了 L-ATC與D-ATC各占50%的比例，因此在ATC消旋酶的作用下，隨著L-ATC的消耗，D-ATC也被消旋生成L-ATC，最終反應(yīng)液中 L-ATC和D-ATC的濃度都下降，二者比例仍為1 1(圖6C)。但是，在只加入ATC消旋酶的 D組中，二者的消旋反應(yīng)處于動(dòng)態(tài)平衡，且L-ATC沒(méi)有被轉(zhuǎn)化消耗，因此D-ATC不被催化生成L-ATC，L-ATC和D-ATC的濃度均未發(fā)生變化(圖6D)。綜上可以說(shuō)明，當(dāng)L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶作用于L-ATC生成L-半胱氨酸時(shí)，由于L-ATC被消耗，重組的ATC消旋酶發(fā)揮活性，可催化消旋D-ATC生成L-ATC，生成的L-ATC繼而被繼續(xù)催化最終生成L-半胱氨酸。因此，重組表達(dá)的ATC消旋酶可用于微生物酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-半胱氨酸，有效提高 DL-ATC的利用率。實(shí)施例4以重組大腸桿菌的發(fā)酵菌體為ATC消旋酶酶源，轉(zhuǎn)化DL-ATC生產(chǎn)L-半胱氨酸①反應(yīng)體系組成底物10g/L的 DL-ATC
反應(yīng)溫度;35°CPH 8. 0ATC消旋酶酶源4g/L
L-ATC 水解酶1000U/LL-NCC 酰胺水解酶1000U/L②轉(zhuǎn)化率在上述條件下，反應(yīng)體積為3L，35°C反應(yīng)池后，底物轉(zhuǎn)化率約為81%。
權(quán)利要求
1.一種ATC消旋酶，其特征在于，是序列表中SEQ ID No. 1氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID No. 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的缺失、替代或添加且具有與SEQ ID No. 1相同活性的由SEQ ID No. 1衍生的蛋白質(zhì)。
2.—種權(quán)利要求1所述的ATC消旋酶的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)是序列表SEQID No. 2的核苷酸序列；2)編碼序列表中的SEQID No. 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列。
3.一種含有權(quán)利要求2所述基因的表達(dá)載體。
4.一種含有權(quán)利要求2所述基因的細(xì)胞體系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因的細(xì)胞體系，其特征在于，所述的細(xì)胞體系為原核細(xì)胞系統(tǒng)。
6.權(quán)利要求1所述的ATC消旋酶在微生物酶法生產(chǎn)L-半胱氨酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種ATC消旋酶和編碼基因序列及其重組表達(dá)蛋白質(zhì)的制備及應(yīng)用。本發(fā)明所提供的來(lái)源于假單胞菌(保藏號(hào)CGMCC No.5315)的ATC消旋酶是序列表中SEQIDNo.1的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID No.1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的替代、缺失或添加具有與SEQ ID No.1相同活性的由SEQ ID No.1衍生的蛋白質(zhì)。編碼基因序列是序列表中SEQ ID No.2的核苷酸序列。本發(fā)明將來(lái)源于假單胞菌ATC消旋酶基因克隆并表達(dá)制備重組酶，可用于生物法將DL-ATC催化拆分成L-ATC，生成的L-ATC作為底物，可用于酶法生產(chǎn)L-半胱氨酸。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102417900SQ20111036509
公開日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者劉磊, 姚瑞娟, 張奇, 段靜靜, 王文芳, 高智慧 申請(qǐng)人:南開大學(xué), 天津啟仁醫(yī)藥科技有限公司